Clonagem e caracterização molecular do gene eif4e em tomate (Solanum

Clonagem e caracterização molecular do gene eif4e em tomate (Solanum habrochaites f. glabratum) Marcelo Oliveira Soares 1, Larissa Goulart Zanardo 1, Cesar Augusto Diniz Xavier 1 Derly José Henriques da Silva 1, Francisco Murilo Zerbini 1 1Universidade Federal de Viçosa (UFV), Campus UFV, 36570-000, Viçosa MG, marcelosoares2001@gmail.com, derly@ufv.br, zerbini@ufv.br, larissa_zanardo@yahoo.com.br. RESUMO Viroses como Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) constituem grande problema na produção de tomate e pimentão no Brasil, sendo necessária a identificação de genes relacionados a resistencia genética para diminuição destas perdas agrícolas. Estudos têm mostrado que uma mutação natural do fator de iniciação da tradução de eucarióticos eif4e e sua isoforma eif(iso)4e leva a uma resistência genética recessiva ao vírus, por meio da falta ou mesmo diminuição da multiplicação viral em nível celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o gene eif4e encontrado em tomate silvestre BGH-6902 em relação ao genótipo suscetível Santa Clara. Para isso, cdna codificando o eif4e em tomate foi clonado e sequenciado apresentando uma orf de 696 nucleotídeos codificando uma proteína de 231 aminoacidos. Houve similaridades com sequencias já depositadas no Genbank, sendo observado uma identidade de sequencia de 100% do BGH6902 com o cultivar PI134417 pertencente também a espécie Solanum habrochaites. A comparação das sequencias de aminoácidos do acesso resistente BGH-6902 e Santa clara mostrou a presença de 4 substituições do tipo não sinônimas na posição P69S, L85V, K123Q e N224 demonstrando que há diferenças entre essas proteínas, previamente descritas na literatura como relacionados com a resistencia a vírus pertencente ao gênero potyvirus. PALAVRAS-CHAVE- Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), resistencia genética, ABSTRACTS Cloning and molecular characterization of the eif4e gene in tomato (Solanum habrochaites f. glabratum) Viruses such as Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) constitute a large problem in the production of tomato and pepper in Brazil, being necessary to identify genes involved in genetic resistance to decrease these agricultural losses. Studies have shown that a mutation of the natural translation initiation factor of eif4e eukaryotic eif and its isoform (iso) 4E leads to a recessive genetic resistance to viruses, through the absence or decrease of viral multiplication on cellular level. The objective of this study was to characterize the eif4e gene found in wild tomato BGH-6902 compared to the susceptible genotype Santa Clara. For this purpose, the cdna coding for eif4e tomato was cloned and sequenced showing a 696 nucleotide ORF encoding a protein of 231 amino acids. There were similarities with sequences already deposited in Genbankand it was observed a sequence identity of 100% of BGH6902 belonging to the cultivar PI134417 also Solanum habrochaites. The comparison of sequences is amino acids of susceptible acess Santa Clara and resistant access BGH6902 showed the presence of the fourth type non-synonymous substitution at position P69S, L85V, and K123Q N224 showing that there are differences between these proteins, as previously described in the literature relating to the resistance to viruses belonging to the genus potyvirus. Keywords: Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), resistance gene INTRODUÇÃO Dentre as doenças que afetam o tomateiro, as viroses constituem fatores limitantes á produção comercial devido a presença de mais de 40 espécies de vírus pertencentes a diferentes gêneros como Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4765

o Potyvirus. Vírus pertencentes a esse gênero possuem partículas alongadas e flexuosas e genoma composto por uma única molécula de RNA de fita simples, de sentido positivo, com aproximadamente 10.000 nucleotídeos. O RNA viral possui uma proteína de origem viral denominada VPg, ligada covalentemente a extremidade 5`, e uma cauda poli A, localizada na extremidade 3`, sendo envolta por aproximadamente 2200 cópias de uma proteína capsidial com massa molecular em torno de 34 kda (Berger et al., 2005). O aumento da variabilidade de virus pertencentes a esse gênero atacando culturas importantes como pimentão pode ser demonstrada por trabalhos como o apresentado por Inoue-Nagata et al.(2002) onde estes autores relataram a presença de um novo Potyvirus causando mosaico amarelo em pimentão doce no sul do Brasil denominado Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Dois anos após a descoberta dessa virose, Maciel-Zambolim et al.( 2004), relataram a ocorrência do PepYMV causando perdas econômicas na cultura do tomateiro no estado do Espírito Santo, demonstrando a urgente necessidade de busca de alternativas tecnológicas visando diminuir as perdas causadas por esse vírus. Com o conhecimento dos mecanismos de transmissão dos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus, torna-se necessário que sejam também esclarecidos os mecanismos utilizados pelas plantas que estejam relacionados com a resistência genética. German-Retana et al.(2008) demonstraram que uma mutação natural do fator de iniciação da tradução de eucarióticos eif4e e sua isoforma eif(iso)4e leva a uma resistência genética recessiva ao vírus. Casos da resistência genética mediada pelo eif4e relatam a falta ou mesmo diminuição da multiplicação viral em nível celular. Em alguns casos, entretanto, a resistência mediada por eif4e ainda permite o acumulo sistêmico de partículas virais, se bem que em menor extensão e sem sintomas aparentes (Nicaise et al., 2003). Com o aumento da incidência do PepYMV nas culturas do tomateiro, torna-se necessária a obtenção de novas fontes de resistência a este vírus para utilização em programas de melhoramento, sendo que em trabalho realizado por Juhasz et al.(2008) foi identificado uma fonte de resistência genética ao PepYMV em um acesso Solanum habrochaites f. glabratum denominado BGH-6902. Assim, o objetivo deste trabalho é caracterizar o possível gene de resistência a PepYMV encontrado em tomate silvestre BGH-6902 em relação ao genótipo suscetível Santa Clara. MATERIAL E MÉTODOS Foi utilizado o acesso BGH-6902 e a variedade Santa Clara, previamente caracterizados por Juhasz et al.(2006), como resistente e susceptível respectivamente ao Patotipo 1.2, estirpe 3 do PepYMV para amplificação do gene codificador do eif4e. Estes germoplasmas tiveram seu RNA total Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4766

extraído a partir de 0,1 g de folhas, utilizando-se o reagente Brazol (LGC Biotecnologia). As amostras foram maceradas em nitrogênio líquido, adicionando-se 300 µl de Brazol para posterior agitação por 2 minutos. Em seguida foram adicionados 50 µl de clorofórmio, seguindo-se centrifugação a 12.000 g a 4ºC por 12 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos tubos contendo 300 µl de isopropanol gelado e agitado por 2 minutos. Após centrifugação por 20 minutos a 12.000 g a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado com etanol 70%. Após secagem a temperatura ambiente, o sedimento foi ressuspendido em água Milli-Q tratada com DEPC, para uma concentração final de 0,2 a 0,3 µg/µ l. O RNA foi utilizado como molde para a síntese de uma fita de DNA complementar (cdna), utilizando-se a enzima Superscript III RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Foi utilizado o primer codificador para eif4e (eif4efw(1) 5 - ATGGCAGCAGCTGAAATG-3 eif4e e Rv(1) 5 - CTATACGGTGTAACGATTCTT- 3 (GenBank AF259801). As reações em cadeia de polimerase (PCR) para amplificação da região correspondente ao gene de resistência de cada genótipo foi realizada em um volume total de 25 µl, utilizando-se 2 µl de cdna, 2,5 µl do tampão da enzima, 2,5 µl de MgCl 2 25 mm, 2,0 µl de mistura de dntps (10 mm), 0,5 µl de cada oligonucleotídeo e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Promega), completando-se o volume com água. A amplificação foi realizada em 30 ciclos de desnaturação a 94 o C por 2 minutos, anelamento dos oligonucleotídeos a 57 o C por 1 minuto e extensão a 72 o C por 2 minutos, com uma extensão final a 72 o C por 10 minutos. Uma alíquota de 5 µl foi utilizada para análise dos produtos de amplificação por meio de eletroforese em gel de agarose (0,7%). Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados no plasmídeo vetor pgem-t-easy (Promega), conforme as instruções do fabricante. Os plasmídeos foram transformados em células competentes de Escherichia coli DH5α pelo método do choque térmico (Sambrook & Russel, 2001). O DNA plasmidial dos transformantes foi extraído pelo método da lise alcalina e clivado com a enzima EcoR I, liberando o fragmento genômico inserido. O seqüenciamento de todos os clones foi realizado pela Macrogen Inc (www.macrogen.com). As sequencias de aminoácidos do acesso BGH-6902 e da variedade Santa Clara foram comparadas entre si, sendo que os alinhamentos múltiplos foram obtidos utilizando-se o programa ClustalW. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os primers eif4e(r) e eif4e(f) geraram fragmentos amplificados de tamanho de 696 nucleotídeos e uma proteína de 231 aminoacidos, tanto para o BGH-6902 quanto para o Santa Clara. As pesquisas por meio da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4767

usando como base de comparação sequencia obtida do eif4e oriunda do BGH-6902 revelaram presença significante de sequencias similares com identidade acima de 98% com sequencias já depositadas no Genbank de duas outras espécies vegetais, como pode ser visto na Figura 1. Essas similaridades, estão relacionadas com espécies do gênero Solanum como, por exemplo, Solanum habrochaites e Solanum lycopersicum, sendo observado uma identidade de sequencia de 100% com o cultivar PI 134417 pertencente a espécie Solanum habrochaites. Alinhamentos múltiplos das sequencias de nucleotídeos do eif4e entre o acesso resistente ao PepYMV, BGH-6902 e o suscetível Santa Clara, revelaram 8 polimorfismos de um simples nucleotídeo (SNP), sendo 4 mudanças de C para T, localizadas nas posições 205, 210, 244 e 647, uma de G para C localizada na posição 253, uma de A para C na posição 367, uma de T para C na posição 621e uma de A para G na posição 671. Entretanto, a presença de 4 substituições do tipo não sinônimas na posição P69S, L85V, K123Q e N224S, como pode ser visto com mais detalhes na Figura 2. Interessantemente, algumas dessas mudanças levaram a substituições de aminoácidos da mesma polaridade como ocorrido em L85V (apolar para apolar) e N224S (polares neutros), sendo que essas mudanças entre aminoácidos de mesma polaridade podem não conduzir a uma mudança de conformação da estrutura tridimensional da proteína e assim não alterar sua função em relação a resistência genética. Assim, a comparação da sequencia de aminoácidos relacionados ao fator de iniciação da tradução da família 4E (eif4e) do acesso resistente BGH-6902 com a do suscetível Santa Clara, demonstra que há diferenças entre essas proteínas, previamente descritas na literatura como relacionados com a resistencia a vírus pertencente ao gênero potyvirus. AGRADECIMENTO A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxilio financeiro na condução desta pesquisa. REFERÊNCIAS BERGER PH; ADAMS MJ; BARNETT OW; BRUNT AA; HAMMOND J; HILL JH; JORDAN RL; KASHIWAZAKI S; RYBICKI E; SPENCE N; STENGER DC; OHKI ST; UYEDA I; van ZAAYEN A VALKONEN A; VETTEN HJ. 2005. Potyviridae. In: FAUQUET CM; MAYO MA; MANILOFF J; DESSELBERGER U; BALL LA (eds.) Virus taxonomy. San Diego: Elsevier Academic Press. p. 819-841. GERMAN-RETANA S; WALTER J; DOUBLET B; ROUDET-TAVERT G; NICAISE V; LECAMPION C; HOUVENAGHEL MC; ROBAGLIA C; MICHON T; LE GALL O. 2008. Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4768

Mutational analysis of plant cap-binding protein eif4e reveals key amino acids involved in biochemical functions and potyvirus infection. Journal of Virology 82:7601-7612. INOUE-NAGATA AK; FONSECA MEN RESENDE RO; BOITEUX LS; MONTE DC; DUSI AN; DE AVILA AC; VAN DER VLUGT RAA. 2002. Pepper yellow mosaic virus, a new potyvirus in sweetpepper, Capsicum annuum. Archives of Virology 147:849-855. JUHASZ ACP; DA SILVA DJH; ZERBINI FM; CARNEIRO PCS; SOARES BO; CRUZ CD. 2008. Resistance genetic basis of a wild tomato access to pepper yellow mosaic virus. Pesquisa Agropecuaria Brasileira 43:713-720. JUHASZ ACP; DA SILVA DJH; ZERBINI FM; SOARES BO; AGUILERA GA. 2006. Screening of Lycopersicon sp accessions for resistance to Pepper yellow mosaic virus. Scientia Agricola 63:510-512. MACIEL-ZAMBOLIM E; COSTA H; CAPUCHO AS; ÁVILA AC; INOUE-NAGATA AK; KITAJIMA, E.W. 2004. Surto epidemiológico do vírus do mosaico amarelo do pimentão em tomateiro na região serrana do Espírito Santo. Fitopatologia Brasileira 29:325-327. NICAISE V; GERMAN-RETANA S; SANJUAN R; DUBRANA MP; MAZIER M; MAISONNEUVE B; CANDRESSE T; CARANTA C; LE GALL O. 2003. The eukaryotic translation initiation factor 4E controls lettuce susceptibility to the potyvirus Lettuce mosaic virus. Plant Physiology 132:1272-1282. SAMBROOK J; RUSSEL D. 2001.Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2344p. Acesso Genbank Descrição Score Identidade E value maximo Maxima AAV88612.1 eif4e [Solanum habrochaites] 482 1,00E-171 100% AAV88610.1 eif4e4e [Solanum lycopersicum 476 4,00E-169 98% AAV88613.1 eif4e 4E [Solanum habrochaites] 474 3,00E-168 98% NP_001234260.1 eif4e 4E [Solanum lycopersicum] 452 2,00E-159 98% AAV88611.1 eif4e 4E [Solanum lycopersicum] 452 2,00E-159 98% NP_001234459.1 eif4e [Solanum lycopersicum] 452 2,00E-159 98% NP_001233929.1 eif4e [Solanum lycopersicum] 450 7,00E-159 98% NP_001233935.1 eif4e [Solanum lycopersicum 450 7,00E-159 98% Figura 1: Acessos depositados no Genbank, com presença de alinhamento de sequencias de nucleotídeos significantes a seqüencia de nucleotídeo do eif4e clonada do acesso de tomate BGH6902 resistente ao PepYMV (Access deposited in Genbank, with the presence of alignment of nucleotide sequences of the significant nucleotide sequence of the cloned eif4e access BGH6902 resistant tomato PepYMV) Viçosa 2012. Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4769

eif4e- M2R10-BGH-6902 MAAAEMERTMSFDAAEKLKAADGGGGEVDDELEEGEIVEESNDTASYLGKEITVKHPLEH 60 eif4e- SCP2-12-SC MAAAEMERTMSFDAAEKLKAADGGGGEVDDELEEGEIVEESNDTASYLGKEITVKHPLEH 60 ************************************************************ eif4e- M2R10-BGH-6902 SWTFWFDNSTTKSRQTAWGSSLRNLYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLIMGADFHCFKHKI 120 eif4e- SCP2-12-SC SWTFWFDNPTTKSRQTAWGSSLRNVYTFSTVEDFWGAYNNIHHPSKLIMGADFHCFKHKI 120 ********.***************:*********************************** eif4e- M2R10-BGH-6902 EPQWEDPVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRAKGEKI 180 eif4e- SCP2-12-SC EPKWEDPVCANGGTWKMSFSKGKSDTSWLYTLLAMIGHQFDHGDEICGAVVSVRAKGEKI 180 **:********************************************************* eif4e- M2R10-BGH-6902 ALWTKNAANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRSAKNRYTV 231 eif4e- SCP2-12-SC ALWTKNAANETAQVSIGKQWKQFLDYSDSVGFIFHDDAKRLDRNAKNRYTV 231 *******************************************.******* Figura 2: Alinhamento múltiplo realizado com as sequencias de aminoácidos do eif4e do acesso resistente BGH-6902 e susceptível Santa Clara ao PepYMV (Multiple alignment performed using the amino acid sequences of eif4e access resistant BGH-6902 and capable Santa Clara to PepYMV) Viçosa, 2012. Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4770