Palavras-chave:Zoonose. Diagnóstico Molecular. Doença Infecciosa. Keywords:Zoonosis. Molecular Diagnosis. InfectiousDisease.

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1 PREVALÊNCIA DE Ehrlichia chaffeensis EM CÃES DA CIDADE DE ITUBERÁ, BA, BRASIL Jéssica Fontes VELOSO 1 ; Leonardo SAUER²; Thais Nascimento de Andrade OLIVEIRA 1 ; Paula Elisa Brandão GUEDES 1 ; Fabiana Lessa SILVA 3 ; Renata Santiago Alberto CARLOS 3 1 Doutorandas do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia. jessicaveloso@live.com ² Estudante de graduação de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia. 3 Docentes do Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais (DCAA), Curso Medicina Veterinária, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia. Resumo As bactérias do gênero Ehrlichia são gram negativas, estritamente intracelulares. Nos cães, a erliquiose monocítica canina (EMC), é associada a E. canis, enquanto que em humanos uma das espécies causadoras da Erliquiose Humana é a E. chaffeensis, podendo esta última infectar também canídeos e ruminantes. Até o momento nenhuma pesquisa no país conseguiu identificar a E. chaffeensis em cães. O presente estudo teve como objetivo pesquisar a presença de E. chaffeensis por PCR em sangue de cães da cidade de Ituberá, Bahia. Após análise de 395 cães adultos domiciliados, nenhum animal apresentou positividade, porém deve se manter métodos efetivos de diagnóstico e vigilância ativa para a doença, já que a mesma pode surgir de forma emergente. Palavras-chave:Zoonose. Diagnóstico Molecular. Doença Infecciosa. Keywords:Zoonosis. Molecular Diagnosis. InfectiousDisease. Introdução A erliquiose é uma importante doença infecciosa, causada por bactérias gram negativas, estritamente intracelulares. Nos cães, a erliquiose monocítica canina (EMC), é associada a E. canis, enquanto que em humanos uma das espécies causadoras da Erliquiose humana é a E. chaffeensis, podendo esta última infectar também canídeos e ruminantes. Até o momento nenhuma pesquisa no país conseguiu identificar a E. chaffeensis em cães. Em 1987 foi identificado E. chaffeensis como causadora da erliquiose monocítica humana (ANDERSON et al., 1991), indicando não só um importante problema veterinário, como também de saúde pública. ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0430

2 Segundo a Organização Pan-americana de Saúde (OPAS, 2004), E. chaffeensis tem como vetores os carrapatos das espécies Amblyomma americanum, Dermacentor variabilise Ixodes pacificus, que parasitam cães e outros animais, incluindo o homem. Ainda segundo a OPAS (2004), a infecção por E. chaffeensis é uma doença multisistêmica que ameaça a vida humana, e se manifesta como uma doença tóxica, síndrome de angústia respiratória adulta, ou meningoencefalite nos casos mais graves. Devido a escassez de estudos epidemiológicos e trabalhos relacionados a presença do agente E. chaffeensis no Brasil, é de extrema importância voltar a pesquisa a este agente etiológico, visto que sua incidência em outros países é considerável, sendo nos Estados Unidos da América durante os anos de 2000 a 2007 confirmados 3126 casos de Erliquiose Humana (DAHLGREN et al., 2011).É possível que casos de erliquiose causada por E. chaffeensis estejam passando despercebidos pela rotina clínica veterinária, podendo gerar também um problema de saúde pública pelo fato de haver relatos de sua transmissão para o ser humano. Diante de tais fatos, a pesquisa de E. chaffeensis em cães, potenciais reservatórios da doença, pode render dados epidemiológicos importantes. A reação de nested PCR tem sido utilizadade forma ampla para o diagnóstico das espécies de Ehrlichia incluindo E. chaffeensis. É considerado um método sensível e específico para determinar a positividade nesses casos (LA SCOLA e RAOULT, 1997; NAKAGHI et al., 2008). O estudo teve como objetivo pesquisar a presença de Ehrlichia chaffeensis por PCR em amostrasde sangue venoso de cães da cidade de Ituberá, Bahia. Metodologia O estudo foi realizado no município de Ituberá, situado na região do Sul da Bahia. Fizeram parte desse estudo 395 cães adultos domiciliados dos quais foram coletados 4 ml de sangue venoso com EDTA durante visitas domiciliares. As coletas foram distribuídas homogeneamente pelos bairros do município, abrangendo tanto a zona rural quanto a urbana. O material coletado foi acondicionado em caixas isotérmicas com gelo reciclável, até o encaminhamento ao Laboratório de Genética Animal do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). As amostras foramdestinadas à Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), para o diagnóstico molecular de erliquiose e foram processadas para extração de DNA a ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0431

3 partir das capas leucocitárias com o kit Easy-DNA (Invitrogen ) e estocado à temperatura de -20 C. Na primeira etapa de amplificação do DNA do gênero Ehrlichia foram utilizados os primers ECC (5-AGAACGAACGCTGGCGGCAAGC-3) e ECB (5- CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3), que amplificaram parte do gene 16S rrna de Ehrlichia spp. Posteriormente, para identificação da espécie Ehrlichia chaffeensis foram utilizados os primers HE1 (5 -CAA TTG CTT ATA ACC TTT TGG TTA TAA AT-3 ) e HE3 (5 -TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAT- 3 ). Para cálculo do MIX da PCR foi utilizado 5µL de DNA purificado, 0.4mM de cada primer (ECC e ECB), 200mM de cada dntp, 5mM de MgCl2, 1.6x de buffer para PCR (Invitrogen ) e 2,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen ), obtendo um volume total final de 25 µl. A programação utilizada no termociclado rapplied Biosystems ProFlex PCR System para identificação da sequência genética do gênero Ehrlichia spp., consistiu da desnaturação por 5 min a 94 C, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 94 C por 1 min, anelamento a 68 C por 1 min e 30s, e, por fim, extensão a 72 C por 2 min. Para a nested PCR, foi então utilizado 1µL do amplicon resultante da primeira reação de PCR e, foram utilizados 0.2mM de cada primer HE1 e HE3 para identificar a sequência genética da Ehrlichia chaffeensis. Na programação do termociclador para a segunda reação consistiu de desnaturação por 3 min a 94 C, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 94 C por 1 min, anelamento a 55 C por1 min e 30s, e extensão a 72 C por 1 min e 30s (KOCAN et al., 2000). Os produtos da PCR foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose a 2% corados com SYBR Green (1µL/10mL) em tampão de corrida. A verificação da presença de bandas foi realizada com o auxílio de transiluminador. O controle positivo para E. chaffeensis foi cedido pela Prof.ª Rosângela Zacharias Machado, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Campus de Jaboticabal. Como controle negativo da reação, foi utilizada água ultrapura. Resultados e discussão Dos 395 cães avaliados, nenhum animal apresentou positividade para E. chaffeensis. Até o momento, não há estudos que comprovem a presença deste patógeno em cães no Brasil, sendo, portanto, identificado apenas em cervos do pantanal que se infectaram naturalmente, sugerindo que os mesmos sejam potenciais reservatórios da doença (MACHADO et al., 2006). Os dados obtidos com ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0432

4 a pesquisa determinaram a ausência de um de E. chaffeensis infectando cães na região sul da Bahia, o que corrobora com a ausência na literatura de descrição e diagnóstico de infecção pelo patógeno em canídeos provenientes em outras regiões do território brasileiro. Estudos devem ser continuados no intuito de identificar essa bactéria com potencial zoonótico em cães, estabelecendo métodos efetivos de diagnóstico e vigilância ativa para a doença, já que a mesma pode surgir de forma emergente. Conclusão A partir dos resultados obtidos com este trabalho, conclui-se que no município de Ituberá, Bahia, não há a positividade para de E. chaffeensis nas amostras de cães na amostragem estudada. Referências bibliográficas ANDERSON, B.E; DAWSON, J. E.; JONES, D. C.; WILSON, K. H. Ehrlichia chaffeensis, a New Species Associated with Human Ehrlichiosis. Journal of Clinical Microbiology, v.29, n.12, p , DAHLGREN, F. S; MANDEL, E. J.; KREBS, J. W.; MASSUNG, R. F.; MCQUISTON, J. H.Increasing Incidence of Ehrlichia chaffeensis and Anaplasma phagocytophilum in the United States, The American Journalof Tropical Medicine and Hygiene. V. 85, n. 1, p , KOCAN, A.; LEVESQUE, G. C.; WHITWORTH, L. C.; MURPHY, G. L.; EWING S. A.; BARKER, R. W. Naturally Occurring Ehrlichia chaffeensis Infection in Coyotes from Oklahoma. Emerging Infectious Diseases,v.6, n. 5, LA SCOLA, B.; RAOULT, D. Laboratory diagnosis of rickettsiosis: current approach to diagnosis of old and new rickettsial disease. Journal of Clinical Microbiology, v. 35, p , MACHADO, R. Z.; DUARTE, J. M. B.; DAGNONE, A. S.; SZABO, M. P. J. Detection of Ehrlichia chaffeensis in Brazilian marsh deer (Blastocerusdichotomus).Veterinary Parasitology, v.139, p , NAKAGHI, A., MACHADO, R., COSTA, M.T., ANDRÉ, M.R., BALDANI, C. Canine ehrlichiosis: clinical, hematological, serological and molecular aspects. Ciência Rural. v. 38, p , ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0433

5 SILVA, M. V. M.; FERNANDES, R. A.; NOGUEIRA, J. L.; AMBRÓSIO, C. E. Erliquiose canina: revisão de literatura. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia, v.14, n. 2, p , WALKER, D.H. Situação atual e tendências das Rickettsioses nas Américas. In: Consulta de Especialistas OPAS/OMS sobre Rickettsioses nas Américas Unidade de Saúde Pública Veterinária OPAS/OMS: Ouro Preto-MG. ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0434