Objectivo: Separar uma proteína das restantes no extracto celular Estratégia: Existem inúmeras técnicas de purificação disponíveis. O procedimento exacto e a ordem dos métodos a aplicar dependem do tipo de proteína e empregam-se de acordo com as características da mesma No Início de uma Purificação... Temos células animais, de plantas, ou microbianas Torna-se necessário: -Partir as Células: Fraccionamento Celular -Separar o Extracto: Centrifugação -Obter a Fracção Solúvel (onde se encontram as proteínas)
Dependendo do tipo de tecido ou célula temos : Métodos / Técnicas aplicadas Suaves Moderados Vigorosos Exemplos Químicos Detergentes Culturas de células Bioquímicos Lise enzimática Tecidos Vegetais Cél. bacterianas Fungos Físicos / Mecânicos 1 - Choque osmótico 2 - Arrefecimento / Aquecimento 3 - Potter - Elvjehem Homogeneização por lâminas 1 - French - Press 2 - Ultra-sons 3 - Moinho de esferas 4 - Homogeneizador de Manton-Gaulin Exemplos 1 - Lise de células sanguíneas e culturas de células 3 - Fígado Células e tecidos animais e vegetais Suspensões celulares e microorganismos com parede celular
Alguns exemplos de técnicas de desintegração:
Centrifugação Diferencial : Centrifugação do material a separar a velocidades crescentes. Centrifugação em Gradiente de Densidade : (meio suporte em gradiente de densidade) Centrifugação de Fluxo Contínuo : 1ª-fracção: Nuclear 2ª- fracção: Mitocondrial 3ª- fracção: Microssomal / Sobrenadante Citosólica Isopicníca - gradiente de densidade abrange as densidades das partículas a separar. Amostra adicionada a gradiente formado ou a formar. Por Zonas de Velocidade - gradiente de densidade menos denso que partícula menos densa. Amostra adicionada no topo de gradiente formado. mistura de partículas introduzida continuamente no rotor em movimento. Partículas sólidas depositam-se na parede do rotor e líquido livre de resíduos abandona o rotor.
Separação pelo Tamanho: Diálise usada para remover o excesso de sal ou mudar o tampão de uma proteína. Moléculas grandes não atravessam a membrana Moléculas pequenas atravessam membrana Membrana semipermeável Atenção. Não separa proteínas!
Princípio da Cromatografia: Separação de moléculas baseada nas suas mobilidades relativas através de uma matriz. diferentes interacções com a matriz. Interacções com base em propriedades físico/químicas das proteínas Tamanho Filtração em Gel Carga Troca Iónica Hidrofobicidade Interacção Hidrofóbica Especificidade para uma biomolécula Cromatografia de Afinidade
Separação pelo Tamanho: Filtração em Gel Esferas da resina com poros nas quais partículas pequenas podem entrar e as grandes não podem entrar. A coluna deverá possuir a distância necessária para uma boa separação Proteínas eluídas por ordem decrescente de tamanho
Separação pela Carga: Cromatografia de Troca Iónica Questões a Colocar antes da Separação por Carga Qual é o Ponto Isoeléctrico da Proteína? Qual é o ph do Tampão? ph > pi proteína carregada negativamente ph < pi proteína carregada positivamente Proteína Desprotonada Proteína Protonada A Matriz da Coluna (resina) é um polímero contendo grupos ligados carregados Se se pretende agarrar uma proteína a uma resina de troca iónica,, esta deve possuir sinal contrário à carga global da proteína alvo mas grupos ligados - contra-iões iões- do mesmo sinal
Separação pela Carga: Cromatografia de Troca Iónica Troca Catiónica resinas apresentam cargas negativas e ligam proteínas com carga global positiva. Troca Aniónica resinas apresentam cargas positivas e ligam proteínas com carga global negativa. Proteínas eluídas da coluna de troca iónica por por alteração da afinidade por: 1 Aumento da Força Iónica (= aumento da concentração de iões de um sal) Ex: iões Na + competem com os grupos da proteína carregados positivamente para a ligação na resina 2 Alterando o ph (provoca a variação da carga global da proteína)
Separação pela Carga: Cromatografia de Troca Iónica Proteínas baixa afinidade para a resina movem-se rapidamente, através da coluna. Proteínas elevada afinidade para a resina eluídas lavando a coluna com um tampão de maior força iónica ou com um ph.
Separação por Afinidade: Cromatografia de Afinidade Não tem em conta propriedades físicas ou químicas especificidade biológica Permite num só passo purificar uma proteína/enzima de uma mistura complexa. Princípio da Separação: Ligando imobilizado na matriz/resina ao qual se liga a proteína de que o ligando é substrato. Ligando Braço espaçador Matrix
Princípio da Electroforese: Estudo do movimento de partículas carregadas sob acção de um campo eléctrico Partícula migra na direcção do eléctrodo de carga oposta Migração depende: Carga, Tamanho e forma Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE) Condições nativas: Proteína pura? Condições desnaturantes: MM? sub-unidades? separação só pelo tamanho (razão carga/massa cte) devido ao SDS atribui carga global negativa constante
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE) Padrões Amostra mobilidade moléculas pequenas > moléculas grandes Cálculo da massa molecular
Focagem Isoeléctrica ou Isoelectrofocagem Mobilidade de compostos em função do ph Carga da proteína depende : Ponto isoeléctrico (pi), ph meio ph meio Abaixo pi Carga +move-se para Cátodo (-) Igual pi Carga global Zero Acima pi Carga - move-se para Ânodo (+) Separa proteínas e determina pi numa só corrida Gradiente de ph : anfólitos