ANÁLISES DE ALIMENTOS METODOLOGIAS
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- Lavínia Alvarenga Benke
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1 ANÁLISES DE ALIMENTOS METODOLOGIAS Profª. Drª. Mariana Schmidt
2 1 - METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DE UMIDADE EM ALIMENTOS Secagem em estufas: É o método mais utilizado em alimentos e está baseado na remoção da água por aquecimento, onde o ar quente é absorvido por uma camada muito fina do alimento e é então conduzido para o interior por condução. Este método costuma levar muitas horas (6-18 horas, até peso constante) em 100 a 105 ºC. A umidade é calculada através da diferença de peso. (AOAC, 1980) Estufa Balança Infra-vermelho 2- METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DE CINZAS EM ALIMENTOS Resíduo Mineral Total Cinza seca é mais comumente utilizada para determinação de cinza total. É também utilizada na determinação de cinza solúvel em água, insolúvel em água e insolúvel em ácido. É útil também na determinação dos metais mais comuns que aparecem em maiores quantidades. As amostras são incineradas em mufla, inicialmente a temperatura mais baixa e depois a ºC. Quando a cinza estiver pronta, isto é, não restar nenhum resíduo preto de matéria orgânica, o conjunto é retirado da mufla, colocado num dessecador para esfriar e pesado quando atingir a temperatura ambiente. A diferença entre o peso do conjunto e o peso do cadinho vazio dá a quantidade de cinza na amostra. (AOAC, 1980) Mufla 2
3 3- MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS O procedimento mais comum para determinar proteína é através da determinação de nitrogênio, baseado no fato de as proteínas terem porcentagem de nitrogênio quase constante, em torno de 16%, o que se faz normalmente é determinar o nitrogênio e, por meio de um fator de conversão (6,25), transformar o resultado em proteína bruta. Análise de nitrogênio: METODO DE KJELDAHL - DETERMINAÇÃO ATRAVÉS DO N TOTAL O procedimento do método baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico para digestão até que o carbono e hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia. Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de solução de ácido bórico, formando borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCI) padronizada. Digestão: H2SO4 (conc.) ºC + catalisador Neutralização Destilação Titulação Conversão do teor de N total para teor de proteína Digestores 3
4 Método de destilação e titulação - Método de Kjedahl Procedimento: Primeira fase: Digestão Colocar no balão de Kjeldahl 0,1-1 g de amostra, adicionar ± 1 g de mistura digestora e 3-10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Adaptar ao balão de haste longa e aquecer na capela até obtenção de um líquido límpido. Mistura digestora: 8 g de sulfato de cobre (CuSO4) 8 g de selenito de sódio(na2seo3) 80 g de sulfato de sódio (Na2SO4) Segunda fase : Destilação Transferir quantitativamente, com auxílio de água destilada o produto da digestão para um balão volumétrico de 100ml. Completar o volume com água destilada. Pipetar 5ml de solução receptora ** e transferir para um Erlenmeyer de 125 ml. Adaptar o Erlenmeyer ao refrigerador do aparelho de Kjeldahl de maneira que sua extremidade fique mergulhada no líquido. Pipetar 5ml da amostra e transferir para o funil do aparelho e deixar escoar para seu interior. Lavar o funil alimentador com pequenas quantidades de água destilada. Adicionar, aproximadamente 40 ml de solução de NaOH a 50% ao funil alimentador. Lavar duas vezes com água destilada. Aquecer e destilar, aproximadamente um volume de 50 ml. Afastar o Erlenmeyer do tubo de saída do destilado para que o próprio destilado o lave. Titular o destilado com solução de HCl 0,1 N em microbureta. **Solução receptora 20 g de ácido bórico 6 ml de solução alcoólica de vermelho de metila a 0, 1% 15 ml de solução alcóolica de verde de bromocresol a 0, 1% Completar para 1 litro de solução. Cálculo % de nitrogênio = Volume de HCl x fator do ácido x 0,1 N x 14 x 100 Peso da amostra (g) x 1000 Em geral 100 g de proteína tem em média 16 g de nitrogênio. Assim calcula se o teor de proteína multiplicando se pelo fator 6,25 o teor de nitrogênio. % de proteína = % de nitrogênio x 6,25 Exceções Fator para soja = 5,77 Fator para o leite = 6,38 : ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis. Washington: Association of Official Agricultural Chemists. 937 p
5 4- MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS EM ALIMENTOS Os testes qualitativos para açúcares estão baseados nas reações coloridas provenientes da condensação de produtos de degradação dos açúcares em ácidos fortes com vários compostos orgânicos; e nas propriedades redutoras do grupo carbonila. Os métodos mais utilizados em alimentos são: - Munson-Walker: método gravimétrico baseado na redução de cobre pelos grupos redutores dos açúcares. - Lane-Eynon: método titulométrico também baseado na redução de cobre pelos grupos redutores dos açúcares - Somogyi: método microtitulométrico baseado também na redução do cobre. - Métodos cromatográficos: papel, camada delgada, coluna, gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência. - Métodos óticos. Refratometria, Polarimetria, Densimetria. 5
6 Método químico de Lane-Enyon Procedimento 1- Pesar 5g da amostra sólida (ou pipetar 5ml da líquida) 2- Transferir para um balão de 100ml, com auxílio de 50 ml de água. 3- Se necessário clarificar a amostra 4- Completar o volume com água destilada e filtrar 5- Receber o filtrado num becker (ou erlenmeyer) seco e transferir para uma bureta de 50ml e reservar 6- Colocar em erlenmeyer seco de 250 ml, 5ml de cada uma das soluções de Fehling ( A e B) (obs: sempre colocar a solução B primeiro) e adicionar ± 40 ml de água destilada, aquecer a ebulição, quando começar a ebulição titule com a solução da amostra que esta na bureta até que a cor fique avermelhada 7- Adicionar 3 gotas de solução de azul de metileno a 1% a esta solução a quente (ficara novamente azulada) e continue a titulação até obter a coloração vermelho tijolo. 8- Anotar o volume gasto na titulação para efetuar os cálculos * vamos repetir o procedimento para confirmar o volume gasto 9- Completar novamente a bureta com a solução da amostra obtida no item Colocar em erlenmeyer seco de 250 ml, 5ml de cada uma das soluções de Fehling ( A e B) (obs: sempre colocar a solução B primeiro) e adicionar ± 40 ml de água destilada, adicionar a solução que esta na bureta colocando 1ml a menos do que o gasto na primeira titulação (ex. se você gastou 10ml - coloque 9ml) aquecer a ebulição, colocar 3 gotas de azul de metileno e continuar a titulação até a viragem da cor para vermelho tijolo 11- Anotar o volume gasto (deve ser bem próximo ao obtido na 1a titulação) para fazer os cálculos) Calculo: % açúcares redutores: 1000 T tomada de ensaio ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods os analysis of the AOAC. 11th ed, Washington, p. 6
7 MÉTODO DE SOMOGYI-NELSON Método instumental : Espectrofotométrico Princípio do método: A glicose desproteinizada da amostra reduz sal de cobre, em meio alcalino e a quente. A forma reduzida do sal de cobre atua sobre o reativo arseno molibdico determinando o aparecimento da cor azul, cuja intensidade é proporcional ao teor de glicose da amostra. Sob a ação do calor e do álcali, os açúcares redutores se decompõem parcialmente em fragmentos oxidáveis pelohidróxido cúprico existente no reativo de Somogyi - Nelson, resultando em ácido oxálico, malônico, etc. Nesta reação o hidróxido cúprico (azul) se reduz à hidróxido cuproso (amarelo). Continuando o aquecimento, o hidróxido cuproso perde uma molécula de água, transformando em óxido cuproso (vermelho). O óxido cuproso assim formado, vai reduzir o reativo arsenomolíbdico dando o óxido de molibdênio (MO3O8) de coloração azul, cuja intensidade é proporcional a quantidade de glicose existente na amostra. Extração da amostra: - Pesar 1g de amostra (ou pipetar 5 ml de suco) em um Becker de 50 ml - Adicionar 5 ml de NaOH - 0,5N e agitar - Lavar as paredes do Becker com água destilada - Neutralizar com ácido acético glacial (± 0,1ml) - Transferir o extrato para um balão de 100ml, lavando bem o Becker, completar o volume. - Neste extrato serão feitos os açúcares redutores(1a SOLUÇÃO) Hidrólise ácida da sacarose - Do extrato obtido acima pipetar 20ml e transferir para um balão de 100ml - Adicionar 0,5ml de HCL concentrado - Aquecer em banho Maria fervente por 15 min. - Esfriar em banho de gelo - Neutralizar com sol. saturada de carbonato de sódio (±1,5ml) - Completar o volume do balão para 100ml. - Usar esta sol. para desproteinização (2a SOLUÇÃO) Desproteinização da amostra -Colocar respectivamente em dois tubos de ensaio: 3ml da 1a solução (tubo 1) 3 ml da 2a solução (tubo 2) Em cada um dos tubos adicionar: - 9,0 ml de água destilada - 1,2 ml de sol de hidróxido de bário 0,3N - 1,2 ml de sol. sulfato de zinco a 5% - agitar os tubos e deixar em repouso por 1o min. - filtrar Doseamento: Usar para o doseamento 1,0 ml do extrato desproteininizado para açúcares redutores e 2,0 ml da sol. hidrolizada e desproteinizada para a sacarose, seguindo a seqüência da técnica usada na curva padrão. 7
8 - Completar o volume final dos tubos para 10 ml, usando 6,0 ml de água destilada - Ler a D. O. em espectrofotômetro a 510 nm. Preparo da soluções: -sol de Sulfato de Zinco (ZnSO4) a 5% - sol. de hidróxido de bário Ba(OH)2. 8H2O 0,3N Pesar 47,2 g de Ba(OH)2 e diluir para 1000 ml com H2O destilada Equivalência das soluções Colocar em erlenmeyer de 250ml, 5 ml da sol. de (ZnSO4), ± 20 ml de H2O destilada e 2 gotas de sol. de fenoftaleina alcoólica 1%. Titular com a sol. de Ba(OH)2, até viragem para coloração rósea. Reativo A: Carbonato de sódio anidro...25g Tartarato duplo de Na e K...25g Bicarbonato de sódio...20g Sulfato de sódio anidro g H2O destilada q.s.p ml Reativo B: Sulfato de cobre (CuSO4. H2O)...25g H2O destilada q.s.p ml H2SO4 conc gotas Reativo cúprico Reativo A...25 ml Reativo B...1 ml *** preparar na hora do uso Reativo Arsenomolíbdico: Dissolver 25 g de molibdato de amônea em 450 ml de H2O destilada Adicionar 21 ml de H2SO4 conc e misturar bem Separadamente, dissolver 3 g de arseniato dissódico (Na2HASO4. 7H2O) em 25 ml de H2O destilada. Juntar essa sol. à primeira e agitar. Colocar a mistura em banho Maria regulado a 56oC por 25 min. Guardar em frasco âmbar (escuro) Solução padrão de glicose: (sugestão 1g/1000ml --- retira 100ml/1000ml.) Pesar 100mg de glicose pura e diluir para 1000 ml com H2O destilada Cada 1ml da solução contém 100 µg de glicose Cálculo AR e ART: leitura.k.100 Diluição da amostra em µg Nelson, N.A. A photometric adaptation of Somogyi method for determination of glicose. Journal Biological Chemistry, Baltimore, v.135, p. 375, AMIDO Procedimento - Pesar 5 g de amostra e transferir para erlenmyer de 500 ml com auxílio de 150 ml de água destilada. - Agitar por 15 min. - Filtrar em papel de filtro, lavando com ± 500 ml de água destilada e dispensar o filtrado - Furar o papel de filtro com um bastão de vidro e recolher a amostra em um erlenmyer de 500 ml com ± 150 ml de água. - Adicionar 10 ml de HCL concentrado a amostra - Tampar com condensador de refluxo e levar ao banho maria fervente por 50 min. - Esfriar neutralizar com NaOH concentrado ± 10 ml, completar o volume par 500 ml e filtrar ** prosseguir como na determinação de açúcares redutores totais a partir do item 5 Cálculo: 1000T x 0,9: % amido tomada de ensaio ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods os analysis of the AOAC. 11th ed, Washington, p. 8
9 5- MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE LIPÍDIOS EM ALIMENTOS Os métodos rotineiros para determinação quantitativa de lipídios baseiam-se na extração da fração lipídica por meio de um solvente orgânico adequado. Após extração e remoção do solvente, determina-se gravimetricamente a quantidade de lipídeos presente. Extrator soxhlet Determinação de extrato etéreo Método gravimétrico Procedimento: Pesar 2-5 g de amostra em um cartucho de papel Dessecar em estufa a C Cobrir a boca do cartucho com algodão Colocar no aparelho extrator de Soxhlet, utilizando éter etílico como solvente.** Obs: O balão receptor do Soxhlet deve ser previamente tarado em estufa a 105 0C. Extrair por 6 horas. Cálculo: % Extrato etéreo = 100 x N P Onde: N= Gramas de gordura no balão P = Peso da amostra INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas, métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IAL, 1985, v.1, 371p. 9
10 Determinação de ácidos graxos por cromatografia gasosa Método instrumental Esterificação do óleo Com o auxílio de pipeta volumétrica, transferir 0,1ml da amostra de óleo para o frasco de esterificação. Adicionar: - 3,0ml de Hexano. - 15,0ml de H2SO4-2% em metanol Refluxar por 1 hora. Adicionar 40ml de salmoura concentrada e agitar por 1 minuto. Completar volume, até o gargalo, com salmoura concentrada. Com o auxílio de pipeta pasteur, transferir o sobrenadante para um vidro de com tampa. Injetar em cromatógrafo a gás. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas, métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IAL, 1985, v.1, 371p. 10
11 6- MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE FIBRAS EM ALIMENTOS O processo mais comum para sua determinação é o de Hennermberg, que apesar de datar de 1964, vem sendo bastante utilizado com algumas modificações. O método visa simular in vitro o processo da digestão in vivo. Consta fundamentalmente de uma digestão em meio ácido, seguida por uma digestão em meio alcalino. Com estes tratamentos, remove-se as proteínas, os açúcares e o amido, a hemicelulose e as pectinas. Fica como resíduo apenas a celulose e a lignina insolúvel em ácido, além do material mineral. Após a incineração, resta a matéria mineral. Método: Pesar 2 g de amostra Ferver em refluxo com ácido sulfúrico 1,25% por 30 min. Filtrar em papel de filtro e lavar com água fervendo Ferver o resíduo com NaOH 1,25% por 30 min. Filtrar em papel de filtro e levar a estufa para secar Cálculo % fibra bruta = peso do papel com amostra após a secagem - peso do papel x 100 Peso da amostra CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. Campinas, SP. Editora da UNICAMP p. 11
12 7- MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE VITAMINAS EM ALIMENTOS Os métodos físico-químicos são os mais aplicáveis ás determinações de vitamina C, pois são geralmente precisos, rápidos e econômicos. Nessa categoria estão incluídos os métodos titulométricos, espectrofotométricos, colorimétricos, fluorimétricos e os cromatográficos. Vitamina C - Método do iodeto de potássio Método titulométrico Reagentes: - solução de ácido sulfúrico a 20%, v/v. - solução de iodeto de potássio a 10%, p/v. - solução de amido a 1%, p/v. - solução de iodato de potássio 0,1N: pese 3,5668g para 1litro de água destilada (1ml de iodato a 0,1N equivale a 8,806 mg de ácido ascórbico). - solução de iodato de potássio 0,01N: pipete 10ml da solução de iodato de potássio 0,1N e dilua até 100ml em balão volumétrico (1ml de iodato de potássio 0,01N equivale a 0,8806mg de ácido ascórbico). *** Dependendo da quantidade de vitamina C contida na amostra, utiliza a solução de iodato de potássio a 0,1N ou 0,01N. Procedimento Pesar em um bequer de 250ml uma quantidade da amostra, de tal forma que contenha ao redor de 5,0mg de vitamina C. Filtrar a amostra e receber o filtrado em um erlenmeyer de 300ml, pipetar 10 ml do filtrado. Adicionar 10ml da solução de ácido sulfúrico, a 20%. Adicionar 1ml da solução de iodeto de potássio a 10%. Adicionar 1ml da solução de amido a 1%. Titular com solução de iodato de potássio até coloração azul. Cálculo: 100. V. F. = mg de vitamina C por cento p/p P Onde: V: volume de iodato de potássio gasto na titulação F: 8,806 se for 0,1N e o,8806 se for 0,01N P: no de gramas da amostra INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas, métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IAL, 1985, v.1, 371p. 12
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