PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DOS GENES DAS ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS A, B, C e D DE Staphylococcus aureus ISOLADOS DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

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1 PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DOS GENES DAS ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS A, B, C e D DE Staphylococcus aureus ISOLADOS DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL ZOCCHE, Fernando 1*, FRANÇA, Rodrigo Correa 2, SILVA, Wladimir Padilha 3 1 Doutorando em Ciência e Tecnologia Agroindustrial PPGCTA FAEM UFPel 2 Aluno de Medicina Veterinária Bolsista de Iniciação Científica da FAPERGS 3 Professor Doutor PPGCTA FAEM UFPel 1,2,3 Laboratório de Microbiologia de Alimentos MICROBIAL - * zocche@ufpel.edu.br 1. INTRODUÇÃO Entre as bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus, S. aureus é a espécie mais envolvida com intoxicação alimentar estafilocócica e, por muitos anos, foi a única relacionada com produção de enterotoxinas estafilocócicas (EE), as quais são proteínas tóxicas que, quando ingeridas com o alimento, podem provocar doença. Os sintomas clássicos da intoxicação estafilocócica são náuseas, vômitos, câimbras abdominais, diarréia, dores de cabeça, sudorese e prostração, que aparecem, em média, cerca de 4 horas após a ingestão dos alimentos e que possuem duração de 24 a 48 horas. Staphylococcus aureus pode produzir uma ou mais EE simultaneamente (Silva et al., 2005) e, apesar deste patógeno ser produtor de uma grande variedade de EE, 95% dos surtos são causados por enterotoxina estafilocócica A (EEA), EEB, EEC, EED e EEE (Letertre et al., 2003). Técnicas baseadas na manipulação do material genético são alternativas para a detecção e identificação de bactérias patogênicas oriundas de alimentos. Uma das mais utilizadas é o PCR multiplex (mpcr), a qual utiliza mais de um par de primers na mesma reação, permitindo a detecção de mais de um gene e/ou mais de uma bactéria simultaneamente. Esta técnica é mais sensível, específica e rápida que as técnicas tradicionais comumente utilizadas na pesquisa de S. aureus (Nájera-Sanchez et al., 2003). Considerando a grande aplicabilidade do mpcr, e a importância da determinação do tipo de EE como fator relevante na avaliação epidemiológica de casos e surtos de intoxicação estafilocócica, objetivou-se avaliar duas reações mpcr para a detecção de genes de EE de S. aureus isolados de alimentos de origem animal. 2. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados 20 isolados de Staphylococcus aureus oriundos de alimentos de origem animal, identificados através da produção da coagulase, β-galactosidase e catalase, coloração por Gram e resistência à acriflavina, conforme descrito por Lancette & Benett (2001) e Gandra et al. (2003).

2 A extração de DNA genômico dos isolados de S. aureus foi realizada de acordo com o protocolo proposto por Matthews et al. (1997). Para a reação mpcr foram preparados 2 conjuntos. Para o primeiro conjunto, foram utilizados 1µL do DNA extraído (10 a 20ng. µl -1 ), 2,5µM de dntp mix, 1U de Taq DNA polimerase, 50mM de MgCl 2, água ultra pura esterilizada (qsp) e tampão 10X para PCR, 10µM de cada conjunto de primers ESA1 e 2, ESB1 e 2, fema1 e A2, descritos na Tabela 1, perfazendo um total de 40µL por reação. Para o segundo conjunto foram utilizadas as mesmas concentrações e volumes dos reagentes do primeiro conjunto, com exceção dos primers ESA1 e 2 e ESB1 e 2, que foram substituídos pelos primers SEC1 e 2 e SED1 e 2, descritos na Tabela 1. Os dois conjuntos foram submetidos a 95ºC por 5 minutos e, posteriormente, termociclados por 37 ciclos, onde cada ciclo consistia de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 44,5ºC, e 1 minuto a 72ºC, finalizando com uma extensão à 72ºC por 10 minutos. Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a identificação de S. aureus enterotoxigênicos e respectivos produtos de amplificação Primers Seqüência 5 3 Posição no gene Produto de amplificação (pb 1 ) ESA1* ACG ATC AAT TTT TAC AGC 203 a 222 ESA2* TGC ATG TTT TCA GAG TTA ATC 726 a ESB1* GAA TGA TAT TAA TTC GCA TC 621 a 640 ESB2* TCT TTG TCG TAA GAT AAA CTT C 1015 a SEC1** GAC ATA AAA GCT AGG AAT TT 676 a 695 SEC2** AAA TCG GAT TAA CAT TAT CCA 912 a SED1 CAA ATA TAT TGA TAT AAT GA 4 a 23 SED2 AGT AAA AAA GAG TAA TGC AA 314 a fema1 a AAA AAA GCA CAT AAC AAG CG 1444 a 1463 fema2 a GAT AAA GAA GAA ACC AGC AG 1556 a Fonte: * Rosec e Gigaud (2002); **Nájera-Sanchez et al. (2003); 1 pares de base; a Mehrotra et al. (2000). Em todas as reações mpcr foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores fema1 e fema2 para a amplificação do gene fema, um gene espécie-específico que codifica para uma proteína envolvida na resistência do microrganismo à meticilina e que está presente universalmente em S. aureus. Os primers fema1 e fema2 foram adicionados em todas as reações, conferindo um controle interno (IAC) não competitivo à reação (Hoorfar et al., 2004), minimizando as possibilidades de resultados falso negativos. Como controles positivos, foram utilizados DNAs de cepas padrão de Staphylococcus aureus FRIS6 (produtor de enterotoxinas A e B) e Staphylococcus aureus FRI361 (produtor de enterotoxinas C e D). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os fragmentos dos genes de EEA, EEB e FemA foram corretamente amplificados no mpcr através do primeiro conjunto de reação, o mesmo ocorrendo no segundo conjunto, onde os fragmentos dos genes de EEC, EED e FemA, também foram amplificados. Os produtos da amplificação destes fragmentos podem ser observados na Figura 1.

3 sea (544 pb) seb (416 pb) fema (132 pb) 100 pb sed (330 pb) sec (257 pb) Figura 1: produtos de PCR visualizados em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo. Pistas 1 e 2: amplificações simultâneas obtidas com os primers ESA1 e 2, ESB1 e 2, fema1 e 2 e DNA de S. aureus FRI S6; Pistas 3 e 4: amplificações simultâneas obtidas com os primers SEC1 e 2, SED1 e 2, fema1 e 2 e DNA de S. aureus FRI 361; 5: marcador de massa molecular 100 pb. Após a padronização das reações mpcr, 20 isolados de S. aureus foram avaliados quanto à presença de genes de enterotoxinas. Do total analisado (n=20), foi possível amplificar o gene fema em 100% dos isolados, permitindo uma correta identificação do microrganismo, no entanto, apenas 6 isolados (30%) albergavam um ou mais genes de enterotoxinas simultaneamente. Os resultados do mpcr podem ser observados na Tabela 2. Tabela 2: Presença de genes de EE em S. aureus isolados de alimentos Isolado mpcr para detecção do gene a sea seb sec Sed fema R R R R R R a Reação positiva (+) indicada através de amplificação específica do fragmento do gene. Diversos estudos foram conduzidos através de PCR multiplex para a detecção de cepas enterotoxigênicas de Staphylococcus aureus, na tentativa de estabelecer possíveis fontes de contaminação dos alimentos. Sharma et al. (2000) e Nájera- Sanchez et al. (2003), observaram presença simultânea dos genes sea e seb em reação mpcr, resultado semelhante ao encontrado neste estudo, e relacionaram a presença destes genes com S. aureus de origem humana. Entretanto, ao contrário do desenvolvido neste estudo, esses autores não utilizaram um controle interno de reação, o que segundo Hoorfar et al. (2004), é imprescindível no desenvolvimento de técnicas moleculares de diagnóstico que envolvam PCR. Nájera-Sanchez et al. (2003), trabalhando com S. aureus isolados de alimentos no México, desenvolveram duas reações mpcr para detecção dos genes de EEA,

4 EEB, EEC, EED e EEE. Esses autores relacionaram a presença de S. aureus de origem bovina e suína com os genes sec e sed, respectivamente, e buscaram a detecção simultânea destes genes, o que também foi desenvolvido neste trabalho, e consideram que, quando vários pares de primers são utilizados simultaneamente, um ou mais fragmentos de genes podem não ser amplificados, prejudicando dessa forma, a reação. Silva et al. (2005) também desenvolveram com sucesso duas reações mpcr para detecção dos genes sea, seb e sec em S. aureus, utilizando o gene fema como controle interno da reação. Esses autores buscaram a detecção de sea e seb simultaneamente, no entanto, a avaliação da presença do gene sec não foi realizada na mesma reação, estratégia semelhante à adotada neste trabalho. 4. CONCLUSÕES Os dois conjuntos de mpcr propostos permitiram detectar genes de EEA, EEB, EEC, EED em Staphylococcus aureus isolados de alimentos de origem animal. CNPq, processo n o / AGRADECIMENTO 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. GANDRA, E.A. Identificação de Staphylococcus aureus, S. intermedius e S. hyicus através de testes bioquímicos e da amplificação por PCR de seqüências dos genes coa e nuc. Dissertação de mestrado. 100p. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, HOORFAR, J.; MALORNY,B.; ABDULMAWJOOD, A.; COOK, N.; WAGNER, M.; FACH, P. Practical Considerations in Design of Internal Amplification Controls for Diagnostic PCR Assays. Journal of Clinical Microbiology, V.42, p , LANCETTE, G. A.; BENETT, R.W. Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins In: Downes, F.P.; Ito, K. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4 Ed. Washington: American Public Health Association, p LETERTRE, C.; PERELLE, S.; DILASSER, F.; FACH, P. Detection and genotyping by realtime PCR of the staphylococcal enterotoxin genes sea to sej. Molecular and Cellular Probes, v. 17, p , MATTHEWS, K. R.; ROBERSON, J.; GILLESPIE, B. E.; LUTHER, D. A.; OLIVER, S. P. Identification and differentiation of coagulase-negative Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, v.60, p MEHROTRA, M.; WANG, G.; JOHNSON, W.M. Multiplex PCR for Detection of Genes for Staphylococcus aureus Enterotoxins, Exfoliative Toxins, Toxic Shock Syndrome Toxin 1, and Methicillin Resistance. Journal of Clinical Microbiology, v. 38, p NÁJERA-SANCHEZ, G.; MALDONADO-RODRÍGUEZ, R.; OLVERA, P. R.; GARZA, L. M. Development of two multiplex polymerase chain reactions for the detection of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from foods. Journal of Food Protection. v. 66, p , ROSEC, J. P.; GIGAUD, O. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France. International Journal of Food Microbiology. v.77, p.61-70, SHARMA, N.K.; REES, C.E.D.; DODD, C.E.R. Development of a single-reaction multiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus aureus strains. Applied and Environmental Microbiology, v.66, p

5 10. SILVA, E. R.; CARMO, L. S.; SILVA, N. Detection of the enterotoxins A, B and C genes in Staphylococcus aureus from goat and bovine mastitis in Brazilian dairy herds. Veterinary Microbiology, v.106, p , 2005.