Diagnóstico Molecular aplicado a doenças animais

Transcrição

1 Campus de Botucatu Diagnóstico Molecular aplicado a doenças animais Prof. Dr. João Pessoa Araújo Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Laboratório de Virologia / Diagnóstico Molecular jpessoa@ibb.unesp.br

2 Teste Laboratorial desejado: Produz resultados confiáveis e precisos em um curto período de tempo e que tenham utilidade clínica com bom custo x benefício. threshold SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 15

3 Copyright 2005 American Physiological Society Técnicas mais empregadas no diagnóstico PCR tradicional; Nested-PCR; RT-PCR (transcrição reversa) qpcr (real time) ou RT-qPCR (transcrição reversa) Fig. 5. Real-time PCR hardware Valasek, M. A. et al. Advan. Physiol. Edu. 29: ; doi: /advan threshold SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 15

4 Abismos na logística do diagnóstico laboratorial

5 Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Chapter.1.4/5. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases (NB: Version adopted in May, 2009) Para diagnosticar INFECÇÃO INFECÇÃO X DOENÇA

6 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Para discriminar entre infecção e imunidade materna. Em estágios finais de programas de controle ou erradicação Para discriminar cepas vacinais das de campo Doença de Aujeszky (Herpesviridae) www. allategeszsegugy.pfizer.hu

7 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Para epidemiologia molecular e análises de evolução dos vírus, bactérias, protozoários e fungos. SEQUENCIAMENTO

8 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Para diagnóstico rápido e seguro em situações de risco.

9 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Para determinar a carga ou a excreção viral (ex.porcine circovirus type 2 infections). qpcr ou RT-qPCR threshold SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 15 9

10 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Monitoramento rápido de animais com sinais clínicos. Ehrlichia e Anaplasma

11 Nested PCR H.felis felis-f1 f1 H.felis felis-r2 fhf bp rhf6 675 bp

12 qpcr para Ehrlichia canis ou Ehrlichia sp Primer R E.sp Primer F E.sp Primer F E.canis

13 Análises realizadas desde 2004 Babesia canis

14 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Monitoramento rápido de animais com sinais clínicos. Cinomose (Canine distemper) Família: Paramyxoviridae (RNAss -)

15 Transcrição reversa in vitro Primers

16 Passo 1: Anexação dos primers ao RNA alvo

17 Passo 2: Transcrição reversa

18 Síntese do cdna

19 Amplificação cdna por PCR

20 Quando fazer um diagnóstico laboratorial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Detecção de mutantes resitentes a drogas, etc. Para demonstrar estado livre de infecção em animais vivos Análises de produtos de origem animal. Febre aftosa

21 Validando uma PCR Pré- análise Padronização Pós-análise

22 Pré- análise Escolha e análise dos primers. (Primer Blast, OligoAnalyser) Definição dos reagentes e equipamentos

23 Pré- análise Definição da logística de análise

24 Estrutura Laboratorial Lab. Sequenciamento DNA Lab. Nested PCR Lab. Extração RNA Lab. Extração DNA Lab. Amplificação/qPCR Lab. Amplificação - Nested Lab. Eletroforese e preparo de amostras amplificadas para clonagem e sequenciamento Fluxo de trabalho Lab. Biosegurança

25 Estrutura Laboratorial Lab. Extração RNA e Pré-PCR

26 Estrutura Laboratorial Lab. Extração DNA

27 Estrutura Laboratorial Lab. Amplificação (PCR e qpcr), sorologia e Cultivo celular e viral

28 Estrutura Laboratorial Lab. Nested, Hibridização e pulse field

29 Estrutura Laboratorial Lab. Amplificação do Nested

30 Estrutura Laboratorial Lab. Eletroforese e fotodocumentação

31 Estrutura Laboratorial Lab. Biosegurança P2+

32 Laboratório de Diagnóstico Molecular Desde setembro de Cães: Ehrlichia canis Anaplasma plattys Ehrlichia sp Babesia canis Leptospira sp Brucela sp Adenovírus tipo 1 e 2 Parvovirus Gatos: Vírus da Imunodeficiência Vírus da Leucemia Micoplasmas