Revist Árvore ISSN: 0100-6762 r.rvore@ufv.r Universidde Federl de Viços Brsil Liprize de Oliveir, Mil; Xvier, Aloisio; Penchel Filho, Ricrdo Miguel; Cmpos Otoni, Wgner; Btist Teixeir, João Efeitos do meio de cultur e d relção BAP/ANA n multiplicção in vitro de clones de Euclyptus grndis x E. urophyll em iorretor de imersão temporári Revist Árvore, vol. 35, núm. 6, diciemre, 2011, pp. 1207-1217 Universidde Federl de Viços Viços, Brsil Disponível em: http://www.redlyc.org/rticulo.o?id=48821458007 Como citr este rtigo Número completo Mis rtigos Home d revist no Redlyc Sistem de Informção Científic Rede de Revists Científics d Améric Ltin, Crie, Espnh e Portugl Projeto cdêmico sem fins lucrtivos desenvolvido no âmito d inicitiv Acesso Aerto
Efeitos do meio de cultur e d relção... 1207 EFEITOS DO MEIO DE CULTURA E DA RELAÇÃO BAP/ANA NA MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE CLONES DE Euclyptus grndis X E. urophyll EM BIORREATOR DE IMERSÃO TEMPORÁRIA 1 Mil Liprize de Oliveir 2, Aloisio Xvier 3, Ricrdo Miguel Penchel Filho 2, Wgner Cmpos Otoni 4 e João Btist Teixeir 5 RESUMO Form relizdos três experimentos individuis com o ojetivo de testr diferentes meios de cultur e cominções entre os fitorreguldores BAP e ANA n multiplicção de clones de Euclyptus grndis x E. urophyll, utilizndo o iorretor de imersão temporári RITA. O meio de cultur MS e frequênci de imersão cd 2 h promoverm mior mss fresc e número de rotos por explntes. No entnto, houve diferenç qunto o crescimento ds culturs entre os dois clones vlidos. A cominção 1,0 µm de BAP com 0,5 µm de ANA foi que resultou miores médis em relção à mss fresc e o número de rotos. As culturs presentrm lto percentul de hiper-hidricidde, sendo ess desordem ftor limitnte ns condições deste estudo pr o cultivo de Euclyptus em iorretores. Plvrs-chve: Micropropgção, Clongem de euclipto e Biotecnologi. EFFECTS OF CULTURE MEDIUM AND BAP/NAA RATIO ON IN VITRO MULTIPLICATION OF Euclyptus grndis X E. urophyll CLONES IN A TEMPORARY IMMERSION BIOREACTOR ABSTRACT Three individul experiments were conducted in order to test different culture medi nd BAP/ NAA comintions on the multipliction of Euclyptus grndis x E. urophyll clones using the temporry immersion iorector RITA. The MS medium nd the frequency of immersion every two hours promoted the highest fresh weight nd numer of shoots per explnt. However, cultures growth were different etween the two clones evluted. The comintion of 1.0 µm BAP nd 0.5 µm NAA promoted the gretest mens in reltion to fresh weight nd numer of shoots. The cultures presented high percentges of hyperhydricity nd this physiologicl disorder ws limiting fctor in the condition of this study Euclyptus cultivtion in iorectors. Keywords: Micropropgtion, Cloning of euclyptus nd Biotechnology. 1. INTRODUÇÃO Com relção às técnics de cultivo in vitro de plnts, micropropgção destc-se entre quels de mior interesse científico e econômico, devido às diverss vntgens que present. A micropropgção em escl comercil depende de elevds txs de proliferção durnte fse de multiplicção, spectos qulittivos ds rotções ns fses de enrizmento e climtizção e lto percentul de sorevivênci ds plnts, tudo isso copldo à utomtizção de lgums etps do processo (ZIV, 1995). Ns últims décds, equipmentos como iorretores têm contriuído pr utomtizção em determinds fses d micropropgção de lgums espécies de plnts, possiilitndo produção em lrg escl. 1 Receido em 03.02.2010 e ceito pr pulicção em 31.10.2011. 2 Firi Celulose S.A., Jcreí-SP, Brsil. E-mil:<mil.liprize@firi.com.r> e <rp@firi.com.r>. 3 Deprtmento de Engenhri Florestl, Universidde Federl de Viços, UFV, Brsil. E-mil:<xvier@ufv.r>. 4 Universidde Federl de Viços, UFV, Brsil. E-mil:<wotoni@ufv.r>. 5 Emrp - Recursos Genéticos e Biotecnologi, Brsíli, Brsil. E-mil:<tist@cenrgen.emrp.r>.
1208 OLIVEIRA, M.L. et l. Pr espécies lenhoss como s do gênero Euclyptus, ind são escssos os estudos envolvendo tecnologi de iorretores. Reis et l. (2003) e McAlister et l. (2005) otiverm sucesso no desenvolvimento de culturs de euclipto em iorretor RITA, em relção o meio semissólido, porém esses utores reltrm lt incidênci de explntes hiper-hídricos. Cstro e González (2002) utilizrm um sistem de imersão temporári dptdo do sistem RITA, com frscos gêmeos, pr o cultivo de clones de Euclyptus grndis, e tmém consttrm incremento ns crcterístics de crescimento e viilidde do uso d técnic, prtir do controle d hiper-hidricidde dos explntes, otido por meio d incorporção de r o recipiente d cultur, mnejo dos intervlos de imersão e d composição do meio de cultur. Outros reltos do uso de sistems de imersão temporári no cultivo de plnts lenhoss são relciondos, principlmente, à emriogênese somátic de conífers (AITKEN-CHRISTIE et l., 1988; GUPTA; TIMMIS, 2005), Heve rsiliensis (ETIENNE et l., 1997) e cfé (ETIENNE et l., 2006). Diverss vriáveis podem influencir n fse de multiplicção, entre els composição do meio de cultur utilizdo, o miente de crescimento e mnipulção do mteril vegetl durnte os sucultivos. Apesr de o ojetivo d fse de multiplicção ser produção do mior número de plnts possível, os spectos qulittivos dos explntes são de sum importânci, entre eles o mínimo de vrição dos explntes e homogeneidde d prte ére produzid, que vão determinr o sucesso ns fses seguintes de enrizmento e climtizção (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Diferentes meios ásicos de cultur podem ser utilizdos n fse de multiplicção, dependendo ds necessiddes de cd espécie vegetl. Estudos que definem concentrção ótim de citocinins pr multiplicção e sus cominções com outros reguldores são importntes pr o juste dos meios de cultur (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; SANTOS- SEREJO et l., 2006). O uso de iorretores n fse de multiplicção é lterntiv pr micropropgção mssl de euclipto prtir do juste de um protocolo de cultivo. Assim, os ojetivos deste trlho form vlir diferentes tipos de meios de cultur e relções BAP/ANA no meio MS, n micropropgção de clones de Euclyptus grndis x E. urophyll, utilizndo iorretores de imersão temporári RITA. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Fonte, meio de cultur e condições de cultivo dos explntes Os experimentos form desenvolvidos no Lortório de Biotecnologi do Centro de Tecnologi CT d empres Firi Celulose (ntig Arcruz Celulose S. A.), loclizd no município de Arcruz, Espírito Snto. O mteril vegetl utilizdo pr introdução nos iorretores form clones de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1 e C2), provenientes d empres Firi, preestelecidos in vitro por meio d micropropgção em meio de cultur semissólido. Form cultivdos em plcs de Petri estéreis e descrtáveis (Pleion Bioplss ), de 90 mm de diâmetro (D) x 15 mm (H) de ltur (Figur 1A), contendo 25 ml do meio de cultur MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), diciondo de 100 mg L -1 de mioinositol (Sigm ), 10 mg L -1 de timin-hcl (Sigm ), 0,50 mg L -1 de ácido nicotínico (Sigm ), 0,50 mg L -1 de piridoxin- HCl (Sigm ), 100 mg L -1 de L-glutmin (Sigm ), 0,34 mg L -1 de BAP (6-enzilminopurin Sigm ), 0,01 mg L -1 de ANA (ácido nftlenocético Sigm ), 30 g L -1 de scrose (Vetec ) e 7 g L -1 de cto-ágr (BD ). O ph foi justdo pr 5,8 com KOH (1 N) e HCl (1 N) ntes d dição do ágr e d esterilizção em utoclve um pressão de 1,5 tm e tempertur de 121 C por 15 min. O mteril vegetl foi estelecido em prteleirs de metl rmdo com iluminções verticl e lterl, condiciondo em sl de cultur 24 ± 2 ºC, fotoperíodo de 14 h e irrdiânci PAR médi de 20 µmol m -2 s -1, medid no prelho Optic Science Modelo DQM. 2.2. Multiplicção em iorretor: meio de cultur MS e WPM Neste experimento, form testdos os meios de cultur MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) e WPM (LLOYD; McCOWN, 1980) e dus frequêncis de imersão, de 2 e 4 h por um período de 10 seg, n fse de multiplicção em iorretor de imersão temporári RITA (Vitropic SA). Form utilizdos rotos picis, com mss fresc e tmnho uniformes, como explntes iniciis de um clone de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1), estelecidos in vitro (Figur 1B). Os explntes form pré-cultivdos, proximdmente, sete dis ntes de su utilizção nos iorretores RITA pr
Efeitos do meio de cultur e d relção... 1209 1 cm 1 cm A B C Figur 1 Bnco clonl in vitro (A), rotos picis (B) e tufos de multirotções (C) dos clones de Euclyptus grndis x E. urophyll utilizdos como explntes iniciis no cultivo em iorretores de imersão temporári RITA. Figure 1 In vitro clonl nk (A), picl uds (B) nd nodl unches (C) of Euclyptus grndis x E. urophyll clones used s initil explnts in RITA temporry immersion iorectors cultivtion. experimentção, permnecendo em plcs de Petri contendo meio MS, como descrito no item 2.1, sem dição de reguldores de crescimento. Aos dois meios ásicos de cultur testdos form diciondos 100 mg L -1 de mioinositol, 10 mg L -1 de timin-hcl, 0,50 mg L -1 de ácido nicotínico, 0,50 mg L -1 de piridoxin-hcl, 0,11 mg L -1 de BAP e 30 g L -1 de scrose, com ph justdo pr 5,8 com KOH (1 N) e HCl (1 N), ntes d esterilizção em utoclve um pressão de 1,5 tm e tempertur de 121 C por 15 min. Utilizou-se o volume de 200 ml de meio de cultur líquido por recipiente, o qul foi utoclvdo diretmente dentro dos recipientes dos iorretores. Após introdução nos iorretores, o mteril vegetl foi condiciondo em sl de cultur 24 ± 2 ºC, fotoperíodo de 14 h e irrdiânci médi de 20 µmol m -2 s -1. Como suporte de poio pr os explntes dentro dos iorretores, utilizou-se disco de esponj poliméric (Bulpren S 28133, densidde de 30 kg m -3 ) so ppel-filtro qulittivo (Nº 1 Quly ). O delinemento experimentl utilizdo foi o inteirmente csulizdo, em rrnjo ftoril 2 x 2, sendo dois meios ásicos de cultur (MS e WPM) e dus frequêncis de imersão (2 e 4 h), com cinco repetições por trtmento, cd um constituíd por um recipiente RITA contendo oito explntes. Pr vlição d mss fresc, foi relizd pesgem dos grupos de explntes de cd repetição dos trtmentos os 0 e 28 dis de idde d cultur. O número de rotos foi otido pel contgem de novos rotos com dois ou mis pres de folhs desenvolvidos durnte o ciclo de cultivo, em todos os explntes, os 28 dis de idde d cultur. O percentul de hiper-hidricidde foi otido trvés d nálise visul do grupo de oito explntes de cd repetição, triuindo-se vlores de 0 100, os 0 e 28 dis de idde d cultur. 2.3. Multiplicção em iorretor: meio de cultur MS, QL e JADS Este experimento vliou os meios de cultur MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), JADS (CORREIA, 1995) e QL (QUOIRIN; LEPOIVRE, 1977), n fse de multiplicção de dois clones de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1 e C2). Como explntes iniciis, pr introdução nos iorretores RITA, form utilizdos tufos de multirotções, estelecidos in vitro (Figur 1C), com mss fresc e tmnho uniformes. Aos meios ásicos de cultur form diciondos 100 mg L -1 de mioinositol, 10 mg L -1 de timin-hcl, 0,50 mg L -1 de ácido nicotínico, 0,50 mg L -1 de piridoxin- HCl, 0,11 mg L -1 de BAP e 30 g L -1 de scrose, com ph justdo pr 5,8 com KOH (1 N) e HCl (1 N) ntes d esterilizção em utoclve um pressão de 1,5 tm e tempertur de 121 C por 15 min. Utilizou-se o volume de 250 ml de meio por recipiente, o qul foi utoclvdo diretmente dentro dos recipientes dos iorretores. Após introdução nos iorretores, o mteril vegetl foi condiciondo em sl de cultur 24 ± 2 ºC, fotoperíodo de 14 h e irrdiânci PAR médi de 20 µmol m -2 s -1. A frequênci de imersão utilizd foi de 2 h por um período de 8 seg, e como suporte de poio pr os explntes dentro dos iorretores utilizou-se disco de esponj poliméric (Bulpren S 28133, densidde de 30 kg m -3 ) so ppel-filtro qulittivo (Nº 1 - Quly ).
1210 OLIVEIRA, M.L. et l. O delinemento experimentl utilizdo foi o inteirmente csulizdo, em rrnjo ftoril 3 x 2, sendo três meios ásicos de cultur (MS, JADS e QL) e dois mteriis genéticos (C1 e C2), com qutro repetições por trtmento, cd um constituíd por um recipiente RITA contendo qutro explntes. Pr vlição d mss fresc, foi relizd pesgem do grupo de explntes de cd repetição dos trtmentos, os 0 e 21 dis de idde d cultur. O número de rotos foi otido pel contgem dos rotos principis (sindo diretmente d se do explnte) com dois ou mis pres de folhs, em todos os explntes, os 0 e 21 dis de idde d cultur. O percentul de hiper-hidricidde foi otido por meio d nálise visul do explnte, com contgem do número de rotos hiper-hídricos em cd explnte, os 0 e 21 dis de idde d cultur. 2.4. Multiplicção em iorretor: relção BAP/ANA Este experimento vliou 12 diferentes cominções entre os fitorreguldores BAP/ANA: T1 = 0,0/0,0; T2 = 0,0/0,05; T3 = 0,0/0,5; T4 = 0,5/0,0; T5 = 0,5/0,05; T6 = 0,5/0,5; T7 = 1,0/0,0; T8 = 1,0/0,05; T9 = 1,0/0,5; T10 = 1,5/0,0; T11 = 1,5/0,05; e T12 = 1,5/0,5 µm. Form utilizdos rotos picis (Figur 1B), com mss fresc e tmnho uniformes, como explntes iniciis de um clone de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1), estelecidos in vitro, pré-cultivdos, proximdmente sete dis ntes de su utilizção nos iorretores RITA pr experimentção, permnecendo em plcs de Petri contendo meio MS, como descrito no item 2.1, sem dição de reguldores de crescimento. As cominções form testds em meio MS diciondo de 100 mg L -1 de mioinositol, 10 mg L -1 de timin-hcl, 0,50 mg L -1 de ácido nicotínico, 0,50 mg L -1 de piridoxin-hcl e 30 g L -1 de scrose, com ph justdo pr 5,8 com KOH (1 N) e HCl (1 N) ntes d esterilizção em utoclve um pressão de 1,5 tm e tempertur de 121 C por 15 min. Utilizou-se o volume de 250 ml de meio de cultur por recipiente, o qul foi utoclvdo diretmente dentro dos recipientes dos iorretores. Após introdução nos iorretores, o mteril vegetl foi condiciondo em sl de cultur 24 ± 2 ºC, fotoperíodo de 14 h e irrdiânci PAR médi de 20 µmol m -2 s -1. A frequênci de imersão utilizd foi de 2 h por um período de 8 seg, e como suporte de poio pr os explntes dentro dos iorretores utilizou-se disco de esponj poliméric (Bulpren S 28133, densidde de 30 kg m -3 ) so ppel-filtro qulittivo (Nº 1 Quly ). O delinemento experimentl utilizdo foi o inteirmente csulizdo, com 12 trtmentos (cominções de BAP/ANA) e 20 repetições por trtmento, sendo cd repetição constituíd por um explnte e cd trtmento formdo por dois recipientes RITA contendo 10 explntes. Pr vlição d mss fresc, foi relizd pesgem dos explntes os 0 e 23 dis de idde d cultur. O número de rotos foi otido pel contgem de novos rotos, com dois ou mis pres de folhs, desenvolvidos durnte o ciclo de cultivo, em cd explnte, os 23 dis de idde d cultur. O percentul de hiper-hidricidde foi otido trvés d nálise visul do explnte, com contgem do número de rotos hiper-hídricos em cd explnte, os 0 e 23 dis de idde d cultur. 3. RESULTADOS 3.1. Multiplicção em iorretor: meios de cultur MS e WPM O ftor frequênci de imersão presentou diferenç em relção à crcterístic mss fresc dos explntes, número de rotos e de hiper-hidricidde, sendo frequênci de 2 h superior à de 4 h em mos os meios de cultur vlidos (Figur 2). Os explntes dos trtmentos constituídos pelo meio de cultur WPM, de modo gerl, presentrm menor vigor em relção o meio de cultur MS, com colorção vermelhd do cule e closiddes ns folhs (Figur 3). Pr o porcentul de hiper-hidricidde dos explntes, n frequênci de 2 h, oteve-se mior percentul de hiperhidricidde dos explntes nos meios MS (88%) em comprção com o WPM (60%). Já n frequênci de 4 h o meio WPM presentou mior percentul de hiperhidricidde (32%) do que o meio MS (24%) (Figur 2C). 3.2. Multiplicção em iorretor: meios de cultur MS, QL e JADS O C1 presentou médis de mss fresc superiores o C2 em dois dos três meios de cultur estuddos (MS e QL) (Figur 4A). No C1, o meio MS tendeu um superioridde em relção os demis, com médi de 0,43 g, seguido pelo QL com 0,33 g e pelo JADS com 0,19 g por explnte vlido. Qunto à crcterístic número de rotos, tmém o C1 foi superior o C2 n produção de novos rotos durnte o período de cultivo, com médi de 11 rotos por explnte, em comprção com 5,3 do C2. Em relção os meios de cultur estuddos, o meio MS teve tendênci de superioridde,
Mss Fresc por Explnte (g) Número de Brotos por Explnte (g) Efeitos do meio de cultur e d relção... 1211 A 2 hors 4 hors B 2 hors 4 hors 0,5 12 0,4 10 0,3 0,2 8 6 4 0,1 2 0,0 MS WPM 0 MS WPM C 2 hors 4 hors % Hiper-hidricidde (g) 120 100 80 60 40 20 0 MS Figur 2 Mss fresc (A), número de rotos (B) e percentul de hiper-hidricidde (C) de explntes cultivdos em meios de cultur MS e WPM, ns dus frequêncis de imersão estudds (2 e 4 h), os 28 dis de idde d cultur do clone de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1) em iorretores de imersão temporári RITA. Brrs verticis indicm o erro-pdrão d médi. Figure 2 Fresh weight (A), numer of shoots (B) nd hyperhydricity percentge (C) of explnts grown in MS nd WPM medium, in the two immersion frequencies studied (2 nd 4 h) t 28 dys of ge of the culture of Euclyptus grndis x E. urophyll clone (C1) in RITA temporry immersion iorectors. Verticl rs indicte the stndrd error of the men. WPM 1cm 1cm A 1cm B C Figur 3 Brotções do clone de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1) cultivdos em iorretor de imersão temporári RITA : tufos de multirotções, com mior vigor em meio de cultur MS (A) e presentndo colorção vermelhd no cule (B) e closidde ns folhs (C) em meio WPM, os 28 dis de idde. Figure 3 Shoots of Euclyptus grndis x E. urophyll clone (C1) grown in RITA temporry immersion iorector: tufts of nodl, with greter force on MS medium (A) nd presenting reddish color on the stem (B) nd cllus in leves (C) in WPM culture medium, t 28 dys of ge.
1212 OLIVEIRA, M.L. et l. com número médio de rotos de 12,7 (MS), 11,6 (QL) e 8,6 (JADS) pr o C1 e 5,6 (MS), 5,3 (JADS) e 4,9 (QL) pr o C2 (Figur 4B). Em relção à crcterístic hiper-hidricidde, est presentou diferenç entre clones, tendo o C2 mostrdo mior percentul de hiperhidricidde dos explntes qundo cultivdo em meio de cultur QL e JADS (Figur 4C), no entnto, no meio MS, não se notou diferenç de respost entre os dois clones vlidos. 3.3. Multiplicção em iorretor: relção BAP/ANA Houve diferenç significv (P<0,05) entre s cominções de BAP/ANA estudds com relção tods s crcterístics vlids. Pr mss fresc dos explntes, os trtmentos T5 (0,5/0,05), T9 (1,0/0,5) e T12 (1,5/0,5) form semelhntes, e o T9 presentou mior médi de mss fresc nesse experimento (0,137 g). Os grupos de trtmentos T6 (0,5/0,5), T7 (1,0/0,0), T8 (1,0/0,05), T10 (1,5/0,0) e T11 (1,5/0,05) e T1 (0,0/0,0), T2 (0,0/0,05), T3 (0,0/0,5) e T4 (0,5/0,0) não form significtivmente diferentes entre si, sendo neste último grupo otids s menores médis de mss fresc (Figur 5A). Com relção o número de rotos, mior médi tmém foi encontrd no T9 (4,25), no entnto este trtmento foi esttisticmente semelhnte os T4, T5, T6, T7, T8, T10, T11 e T12, diferindo somente de T1, T2 e T3, que presentrm s menores médis de produtividde dos explntes e onde concentrção de BAP foi igul Mss Fresc por Explnte (g) A 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 MS QL JADS Clone 1 Clone 2 Número de Brotos por Explnte B 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 MS QL JADS Clone 1 Clone 2 % Brotos Hiper-hídricos por Explnte C 60 50 40 30 20 10 0 MS QL JADS Clone 1 Clone 2 Figur 4 Mss fresc (A), número de rotos (B) e percentul de hiper-hidricidde (C) por explnte dos dois clones de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1 e C2) e dos três meios de cultur estuddos, os 21 dis de cultivo em iorretores de imersão temporári RITA. Brrs verticis indicm o erro-pdrão d médi. Figure 4 Fresh weight (A), numer of shoots (B) nd hyperhydricity percentge (C) per explnt for two Euclyptus grndis x E. urophyll clones (C1 nd C2) nd three culture medi studied, t 21 dys of cultivtion in RITA temporry immersion iorectors. Verticl rs indicte the stndrd error of the men.
Mss Fresc por Explnte (g) Efeitos do meio de cultur e d relção... 1213 A 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 c c c c T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 Trtmentos Número de Brotos por Explnte B 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 Trtmentos % Hiper-hidricidde por Explnte C 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 Trtmentos Figur 5 Mss fresc (A), número de rotos (B) e percentul de hiper-hidricidde (C) por explntes ns diferentes cominções de BAP/ANA (T1 = 0,0/0,0; T2 = 0,0/0,05; T3 = 0,0/0,5; T4 = 0,5/0,0; T5 = 0,5/0,05; T6 = 0,5/0,5; T7 = 1,0/0,0; T8 = 1,0/0,05; T9 = 1,0/0,5; T10 = 1,5/0,0; T11 = 1,5/0,05; e T12 = 1,5/0,5 µm de BAP/ANA) estudds, os 23 dis de cultivo em iorretores de imersão temporári RITA do clone de Euclyptus grndis x E. urophyll (C1). Trtmentos com letrs iguis não diferirm significtivmente 5% de proilidde, pelo teste de Scott-Knott. Figure 5 Fresh weight (A), numer of shoots (B) nd hyperhydricity percentge (C) per explnt in different comintions of BAP/NAA (T1 = 0.0/0.0, T2 = 0.0/0.05, T3 = 0.0/0.5, T4 = 0.5/0.0, T5 = 0.5/0.05, T6 = 0.5/0.5, T7 = 1.0/ 0.0, T8 = 1.0/0.05, T9 = 1.0/0.5, T10 = 1.5/0.0, T11 = 1.5/0.05 nd T12 = 1.5/0.5 µm BAP / NAA) studied t 23 dys of cultivtion RITA in temporry immersion iorectors, of Euclyptus grndis x E. urophyll clone (C1). Tretments with sme letters re not significntly different t 5% proility y the Scott-Knott test. 0,0 µm. Oservou-se incremento do número de rotos nos trtmentos com o umento d concentrção de BAP té 1,0 µm, enqunto onde concentrção er de 1,5 µm o número de rotos produzidos presentou ligeiro decréscimo (Figur 5B). Não se verificou hiperhidricidde nos trtmentos onde concentrção de BAP foi de 0,0 µm (T1, T2 e T3), sendo esses trtmentos semelhntes T4, T7, T8, T10 e T11 (Figur 5C). O mior percentul de hiper-hidricidde (42%) foi otido no T5, trtmento que não diferiu esttisticmente do T6, T9 e T12. 4. DISCUSSÃO Os iorretores vêm surgindo como lterntiv pr viilidde d técnic de micropropgção de diverss espécies, especilmente por eliminr e, ou, utomtizr lgums etps do processo de produção. No entnto, trlhos que trtm d vlição de tipos e composições de meios de cultur em meio líquido ind são escssos, principlmente focndo tecnologi de iorretores em espécies lenhoss, rzão pel qul discussão deste trlho se poiou em estudos relizdos em meio semissólido.
1214 OLIVEIRA, M.L. et l. 4.1. Multiplicção em iorretor: meios de cultur MS e WPM Neste experimento, o meio MS presentou melhores resultdos de crescimento dos explntes, porém com mior ocorrênci d hiper-hidricidde. O meio MS tmém se mostrou superior o WPM, qunto o crescimento e multiplicção ds culturs, no cultivo de Amelnchier rore (BRAND, 1993), de Crle cnjern (ROCHA et l., 2007) e de Acci mernsii (DISARZ; CORDER, 2009). Assim como neste trlho, o menor vigor e colorção diferencid dos explntes cultivdos em meio WPM tmém form oservdos em cnjern por Roch et l. (2007), cujs folhs presentvm clorose. Esses resultdos podem estr relciondos o fto de o meio WPM possuir pens 45% d forç iônic totl do meio MS (NUNES et l., 2002) e concentrções menores de nitrto, mônio e nitrogênio totl (ROCHA et l., 2007). Em contrprtid, o meio WPM diciondo de reguldores de crescimento presentou-se eficiente no cultivo de segmentos nodis de pero-ros (RIBAS et l., 2005). As crcterístics mss fresc e número de rotos presentrm mesm tendênci de crescimento entre os trtmentos. Ns condições estudds, s dus crcterístics mostrrm-se relcionds, ou sej, qunto mior mss fresc dos explntes, mior o número de rotos produzidos. N micropropgção de crvo, Ydv et l. (2003) tmém oservrm relção positiv entre mss fresc e multiplicção dos explntes. Houve grnde vrição entre os explntes de um mesmo trtmento qunto às crcterístics vlids, o número de rotos produzidos e à mss fresc, o que explic o fto de o erro-pdrão d médi ser elevdo. Apesr de o intervlo de imersão de 2 h ter promovido mior gnho em iomss fresc e em número de rotos dos explntes, hiper-hidricidde nesse mnejo foi ftor limitnte. Reis et l. (2003) otiverm incremento de oito vezes n mss fresc e 2,5 vezes no comprimento dos rotos de euclipto cultivdos por 22 dis em iorretor RITA, em meio MS com 0,5 µm de BAP e no mnejo de 2 h, tmém com lt incidênci de explntes hiper-hídricos. Correi et l. (1995), tmém em estudos com clones de Euclyptus grndis x E. urophyll cultivdos em meio JADS líquido, reltrm sintoms de hiper-hidricidde pós 28 dis de cultivo. A hiper-hidricidde crcteriz-se morfologicmente por rotos longdos e espessos em diâmetro, entrenós mis curtos do que os ds plnts normis, e s folhs se presentm espessds, frequentemente longds, enrugds ou enrolds e querdiçs (GASPAR, 1991; ZIV, 1991). Ess desordem tem sido reltd, n miori ds vezes, pens n fse de multiplicção. As condições do cultivo in vitro, como lt umidde (GASPAR, 1991), ftores nutricionis como mineris e croidrtos, ltos níveis de reguldores de crescimento, ix irrdiânci e elevd disponiilidde de águ no meio, são s miores indutors de desordens fisiológics ns plnts, como hiper-hidricidde (MAJADA et l., 2000). Com o emprego de iorretores, o ftor disponiilidde de águ é ind mplido pelo uso do meio líquido, o qul está ssocido com lt moilidde de águ e, tmém, com lt umidde reltiv no miente in vitro, induzindo, ssim, presenç de sintoms d hiper-hidricidde (GASPAR et l., 1987). 4.2. Multiplicção em iorretor: meios de cultur MS, QL e JADS O clone 1 presentou resultdos superiores de tods s crcterístics vlids, o que pode ser explicdo pelo fto de ele ser considerdo um clone de mis fácil propgção vegettiv, comprtivmente o clone 2. Ess diferenç do cultivo in vitro entre genótipos, encontrd neste estudo, foi tmém reltd por Brvo et l. (2008) n influênci do genótipo sore cpcidde orgnogênic em progênies de E. grndis, qunto o cráter proliferção in vitro; e em vrições genétics oservds entre e dentro de fmílis de E. grndis, qunto à cpcidde de formção de gems (SOBROSA; CORDER, 2003), ssim como influencindo o desenvolvimento in vitro de gems de clones de Euclyptus grndis x E. urophyll (CORREIA et l., 1995). A respost o tipo e composição do meio de cultur vri não somente de cordo com espécie, ms entre genótipos de um mesm espécie e té entre explntes de um mesmo genótipo, que presentm demnds específics (SOUZA et l., 2006). Correi et l. (1995) verificrm importânci d especificidde do meio de cultur pr cd mteril genético, qundo se desej proliferção de gems com uniformidde e vigor. Além disso, ftores mientis como erção do meio de cultur e o controle de seu fluxo, qulidde e intensidde
Efeitos do meio de cultur e d relção... 1215 d luz e o fotoperíodo podem influencir no crescimento e desenvolvimento dos explntes, ssim como idde ontogenétic e o estdo de mturção d cultur. Dess mneir, fic clr necessidde de juste do protocolo de micropropgção, de cordo com o mteril genético de interesse. Ao contrário do que foi oservdo neste trlho, em que o meio MS presentou tendênci de crescimento superior em relção os demis meios estuddos, Glocke et l. (2006) oservrm crescimento mis vigoroso dos rotos em meio WPM e QL n micropropgção de mteril juvenil de Euclyptus erythronem x E. stricklndii, em comprção com outros meios, como o MS. Já Borges (2009) vliou diferenç entre os meios MS e JADS n multiplicção de clones de Euclyptus urophyll x E. gloulus e Euclyptus grndis x E. gloulus e encontrou tendênci de melhores resultdos no meio MS, oservndo tmém que esse meio produziu rotções mis longds e com folhs miores. No entnto, pesr d tendênci de superioridde do meio MS, o meio JADS presentou resultdos positivos n multiplicção desses clones. Esse utor tmém oservou ocorrênci de hiper-hidricidde em poucos explntes no meio MS, o que não foi visto no meio JADS. 4.3. Multiplicção em iorretor: relção BAP/ANA O incremento em produtividde, tnto em mss fresc qunto em número de rotos, foi considerdo ixo neste experimento, em comprção com os demis ensios nteriores, podendo ser explicdo pelo curto período de cultivo e pelo tmnho inicil dos explntes, que presentvm, em médi, 0,007 g de mss fresc. A cominção 1,0/0,5 µm de BAP/ANA (T9) foi que presentou miores médis em mss fresc e número de rotos. A mss fresc e o número de rotos por explntes tenderm umentr com crescentes concentrções de BAP e depois diminuir ns concentrções mis elevds desse reguldor. Grç et l. (2001) oservrm mior proliferção de rotos de E. dunnii n concentrção de 1 µm de BAP, presentndo relção invers entre o número de rotções e concentrção de BAP. Esse mesmo comportmento foi reltdo por Andrde et l. (2006) n multiplicção de E. grndis so o estímulo de BAP, oservndo que concentrções elevds dess citocinin promovem ção iniitóri n multiplicção de Euclyptus. Muitos utores reltrm esse comportmento em espécies de euclipto (DEL PONTE et l., 2001; BRONDANI, 2007). O efeito d concentrção dos reguldores de crescimento vri de cordo com espécie (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Em termos geris, este experimento presentou ixo percentul de hiper-hidricidde dos explntes, vrindo de 0 41,9%, em comprção com o estudo discutido no item 4.1, que utilizou o mesmo tipo de explnte inicil e tingiu vlores próximos 100% de hiper-hidricidde. Ess diferenç tmém pode ser explicd pelo curto período de cultivo, pois foi oservdo no decorrer desses estudos que hiperhidricidde, ssim como o gnho em iomss fresc e produtividde, form mis intensos prtir do 20 di de cultivo. A heterogeneidde no desenvolvimento dos explntes, em tods s crcterístics vlids, foi lt. O mesmo foi oservdo por Correi et l. (1995), que encontrrm grnde vrição n multiplicção de gems entre os explntes, dentro e entre clones de Euclyptus grndis x E. urophyll, cultivdos em meio de cultur líquido e sólido. A fonte de vrição no crescimento in vitro entre os explntes pode estr relciond com o tmnho e s crcterístics morfológics do explnte, como número de pres de folhs e diâmetro do cule, lém ds iddes cronológic, fisiológic e ontogenétic d cultur. 5. CONCLUSÕES O meio de cultur MS e frequênci de imersão cd 2 h form os trtmentos que promoverm melhor respost de crescimento em relção à mss fresc e à produtividde dos explntes dos clones de Euclyptus grndis x E. urophyll. O clone C1 foi superior o clone C2 qunto às crcterístics de crescimento vlids. A cominção 1,0 µm de BAP com 0,5 µm de ANA foi que presentou miores médis em relção à mss fresc e o número de rotos. De modo gerl, s culturs presentrm lto percentul de hiper-hidricidde, sendo ess desordem ind ftor limitnte ns condições deste estudo pr micropropgção em iorretor de imersão temporári de clones de Euclyptus. Mis estudos são necessários pr o juste de protocolos de cultivos de euclipto que viilizem técnic de micropropgção em iorretores.
1216 OLIVEIRA, M.L. et l. 6. REFERÊNCIAS AITKEN-CHRISTIE, J.; SINGH, A. P.; DAVIES, H. Multipliction of meristemtic tissue: new tissue culture system for rdit pine. In: HANOVER, J. W.; KEATHLEY, D. E. Genetic mnipultion of wood plnts. New York: Plenum, 1988. p.413-432. ANDRADE, W. F.; ALMEIDA, M.; GONÇALVES, A. N. Multiplicção in vitro de Euclyptus grndis so estímulo com enzilminopurin. Pesquis Agropecuári Brsileir, v.41, n.12, p.1715-1719, 2006. BORGES, S. R. Micropropgção e enrizmento de miniestcs de clones híridos de Euclyptus gloulus. 2009. 60f. Dissertção (Mestrdo em Ciênci Florestl) - Universidde Federl de Viços, Viços, MG, 2009. BRAND, M. H. Agr nd mmonium nitrte influence hyperhydricity, tissue nitrte nd totl nitrogen content of serviceerry (Amelnchier rore) shoots in vitro. Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, v.35, n.3, p.203-209, 1993. BRAVO, C. D. V. et l. Controle genético d regenerção in vitro em progênies de Euclyptus grndis. Ciênci Rurl, v.38, n.8, p.2181-2185, 2008. BRONDANI, G. E. et l. Estelecimento, multiplicção e longmento in vitro de Euclyptus enthmii Miden & Cmge x Euclyptus dunnii Miden. Revist Árvore, v.33, n.1, p.11-19, 2009. CASTRO, D. R.; GONZÁLEZ, O. J. Micropropgción de euclipto (Euclyptus grndis Hill ex Miden) en el sistem de inmersión temporl. Agricultur Técnic, v.62, n.1, p.68-78, 2002. CORREIA, D. et l. Efeito do meio de cultur líquido e sólido no desenvolvimento de gems de Euclyptus grndis x Euclyptus urophyll n multiplicção in vitro. IPEF, n. 48/49, p.107-116, 1995. DEL PONTE, E. M. et l. Multiplicção e enrizmento in vitro de Euclyptus gloulus susp. gloulus Lill. Revist Árvore, v.25, n.1, p.1-8, 2001. DISARZ, R.; CORDER, M. P. M. Multiplicção de gems xilres de cci mernsii de Wild. so diferentes meios de cultur. Revist Árvore, v.33, n.4, p.599-606, 2009. ETIENNE, H. et l. Biorectors in coffee micropropgtion. Brzilin Journl of Plnt Physiology, v.18, n.1, p.45-54, 2006. ETIENNE, H. et l. Improvement of somtic emryogenesis in Heve rsiliensis using the temporry immersion technique. In Vitro Cellulr nd Developmentl Biology Plnt, v.33, n.1, p.81-87, 1997. GASPAR, T. et l. Vitrifiction: morphologicl, physiologicl nd ecologicl spects. In: BONGA, J. M.; DURZAN, D. J. (Ed.). Cell nd tissue culture in forestry. Dordrecht: Mrtinus Nijhoff Pulishers, 1987. v.1. p.152-166. GASPAR, T. Vitrifiction in micropropgtion. In: BAJAJ, Y. P. S. (Ed.). Biotechnology in griculture nd forestry High-tech nd micropropgtion I. Berlin: Springer, 1991. v.17. p.116-126. GLOCKE, P. et l. Micropropgtion of juvenile tissue of Euclyptus erythronem x Euclyptus stricklndii cv. Urrre Gem. In Vitro Cellulr nd Developmentl Biology Plnt, v.42, v.1, p.139-143, 2006. GRAÇA, M. E. C. et l. Efeitos ds citocinins enzilmino purin e thidizuron, n multiplicção in vitro de rotções de Euclyptus dunnii Mid. Boletim de Pesquis Florestl, n.43, p.107-112, 2001. GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropgção. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultur de tecidos e trnsformção genétic de plnts. Brsíli: Emrp-SPI/EMBRAPA-CNPH, 1998. v.1. p.183-260. GUPTA, P. K.; TIMMIS, R. Mss propgtion of conifer trees in liquid cultures-progress towrds commerciliztion. Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, v.81, p.339-346, 2005.
Efeitos do meio de cultur e d relção... 1217 LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercilly fesile micropropgtion of mountin lurel, Klmi ltifoli, y use of shoot tip culture. Comined Proceedings of the Interntionl Plnt Propgtors Society, v.30, p.421-426, 1980. MAJADA, J. P. et l. Impct of culture vssel ventiltion on the ntomy nd morphology of micropropgted crntion. Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, v.63, p.207-214, 2000. McALISTER, B. et l. Use of the temporry immersion iorector system (RITA) for production of commercil Euclyptus clones in Mondi Forest (SA). Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, v.81, p.347-358, 2005. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rpid growth nd iossys with tocco tissue cultures. Physiologi Plntrum, v.15, n.3, p.473-497, 1962. NUNES, E. C. et l.. In vitro culture of Cedrel fissilis Vellozo (Melicee). Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, v.70, p.259-268, 2002. QUOIRIN, M.; LEPOIVRE, P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. Act Horticulture, v.78, p.437-442, 1977. REIS, J. P. et l. Micropropgção de euclipto no sistem de imersão temporári. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS, 1., 2003, Lvrs. Anis... Lvrs:2003. p.276. RIBAS, L. L. F. et l. Micropropgção de Aspidosperm polyneuron (pero-ros) prtir de segmentos nodis de muds juvenis. Revist Árvore, v.29, n.4, p.517-524, 2005. ROCHA, S. C. et l. Micropropgção de Crle cnjern. Revist Árvore, v.31, n.1, p.43-50, 2007. SANTOS-SEREJO, J. A. et l. Meios nutritivos pr micropropgção de plnts. In: SOUZA, A. S.; JUNGHANS, T. G. (Org.). Introdução à micropropgção de plnts. Cruz ds Alms: Emrp Mndioc e Fruticultur Tropicl, 2006. p.79-98. SOBROSA, R. C.; CORDER, M. P. M. Efeito do genótipo sore o potencil pr produção de gems e rízes dventícis em Euclyptus grndis Hill ex Miden in vitro. Florest e Amiente, v.10, n.1, p.58-68, 2003. SOUZA, F. V. D. et l. Micropropgção. In: SOUZA, A. S.; JUNGHANS, T. G. (Org.). Introdução à micropropgção de plnts. Cruz ds Alms: Emrp Mndioc e Fruticultur Tropicl, 2006. p.38-52. YADAV, M. K.; GAUR, A. K.; GARG, G. K. Development of suitle protocol to overcome hyperhydricity in crntion during micropropgtion. Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, v.72, p.153-156, 2003. ZIV, M. The control of iorrector environment for plnt propgtion in liquid culture. Act Horticulture, v.393, n.1, p.25-38, 1995. ZIV, M. Vitrifiction: morphologicl nd physiologicl disorders of in vitro plnts. In: DEBERGH, P. C.; ZIMMERMAN, R. H. (Eds.). Micropropgtion, technology nd pliction. Dordrecht: Kluwer Acdemic, 1991. p.45-69.
1218 OLIVEIRA, M.L. et l.