Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Bioquímica I Cromatografia em Camada Fina dos Lípidos do Leite Apresentação de Resultados Turma 6 2010/2011
Objectivos Análise da composição lipídica do leite através de uma técnica de afinidade: cromatografia de camada fina. Explicar a separação por TLC de cada um dos componentes lipídicos de acordo com a sua estrutura.
Composição química do leite Fonte valiosa de elementos nutritivos Proteínas (3,4%) Cálcio Sais minerais Vitaminas LÍPIDOS (4%) Glúcidos (lactose) Importante durante: Adolescência e infância Gravidez Exercício físico
Composição física do leite Emulsão (atendendo ao componente lipídico) Leite Solução coloidal (relativamente ao conteúdo proteico) Solução verdadeira (relativamente ao conteúdo em glúcidos, vitaminas hidrossoluvéis e sais minerais)
Lípidos Ésteres ou amidas de ácidos gordos Insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos (clorofórmio, éter, benzeno, ) No leite. Triglicerídeos Fosfolípidos Reserva nutritiva. AG saturados & baixo teor em AG polinsaturados Elementos estruturais (Fosfatidiletanolamina) Estabilizadores da fracção lipídica (Fosfatidilcolina) Esteróis Colesterol
Cromatografia em camada fina É uma técnica de separação de biomoléculas pertencentes ao grupo das chamadas técnicas de afinidade Envolve duas fases: 1) Estacionária (matriz) Imóvel durante a separação Suporte sólido (lâmina de vidro) revestido por uma camada fina de sílica gel (muito polar) 2) Móvel Mistura de solventes dos componentes existentes na amostra Deve ter afinidade suficiente para os componentes a separar, para os poder arrastar ao longo da outra fase.
Como se faz a separação pelas duas fases? Os vários componentes repartem-se pelas duas fases de acordo com as suas afinidades de: Carga Polaridade Solubilidade Interacções: 1. Covalente 2. Electrostáticas
Procedimento Placa Origem ------------- ------------- Solvente B: Rf= w/y C: Rf= x/y Aplicação da amostra ------------- C B ------------- x w Detecção dos componentes Cálculo de Rf (ratio of fronts) y Colocação da placa na câmara ------------- Cromatografia Frente do Solvente Movimento do solvente por capilaridade
Cromatografia de lípidos Os lípidos podem dividir-se em 2 grupos, consoante o seu grau de insolubilidade na água: Lípidos apolares (neutros) Insolúveis em água e solúveis em solventes apolares. ex: ácidos gordos, acilglicerídeos, colesterídeos Lípidos polares ex: colesterol, glicerofosfolípidos e esfingolípidos
Cromatografia de lípidos Os componentes da fracção lipídica são depois identificados por coloração especial: -Iodo (todos os lípidos) - Ninhidrina (aminolípidos, i.e. com grupos amínicos livres) - Molibdénio (fosfolípidos) Tina de cromatografia Tampa Papel de Filtro Placa Solvente
Extracção de lípidos O leite apresenta uma composição complexa e, sendo o objectivo desta aula prática a análise da composição da fracção lipídica do leite, recorreu-se à extracção dos lípidos da amostra. Método de Reed Método de separação de fases, usando as características de solubilidade dos lípidos da mistura (leite)
Extracção de lípidos Os lípidos geralmente são menos polares do que outros constituintes da amostra por isso podem ser selectivamente extraídos usando solventes orgânicos como: Clorofórmio (CHCl 3 ) - praticamente apolar Metanol (CH 3 OH) - polar Permite a dissociação de complexos lípido/proteína. Precipita proteínas, mas pode dissolver componentes não lipídicos da amostra.
Extracção do Lípido Total Amostra (+/- 20mg proteína num volume de 2ml) + 10 ml de metanol + 10 ml de clorofórmio Agitação 5 min Centrifugação a 3000 rpm/5min S1 (decantar para Erlenmeyer de 200 ml) P1 + 10 ml de metanol + 10 ml de clorofórmio S1+S2 (volume x) + x/2 ml de clorofórmio + x/2 ml de água + KCl 50mM S2 Agitação 5 min Centrifugação a 3000 rpm/5min P2 Agitação violenta Centrifugação a 3000 rpm/10 min 2 fases -Remover fase inferior (de clorofórmio) Extracto Lipídico
Actividade Experimental
Materiais e Reagentes MATERIAL: - 6 placas de cromatografia cortada - 2 tinas de cromatografia - papel de filtro para forrar o interior das tinas de cromatografia -1 proveta de 100 ml - 2 micropipetas e respectivas pontas - frascos de spray; -secador; - régua; - lápis. REAGENTES: - extracto lipídico -iodo em cristais, - Reagente de ninhidrina - Corante de fosfolípidos - Padrões (fosfatidilcolina; fosfatidiletanolamina; mistura de triglicerídeos e colesterol) - Solventes (clorofórmio (CHCl3) + metanol (CH3OH) + água (H2O), nas proporções de 65: 25: 4 (v/ v); hexano (C6H6) + éter dietílico (C4H10O) + ácido acético (CH3COOH), nas proporções de 90: 10: 1 (v/v))
Procedimentos Activação das placas (desidratação da sílica) numa estufa a 120º durante 20 minutos Marcação a 1 cm do fundo da placa do local de aplicação da amostra e padrões (PC - fosfatidilcolina; PE - fosfatidiletanolamina; Col colesterol; TG - mistura de triglicerídeos) Aplicar 20μl das amostras e 5 μl dos padrões gota a gota, secando com o secador após cada gota Placas A, C e E Colocar placa em tina de cromatografia contendo Placas B, D e F Solvente I: clorofórmio+metanol+água Solvente II: Hexano+ éter dietílico + ácido acético (65:25:4 v/v) (90:10:1 v/v) (Mistura abaixo do ponto de aplicação das amostras e padrões) Tapar a tina e deixar o solvente subir nas placas Retirar placa, deixar secar ao ar e colocar coloração Placas C e D Molibdénio (pulverizar as placas com solução de molibdénio em ácido sulfúrico) Placas E e F Ninhidrina (pulverizar placas com ninhidrina e deixar 2-3 min em estufa para ocorrer revelação Placas A e B Iodo (as placas são colocadas numa tina com cristais de iodo)
Resultados - Iodo Placa A Solvente I Placa B Solvente II
Resultados - Molibdénio Placa C Solvente I Placa D Solvente II
Resultados - Ninhidrina Placa E Solvente I Placa F Solvente II
Discussão No início da experiência procede-se à activação das placas, isto é, à remoção da água contida na sílica (desidratação da sílica), para que a polaridade das moléculas de água não afecte a migração dos componentes da amostra e dos padrões. A amostra utilizada é o extracto lipídico do leite, separado por um método de separação de fases método de Reed. Os padrões e a amostra lipídica encontram-se dissolvidos em clorofórmio, pelo que é necessário evaporá-lo com o secador, antes de mergulhar a placa na tina de cromatografia. O nível de solvente deve estar abaixo do ponto de aplicação da amostra e dos padrões, pois, caso contrário, não ocorreria migração na placa. A subida do solvente na placa, dentro da tina, deve ser controlada de modo a que os padrões e componentes da amostra não ultrapassem o bordo superior da placa.
Discussão Os solventes utilizados são misturas de solventes polares e apolares, de modo a terem afinidade para os dois tipos de lípidos. Os solventes polares conferem afinidade suficiente para arrastar fosfolípidos pela placa. O solvente I tem maior polaridade e o solvente II é mais apolar. A polaridade dos solventes influencia a migração dos lípidos: - Os lípidos polares ligam-se fortemente à matriz (que é extremamente polar), ficando mais perto do ponto de aplicação visível, por exemplo, na placa D; - Os lípidos apolares migram ao longo da placa, ligam-se fracamente à matriz.
Discussão Usando lípidos padrão, é possível identificar alguns dos componentes lipídicos da amostra de leite, conforme o componente se situa na mesma linha horizontal que o lípido padrão. Fazendo uma análise de cima para baixo identificou-se: Placa A: PC, PE e Col; a mancha superior e de maior dimensão poderia também indicar TG. Placa B: PC, PE e Col e da mancha de maior dimensão sabe-se que são lípidos apolares. Placa A Solvente I PC PE Col TG A 5 4 3 2 1 Placa B Solvente II PC PE Col TG A 5 4 3 2 1
Discussão Placa C: PE e PC Placa D: PE e PC Placa C Solvente I Placa D Solvente II PC PE Col TG A 5 4 3 2 1 PC PE Col TG A 5 4 3 2 1
Discussão Placa E Solvente I Placa F Solvente II PC PE Col TG A 5 4 3 2 1 PC PE Col TG A 5 4 3 2 1 Placa E: PE, a outra mancha poderá ser a fosfotidilserina, visto que o corante Ninhidrina cora aminolipídos. Placa F: PE Como crítica aos resultados, e sabendo que os triglicerídeos são mais abundantes no leite, deduz-se que a amostra padrão TG utilizada não se encontrava viável, pois os triglicerídeos não foram identificados na maioria das placas. A amostra padrão de Col continha impurezas, pois nas placas E e F ficou corada de rosa; rosa é a coloração da ninhidrina para lípidos com grupos amina livres, o que não é o caso do colesterol.
Conclusão Com a técnica de cromatografia de camada fina separaram-se os componentes lípídicos do leite. Através da sua posição, relativamente às amostras padrão, foi possível identificálos. No entanto, a técnica apresenta algumas limitações, nomeadamente a presença de impurezas nas amostras padrão e as afinidades semelhantes entre alguns componentes lipídicos do leite, o que dificulta a correcta separação e a identificação..
Bibliografia Berg J. M., Tymoczko J. L. and Stryer L. : Biochemistry. 5th. Ed. International Edition. W. H. Freeman and Company. NewYork. 2002. Protocolo experimental da 3ª aula prática de Bioquímica I