ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS COMPONENTES DA PORÇÃO MICROBIOTA DO HOLOGENOMA DO CACAUEIRO

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1 ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS COMPONENTES DA PORÇÃO MICROBIOTA DO HOLOGENOMA DO CACAUEIRO Natália Santos de Santana * Monita Fiori de Abreu Tarazi ** RESUMO Plantas e micro-organismos têm evoluído de maneira conjunta ao longo do tempo, e esta interação vem ganhando importância no cenário agronômico e ecológico. Nas relações simbióticas, a troca entre plantas e sua microbiota associada envolve nutrientes, proteção, mecanismos de defesa. O estudo da diversidade da microbiota (endofítica e exofítica) associada a plantas, como o cacaueiro, pode ser extremamente relevante para o entendimento da fisiologia geral e dos mecanismos que promovem equilíbrio biológico nas áreas produtoras de cacau. Nesse contexto, o presente projeto estudou a diversidade da comunidade bacteriana endofítica associada, a partir de folhas de cacaueiros provenientes de pomares clonais, mantidos em duas áreas distintas (rodeado por floresta madura ou por área antropizada). Utilizaram-se os iniciadores 16S (F8 e R357) para caracterizar a diversidade bacteriana. A partir dos resultados deste trabalho, o protocolo de testar o DNA genômico total será sempre adotado nos bancos de DNA disponíveis. Descobriu-se que apesar do DNA estar disponível em bancos de DNA, este pode se degradar rapidamente. O número de ciclos da PCR foi o fator que mais influenciou na amplificação da região 16S. Os amplicons produzidos neste estudo aguardam o sequenciamento para que haja finalmente a caracterização da diversidade endofítica. * Universidade Estadual de Santa Cruz, departamento de Ciências Biologicas, Ilhéus-BA. PALAVRAS-CHAVE: biologia Molecular, cacau, DNA, bactérias. 1 INTRODUÇÃO A Mata Atlântica da região sul da Bahia apresenta grande riqueza de espécies e alto grau de endemismo (FONSECA, 1985). O intenso desmatamento ocorrido na região nas últimas décadas fez com que as áreas de florestas ficassem extremamente reduzidas, ameaçando a conservação da biodiversidade nativa. O cacau firmou-se como principal atividade econômica na região, desde o século XIX e, graças ao sistema de cabruca, auxiliou a conservar parte da biodiversidade natural da região (MANDARINO, 1981). Contudo, ainda C&D-Revista Eletrônica da FAINOR, Vitória da Conquista, v.10, n.1, p , jan./abr

2 Natália Santos de Santana, Monita Fiori de Abreu Tarazi conta-se com outro grande problema que é a vassoura de bruxa, principal doença do cacaueiro (Theobroma cacao L.) no Brasil, podendo causar perdas de até 90 % na produção. O equilíbrio entre microorganismos patogênicos e não patogênicos é extremamente tênue. Muitos micro-organismos não patogênicos são importantes produtores de substâncias bioativas, estas geralmente são produtos do metabolismo secundário e não diretamente essenciais à sobrevivência do organismo, o que são de extrema importância na cultura do cacaueiro. Endófitos são micro-organismos que habitam o interior das plantas, sendo encontrados em órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes sem causar doenças e sem produzir estruturas externas visíveis (AZEVEDO et al., 2000). A comunidade endofítica é constituída principalmente por fungos e bactérias (PEIXOTO NETO et al., 2002). Muitas bactérias são promotoras de crescimento de plantas e antagonistas a fitopatógenos e têm sido estudadas para o desenvolvimento de produtos comerciais (WELLER et al., 2002), em razão de seu elevado potencial biotecnológico. A análise do gene de 16S rrna tem sido utilizada em estudos filogenéticos, pelo fato do gene estar presente em todas as bactérias (AMANN et al., 1995). Com o DNA genômico das bactérias contidas na folha é realizada a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR é um procedimento rápido, utilizado nas etapas de caracterização de bactérias endofíticas. Esta reação possibilita a amplificação in vitro de fragmentos de DNA específicos, partindo-se de uma quantidade mínima de DNA alvo ou de RNA previamente convertido em cdna (KOCAGÖZ et al, 1993). Para amplificar uma determinada região de DNA, são necessários dois iniciadores complementares das sequências que flanqueiam o fragmento. A DNA polimerase tem sua atuação nos seus terminais 3', permitindo a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA molde. Além de alta sensibilidade e especificidade, a PCR é capaz de produzir milhões de cópias da região alvo em algumas horas. A técnica de eletroforese em gel de agarose geralmente é realizada subsequente a técnica da PCR. A aplicação deste procedimento tem como principal objetivo propiciar a migração do DNA e de fragmentos amplificados da PCR (negativamente carregado) para o cátodo da cuba de eletroforese. A separação dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos é proporcionada pela concentração do gel de agarose e a consequente migração. Além disso, este procedimento é fundamental para comprovar se houve amplificação do fragmento desejado (LOPES,1984). O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias endofiticas, provenientes de folhas de cacaueiros por modos dependentes de cultivo e biologia molecular. 2 MATERIAL E MÉTODOS Realizou-se a quantificação de um banco de DNA de 38 bactérias endofíticas isoladas de folhas de cacaueiros (CCN-51), provenientes da Fazenda Almirante Cacau em Barro Preto e da Fazenda Jacy em Arataca, ambas localizadas no Estado da Bahia. Para comparar a quantidade existente de DNA do material, foi utlizado um DNA C&D-Revista Eletrônica da FAINOR, Vitória da Conquista, v.10, n.1, p , jan./abr

3 Análise da diversidade de bactérias componentes da porção microbiota do hologenoma do cacaueiro. Lamda (Invitrogen ) padrão de 10, 30 e 50 ng. Procedeu-se para uma eletroforese em gel de agarose a 0,8%, com tampão TBE 1X e o corante GelGreen para visualização e quantificação do DNA em um transiluminador a base de LED. Após a quantificação do material, foram realizadas doze reações de PCR com a finalidade de ajustar o protocolo padrão existente no laboratório para a diversidade endofítica do banco de DNA. O protocolo padrão era contituído dos seguintes reagentes e proporções demostrados na Tabela 1. Tabela 1. Protocolo padrão de reagentes para a amplificação da região 16S Reagente Reagente Estoque C1 Reação C2 H2O Mili Q ,05 µl Tampão da Taq 1X 2,5 µl MgCl2 1,5mM 0,75 µl dntps 0,2mM 2,5 µl Primer F 0,4 pmol 0,5 µl Primer R 0,4 pmol 0,5 µl Taq Polimerase 1U/reação 0,2µl DNA 10 ng/µl 2 µl Volume Final µl Para o estabelecimento do novo protocolo, foi necessário eluir e diluir os iniciadores (primers) 16S F8 e R518. O primer foi eluído em TE (10 mm Tris, 1mM EDTA) para a concentração estoque de 100 µm e depois diluído em água ultrapura autoclavada para 10 µm. Foram testados protocolos diferentes para a PCR, modificando o número de ciclos do termociclador (Tabela 2) e a quantidade de DNA específico para cada isolado. Tabela 2. Protocolo padrão para o programa do termociclador para a amplificação da região 16S. Temperatura Tempo (C ) 94 C 3 min 25 ciclos 94C 30 s 57 C 30 s 72 C 1 min 72 C 10 min 4 C Até a retirada do material Após as amplificações, foram realizadas eletroforeses em gel de agarose a 1,5%, com tampão TBE 1X e o corante GelGreen para visualização e separação dos amplicon gerados em um transiluminador a base de LED. Todo o material está estocado em microtubos de 2,0 ml no freezer dentro do Centro de Biotecnologia e Genética da Universidade Estadual de Santa Cruz, aguardando sequenciamento. 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES Obteve-se DNA de 35 das 38 bactérias (Figura 1). A concentração de DNA variou de 5 a 70 ng (Tabela 3). C&D-Revista Eletrônica da FAINOR, Vitória da Conquista, v.10, n.1, p , jan./abr

4 Natália Santos de Santana, Monita Fiori de Abreu Tarazi Figura 2. Resultados negativos da PCR das primeiras 25 amostras de bactérias endofíticas de cacaueiro. O protocolo com 30 ciclos funcionou para todas as quantidades de DNA colocadas na reação (Figura 3). Desta forma, o problema não estava no DNA, mas sim na quantidade de ciclos. Figura 1. Eletroferese do DNA genômico das 38 amostras de bactérias endofíticas de folhas de cacaueiros. A1 a A38 são as amostras das bactérias alvo.λ10, λ30 e λ50 são as concentrações de DNA conhecidas. Tabela 3. Concentração de bactérias endofíticas de folhas de cacaueiros provenientes de um banco de DNA da UESC. O protocolo com 25 ciclos não funcionou para as reações testadas durante a execução da PCR, mesmo modificando a quantidade de DNA colocado na reação (Figura 2). Figura 3. Resultados positivos da PCR 8 amostras de bactérias endofíticas de cacaueiro. CN é o controle e CP é o controle positivo. Sugere-se, com base nos resultados, testar o DNA do banco, antes de começar qualquer trabalho com biologia molecular, pois o DNA pode ter degradado durante o armazenamento. Testando o DNA, antes da PCR, economiza dinheiro com reações que podem não ter funcionado por causa do DNA degradada. O número de ciclos interferiu na amplificação da região 16S, porque, inicialmente, as sequências de genes de rrna 16S contêm regiões hipervariáveis, que podem proporcionar as espécies específicas sequências de assinatura útil para a identificação de bactérias; a eficência média de amplificação é 0,85. Pequenas alterações para menos no número de ciclos no processo da PCR podem fazer com que o produto não seja detectado. (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001 apud KOCAGOZ, 1993). Espera-se, com o sequenciamento dos isolados, descobrir redundância no banco de DNA de bactyeria endofiticas, além de conhecer a sua diversidade. Espera-se que este trabalho possa ser útil futuramente para equlibrar a microbiota do cacaueiro e torná-lo mais C&D-Revista Eletrônica da FAINOR, Vitória da Conquista, v.10, n.1, p , jan./abr

5 Análise da diversidade de bactérias componentes da porção microbiota do hologenoma do cacaueiro. resistente a ataques de outros patógenos. Como há casos de Moniliase (Moniliophthora roreri (Cif.) H.C. Evans,Stalpers, Samson & Benny), uma doença de grande impacto no Equador, Colômbia e Peru, sendo inclusive considerada limitante à expansão da cultura do cacaueiro (ALBUQUERQUE et al., 2005 apud ARAÚJO, 2009). No Brasil, embora não tenha sido detectada até o momento, apresenta-se como uma séria ameaça, uma vez que levantamentos mais recentes constataram a doença na fronteira do Brasil com o Peru (próximo do estado do Acre). realidade laboratorial. O ajuste do protocolo para reações de PCR é um processo moroso. O DNA desnatura facilmente e este deve ser sempre testado antes de iniciar um novo trabalho com técnicas de biologia molecular. CONCLUSÕES Existe uma dificuldade na adapatação dos protocolos existentes para PCR, presentes na literatura para a ANALYSIS OF THE DIVERSITY OF BACTERIA COMPONENTS OF THE MICROBIOTA PORTION OF THE CACAO HOLOGENOMA ABSTRACT Plants and micro-organisms have evolved jointly over time, and this interaction is becoming increasingly important in agronomic and ecological setting. In symbiotic relationships, the exchange between plants and their associated microbiota involves nutrients, protection, defense mechanisms. The study of the diversity of microbiota (endophytic and exophytic) associated with plants such as cocoa, can be extremely relevant to the understanding of the general physiology and mechanisms that promote biological balance in the producing areas of cocoa. In this context, this project studied the diversity of endophytic bacterial community associated, from cocoa leaves from clonal orchards kept in two distinct areas (surrounded by mature forest or anthropic area). the 16S primers were used (F8, and R357) to characterize bacterial diversity. From the results of this study, the protocol to test the Total genomic DNA will always be adopted in DNA banks available. It was found that the DNA seize be available DNA databases, this may degrade rapidly. The number of PCR cycles was the factor that most influenced the amplification of the 16S region. The amplicons produced in this study are awaiting sequencing so that finally there is the characterization of endophytic diversity. KEYWORDS: Molecular biology, cocoa, DNA, bacteria. C&D-Revista Eletrônica da FAINOR, Vitória da Conquista, v.10, n.1, p , jan./abr

6 Natália Santos de Santana, Monita Fiori de Abreu Tarazi Artigo recebido em 13/09/2016 e aceito para publicação em 31/12/2016 REFERÊNCIAS ARAUJO, F Uso de Bacillus subtilis no controle da meloidoginose e na promoção do crescimento do tomateiro. Santa Maria: Ciência Rural. KOCAGOZ, T Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure. Journal of Clinical Microbioly. LACAVA, P Caracterização da comunidade bacteriana endofítica de citros por isolamento, PCR específico e DGGE.Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília. REIS, F Ocorrência de Bactérias Diazotróficas em diferentes genótipos de cana de açúcar. Pesquisa Agropecuária Brasileira. SAMBUICHI, H Ecologia da vegetação arbórea de cabruca-mata Atlântica raleada utilizada para cultivo de cacau na região sul da Bahia. Universidade de Brasília, Brasília. SILVANO, L Diversidade e distribuição de anfíbios na Mata Atlântica do Sul da Bahia. UFRJ, Rio de Janeiro. C&D-Revista Eletrônica da FAINOR, Vitória da Conquista, v.10, n.1, p , jan./abr