DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BARTONELOSE EM MACACOS BUGIOS DE CATIVEIRO NO ESTADO DE SÃO PAULO

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1 XIII CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BARTONELOSE EM MACACOS BUGIOS DE CATIVEIRO NO ESTADO DE SÃO PAULO MOLECULAR DIAGNOSIS OF BARTONELLOSIS IN HOWLER MONKEYS IN THE STATE OF SÃO PAULO Cristiane Maria Fernandes de Melo (1) Natalia Serra Mendes (2) Jorge Alfonso Morales-Donoso (3) Victória Valente Califre de Mello (4) Simone de Jesus Fernandes (5) Inalda Angelica de Souza Ramos (6) Marcos Rogério André (7) Márcia Ferreira da Rosa Sobreira (8) 1 Resumo O objetivo deste trabalho foi realizar a detecção molecular de Bartonella spp. em amostras de sangue de macacos bugios, pela PCR convencional (cpcr), baseados no fragmento gênico, gene citrato-sintase (glta). O experimento foi realizado em zoológicos e criatórios de primatas no Estado de São Paulo. Foram colhidas amostras de sangue de 50 macacos bugios, através da veia cefálica, em tubos de ensaio com EDTA e submetidas ao congelamento de 80 C. Após a extração de DNA, realizou-se ensaios de cpcr para o fragmento gênico (350 pb) do gene glta de Bartonella spp. De 50 macacos bugios avaliados, nenhum animal amostrado mostrou-se positivo para Bartonella spp. Palavras-chave: Bartonella, Primatas, PCR Abstract The objective of this work was to perform the molecular detection of Bartonella spp. In blood samples from howler monkeys by conventional PCR (cpcr), based on the gene fragment, citrate synthase gene (glta). The experiment was carried out in zoos and primate breeding in the State of São Paulo. Blood samples were collected from 50 howler monkeys through the cephalic vein in EDTA test tubes and subjected to 80 C freezing. After DNA extraction, 1 Doutoranda no Programa de Medicina Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castelane, S/N - Vila Industrial, Jaboticabal - SP, , E- mail: crisalicemelo@gmail.com, Tel: (16) ; 2. Mestranda no Programa de Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP); 3 Mestre em Genética e Melhoramento Animal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), 4 Mestranda no Programa de Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), 5 Mestranda no Programa de Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), 6 Doutoranda no Programa de Medicina Veterinária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), 7 Professor Doutor no Departamento de Patologia Animal, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) 8 Professora Doutora de Patologia Clínica no Centro Universitário Moura Lacerda, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP). Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 9,2017. Número especial. (ISNN ).

2 cpcr assays were performed for the gene fragment (350 bp) of the glta gene of Bartonella cephalic vein in EDTA test tubes and subjected to 80 C freezing. After DNA extraction, cpcr assays were performed for the gene fragment (350 bp) of the glta gene of Bartonella spp. Of 50 howler monkeys evaluated, no sampled animals were positive for Bartonella spp. Keywords: Bartonella, Primates, PCR. 1. Introdução Bartonella spp. são hemoparasitas de ampla variedade de hospedeiros, tendo vários mamíferos como reservatórios, e vários membros do gênero são patógenos de importância médica e veterinária (HUANG et al., 2011). São classificados como bacilos aeróbicos, fastidiosos, gram-negativos (ZEAITER et al., 2002). Diante disto, o trabalho teve como objetivo realizar a detecção molecular de Bartonella spp. em macacos bugios de cativeiro no Estado de São Paulo. 2. Materiais e Métodos Este estudo foi aprovado pelo Sistema de Autorização da Biodiversidade (SISBIO, n de cadastro: ) e pelo Comitê de Ética de Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual Paulista-Júlio de Mesquita (protocolo: 5.595/16). No período de abril de 2016 a fevereiro de 2017, colheu-se sangue 50 macacos bugios Alouatta no Estado de São Paulo, em criatórios e Zoológicos, que atuam como CETAS (Centro de Triagem de Animais Selvagens) e recebem animais apreendidos pela polícia ambiental: Projeto Mucky (Itu), nos zoológicos de Sorocaba, Guarulhos, Ilha Solteira, Catanduva, Olímpia, Guaíra, Ribeirão Preto, CEMPAS Botucatu. Após a captura, os animais foram sedados com Zoletil (50 mg/kg) e realizada a antissepsia da região da veia cefálica com chumaço de algodão embebido em álcool iodado, para coleta de 5 ml de sangue através de punção venosa e aspiração em seringas descartáveis, submetidas ao congelamento de - 80 C. Depois de cada coleta, foi realizada a extração de DNA genômico com o Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Valência, Califórnia, USA), de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, as amostras foram submetidas à PCR convencional, analisando-se o gene endógeno, GAPDH (450 pb), utilizando os oligonucleotídeos iniciadores GAPDH-F (5 - CCTTCATTGACCTCAACTACAT-3 ) e GAPDH-R (5 - CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3 ), e as seguintes concentrações de reagentes: 5 μlde

3 DNA alvo, tampão da PCR (PCR Buffer 10X- 100nM Tris-HCl, ph 9,0, 500 mm KCl), 1,0 mm Cloreto de Magnésio (Life Technologies ), 0,6 mm deoxinucleotídeos (dntps), 1,5 U Taq DNA Polymerase (Life Technologies ), 1,25 μl de Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich ). Os ciclos de amplificação foram de: 94ºC por 5 minutos, seguidos por 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto, seguido por uma extensão final a 72ºC por 5 minutos (BIRKENHEUER et al., 2003). Posteriormente, as amostras positivas no gene endógeno, foram submetidas a ensaios de cpcr para o fragmento gênico: glta de Bartonella spp. (NORMAN et al., 1995 e BIRTLES e RAOULT, 1996), com utilização na PCR de 0.5 µm de cada oligonucleotídeo iniciador, (BhCS.1137 (AATGCAAAAAGAACAGTAAACA) e CSH1f (GCGAATGAAGCGTGCCTAAA), 5 µl de DNA, 25 µl de buffer, 1.0 mm MgCl2, 0.8 mm deoxynucleotide triphosphate (dntps), 1.0 U Taq DNA Polymerase (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), para controle positivo utilizou-se uma amostra sabidamente positiva de obtido de um felino naturalmente infectado (número de acesso no GenBank: KC331015) e para controle negativo foi utilizado 5 µl de água ultrapura esterelizada. As amostras foram posteriormente submetidas a reação no termociclador. Os produtos amplificados por meio dos ensaios de cpcr foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,0% corado com brometo de etídeo (0,5 μl/ml) em tampão de corrida TEB ph 8,0 (44,58 M Tris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mm EDTA). A eletroforese foi realizada a 90V/150mA durante 60 minutos. Para a determinação dos produtos, foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 pares de base (Life Technologies ). Os resultados foram visualizados e analisados por meio de um transiluminador de luz ultravioleta (ChemiDoc MP Imaging System, Bio Rad ). 3. Resultados e Discussão Todos os 50 macacos bugios avaliados mostraram-se negativos para Bartonella spp. Li et al., (2013), trabalhando com Macaca mulatta e Macaca fascicularis na China, detectaram Bartonella quintana, por meio da PCR, sendo amostras positivas para o gene glta. No Japão, Sato et al., (2015), descreveram em Macaca fusca a infecção por Bartonella quintana, onde os animais apresentaram bacteremia alta, mesmo sem apresentar sinais clínicos. Na África Ocidental, Bittar et al., (2014), detectaram Bartonella spp. em Gorilla

4 gorilla gorilla, sugerindo que estes animais atuam como reservatórios. No Brasil, Bonato et al., (2015), ao amostrarem primatas na Amazônia, detectaram amostras negativas, sendo através da PCR em tempo real, relacionadas ao gene NuoG. Estudo em seres humanos, com amostras de sangue no Brasil, mostraram que 3% dos indivíduos eram bacterêmicos para Bartonella spp., quando testado por um líquido de enriquecimento de cultura antes da realização da PCR (PITASSI et al., 2015). A cultura líquida em placas de ágar, seguida por amplificação de DNA utilizando PCR pode facilitar o crescimento e detecção de tipos selvagens específicos de Bartonella (DUNCAN et al., 2007). 5. Conclusão Este trabalho contribuiu na busca de possíveis reservatórios de Bartonella spp. em diferentes localidades do Estado de São Paulo, podendo-se confirmar através da PCR convencional, que as amostras colhidas foram negativas, em relação a estas localidades. Outro método que poderia ser empregado para diagnóstico seria o isolamento e cultivo dos agentes em questão, contribuindo para uma melhor caracterização molecular e antigênica dos patógenos, através de estudos futuros. Apoio Financeiro: Fundação CAPES, Ministério da Educação. Referências BIRKENHEUER, A. J.; LEVY, M. G.; BREITSCHWERDT, E. B. Development and evaluation of a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni (Asian genotype) and B. canis DNA in canine blood samples. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 41, n.9, p , BIRTLES, R.J.; RAOULT, D. Comparison of partial citrate synthase gene (glta) sequences for phylogenetic analysis of Bartonella species. Int. J. Syst. Bacteriol, v. 46, p , 1996.

5 BITTAR, F.; KEITA, M.B.; LAGIER, J-C.; PEETERS, M.; DELAPORTE, E; RAOULT, D. Gorilla gorilla gorilla gut: a potential reservoir of pathogenic bacteria as revealed using culturomics and molecular tools. Scientific Reports, v.4, p.7174, BONATO, L.; FIGUEIREDO, M.A.P.; GONÇALVES, L.R.; MACHADO, R.Z.; ANDRÉ, M.R. Occurrence and molecular characterization of Bartonella spp. and hemoplasmas in neotropical primates from Brazilian Amazon. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v. 42, p , DUNCAN, A.W.; MAGGI, R.G.; BREITSCHWERDT, E.B. A combined approach for the enhanced detection and isolation of Bartonella species in dog blood samples: pre-enrichment liquid culture followed by PCR and subculture onto agar plates. J. Microbiol. Methods, v.69, p , LI, H.; BAI, J-Y.; WANG, L-Y.; ZENG, L.; SHI, Y-S.; QIU, Z-L.; YE, H-H.; ZHANG, X-F.; LU, Q-B.; KOSOY, M.; LIU, W., CAO, W-C. Genetic diversity of Bartonella quintana in macaques suggests zoonotic origin of trench fever. Molecular Ecology, v.22, p NORMAN, A.F.; REGNERY, R.; JAMESON, P.; GREENE, C.; KRAUSE, D.C. Differentiation of Bartonella-like isolates at the species level by PCR-restriction fragment length polymorphism in the citrate synthase gene. Journal of Clinical of Microbiology, v. 33, p , PITASSI, L.H.; PAIVA DINIZ, P.P.; SCORPIO, D.G.; DRUMMOND, M.R.; LANIA, B.G.; BARJAS-CASTRO, M.L.; GILIOLI, R.; COLOMBO, S.; SOWY, S.; BREITSCHWERDT, E.B.; NICHOLSON, W.L.; VELHO, P.E. Bartonella spp. bacteremia in blood donors from Campinas, Brazil. PLoS Negl Trop. Dis., v.9, n.1, SATO, S.; KABEYA, H.; YOSHINO, A.; SEKINE, W.; SUZUKI, W.; TAMATE, H.B.; YAMAZAKI, S.; CHOMEL, B.B.; MARUYAM, S. Japanese macaques (Macaca fuscata) as natural reservoir of Bartonella quintana. Emerging Infectious Diseases, v. 21, n.2, 2015.