UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DQMC BIOQUÍMICA BIO0001 Cinética Enzimática Prof Karine P. Naidek Novembro/2016
Cinética das Reações Bioquímicas As células vivas dos organismos heterotróficos e dos organismos autotróficos (na ausência de luz) obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação dos substratos de reserva a CO 2 e água. Esse conjunto de reações, assim como, as reações de síntese das macromoléculas, só é possível devido à intervenção dos catalisadores bioquímicos as enzimas. Todas as enzimas são proteínas globulares e catalisadores eficientes.
Catalisadores Energia de ativação necessária para iniciar um processo químico pode ser fornecida pela elevação da temperatura que aumente a agitação molecular. Em Bioquímica, a temperatura dos sistemas não pode ultrapassar os valores compatíveis com a vida dos organismos (aquecimento desnaturação das proteínas). Catalisadores bioquímicos função de baixar a energia de ativação necessária à reação e permitir que a reação ocorra em velocidade muito mais elevada.
Centro ativo ou sítio ativo É constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato. Compreende o local de fixação: que se combina com o substrato por ligações fracas; e o centro catalítico: que atua sobre o substrato levando-o a sofrer a reação química. A conformação do local e fixação se modifica em consequência da ligação ao substrato substrato induz a alteração da conformação. Nas enzimas que atuam através de um cofator (metal; grupo prostético ou coenzima), essa estrutura se encontra ligada na vizinhança do centro catalítico.
Velocidade da Reação enzimática A velocidade de uma reação enzimática é, em geral, obtida pela medida da quantidade de produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo. S = substrato; E = enzima; P = produto Até certo ponto da reação, a variação é linear. É vantajoso medir a velocidade no início da reação, quando pouco substrato foi transformado e a velocidade inversa é desprezível. A inclinação é então máxima, o que permite ter a velocidade inicial da reação.
Velocidade da Reação enzimática A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima
Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática Temperatura A velocidade da maioria das reações químicas aumenta quando a temperatura aumenta. Moléculas se movem mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas temperaturas e, portanto, muitas podem não ter energia suficiente para promover a reação química. Para as reações enzimáticas, entretanto, elevações além de certa temperatura reduz drasticamente a velocidade de reação. A temperatura ótima para a maioria das enzimas se situa entre 35 e 40ºC. A redução da velocidade de reação acima da temperatura ótima é devida à desnaturação das enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura tridimensional característica. A desnaturação de uma proteína envolve o rompimento de ligações de hidrogênio e outras ligações não covalentes.
ph Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática A maioria das enzimas tem um ph ótimo no qual sua atividade é máxima. Acima ou abaixo deste valor de ph a atividade enzimática, e portanto a velocidade de reação, diminui. Quando a concentração de H + (ph) no meio é drasticamente alterada, a estrutura tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração de ácidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H+ (ou OH-) compete com o hidrogênio nas pontes de hidrogênio e ligações iônicas presentes na estrutura da enzima, resultando na sua desnaturação.
Fatores que Influenciam a Atividade Concentração de Substrato Enzimática Existe uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação específica. Apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta taxa máxima pode ser alcançada. Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está em saturação, isto é, seus sítios ativos estão todos ocupados por moléculas de substrato ou produto. Nesta condição, um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação porque todos os sítios ativos já estarão sendo utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não estão saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de enzima poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reação é influenciada pela concentração de substrato.
Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática Inibidores Uma forma efetiva de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo, é controlar suas enzimas. Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser considerada como inibidor.
Cinética Enzimática Na reação enzimática se forma um complexo transitório entre enzima e substrato. A reação catalisada enzimaticamente se processa em duas etapas: * A enzima se liga reversivelmente ao substrato formando um complexo enzima-substrato (ES) * O produto é liberado e a enzima volta à forma livre podendo, então, se ligar a outra molécula de substrato.
Cinética Enzimática O estudo das reações enzimáticas se baseia em medidas de velocidade da reação catalisada. Velocidade de uma reação quantidade de produto formado em um tempo determinado. Velocidade inicial de uma reação medida em tempos suficientemente curtos para que no máximo 5% do substrato sejam transformados em produto. Em uma reação enzimática típica, a 1ª fase ocorre a velocidades muito maiores do que a 2ª fase. Equações de velocidade para estas fases são:
Cinética Enzimática A medida real da velocidade da reação, ou seja, a medida da velocidade de formação do produto é igual a v 3, que é a etapa mais lenta e limitante do processo. Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, normalmente, muito menor que a concentração de substrato. Um equilíbrio entre E, S e ES (com concentrações definidas e constantes de cada espécie) se estabelece muito rapidamente. Tendo ocorrido a formação de ES, se inicia a segunda parte da reação enzimática, aquela que efetivamente forma o produto, com uma velocidade proporcional à concentração de ES. O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não provoca diminuição da sua concentração, uma vez que há excesso de substrato para se combinar com a enzima liberada quando se forma o produto. Esta situação se mantém por algum tempo (tempo inicial): contínua formação do produto e concentrações estáveis de ES e S. A pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significativa, face ao seu grande excesso.
Cinética Enzimática À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as velocidades de formação do produto se tornarão cada vez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa existirá cada vez mais complexo ES. Nestas condições haverá a maior concentração possível do complexo ES; a reação será processada na máxima velocidade possível. Existirá uma determinada concentração de substrato que provocará a formação de uma concentração de ES igual à metade da máxima possível. Nestas condições, a velocidade será, naturalmente, a metade da maior velocidade possível. Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou Km.
Teoria de Michaelis-Menten Propostas A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato (ES) A fase mais lenta é a formação de produto (P) Há excesso de substrato (S) Todas as determinações de produto (P) são feitas no início da reação quando a velocidade de formação do complexo enzimasubstrato (ES) a partir de enzima (E) + produto (P) é muito pequena e pode ser desprezada velocidades iniciais
Teoria de Michaelis- Menten Cinética de Michaelis Menten Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato e a velocidade de reação; As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala de concentrações de substrato [S]); a velocidade de reação (v), aumenta com o acréscimo de [S]. A medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax.
Teoria de Michaelis-Menten A saturação acontece porque, à medida que é aumentada a concentração de substrato, aumenta também a quantidade de enzima presente sob a forma de complexo enzima-substrato (ES). À velocidade máxima, Vmax, todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato e a concentração de complexo ES é igual à concentração de enzima.
Teoria de Michaelis-Menten A atividade de uma enzima é geralmente descrita através de V max e também da constante de Michaelis-Menten (K M ), que representa a concentração de substrato à qual se detecta uma velocidade de reação igual a metade de V max ; Cada enzima possui um K M característico (k cat ) para um dado substrato; este parâmetro é muitas vezes usado para demonstrar a força de ligação de um substrato à enzima. É também usada outra constante cinética, k cat, para descrever o comportamento de uma enzima, representando o número de moléculas de substrato que podem ser catalisadas por centro ativo por segundo.
Teoria de Michaelis-Menten No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reação com um substrato existe uma reação bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reação unimolecular ES E + P possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k 2. v = k 2 [ES] k 2 também é o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas por segundo.
Teoria de Michaelis-Menten Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E], mudando o equilíbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reação depende da concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S]; Altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condições, a velocidade (v k 2 [E] tot =V max ) é insensível a pequenas alterações de [S]; assim, [E] tot é a concentração total enzimática [E] tot = [E] + [ES] que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação
Teoria de Michaelis-Menten A equação de Michaelis Menten descreve como a velocidade de reação v depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k 2. Michaelis e Menten mostraram que se k 2 for bem menor que k -1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-se a seguinte equação: A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é metade de V max. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.
Teoria de Michaelis-Menten A situação mais normal dá-se quando k 2 > k -1 na por vezes chamada cinética de Briggs-Haldane. A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação ao estado estacionário. Durante o período inicial, a velocidade de reação v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante: A concentração de [ES] é dada por: em que a constante de Michaelis Km é definida por
Por que determinar K m? K m estabelece o valor aproximado para o nível de substrato intracelular. [S] intracelular << K m v seria muito sensível a variações de S (1ª ordem) e o poder catalítico da enzima seria desperdiçado, pois v << Vmax. [S] intracelular >> K m não há sentido fisiológico pois v não pode exceder V max. Quando [S] >> Km; v se torna insensível a variações de S. Km é específico para uma dada enzima. Serve de meio de comparação entre enzimas extraídas de diferentes fontes, mas que catalisam a mesma reação. Pode-se determinar se duas enzimas são idênticas ou se são proteínas diferentes que catalisam a mesma reação.
Por que determinar K m? Variação no valor de K m induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade de uma enzima. Se K m determinada in vitro for diferente da determinada em condições fisiológicas, isto pode indicar a falta de um efetor. Vários efetores podem ser testados para a identificação de quais atuam como inibidores ou ativadores. Conhecendo-se o valor de Km pode-se determinar V max que é função da [E] total Utilizando [S] >> K m determina-se V max. Km indica a adequacidade relativa de substratos a uma enzima. Quando mais baixo o valor de Km maior a afinidade do substrato com a enzima.
Método gráfico
Inibição Enzimática
Inibição Enzimática Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos: Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática; classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas K m e V max. Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos. Irreversíveis: quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima. Geralmente produzem modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima. Estas reações decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis. Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao inibidor.