janeiro de 2008 Validação do método Colilert -18/Quanti-Tray para contagem de E. coli e bactérias coliformes em água

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1 Validação do método Colilert -/Quanti-Tray para contagem de E. coli e bactérias coliformes em água janeiro de 2 One IDEXX Drive Westbrook, Maine 42 Estados Unidos idexx.com 2 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved All /TM marks are owned by IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States and/or other countries.

2 Validação do método Colilert-/Quanti-Tray para contagem de E. coli e bactérias coliformes em água IDEXX LABORATORIES, INC ONE IDEXX DRIVE WESTBROOK, MAINE 42 ESTADOS UNIDOS VERSÃO FINAL CORRIGIDA, 3 de janeiro de 2

3 Validação do método Colilert -/Quanti-Tray para contagem de E. coli e bactérias coliformes em água 1 Introdução O método Colilert -/Quanti-Tray é um ensaio criado especificamente para contagem NMP de E. coli e bactérias coliformes em água, potável ou não, com ou sem tratamento. O Colilert- mede simultaneamente o total de coliformes e de E. coli em amostras de água. A base do ensaio é a tecnologia de substrato definido (DST, sigla em inglês de Defined Substrate Technology). O método consiste em misturar o reagente DST com 1 ml de amostra e incubar em um ensaio tipo presença/ausência (PA) ou tipo número mais provável (NMP). A amostra adquire cor amarela quando as bactérias coliformes metabolizam o ONPG, que serve como nutriente e indicador, e fluoresce sob luz UV quando a E. coli metaboliza o MUG, um outro nutriente e indicador. O Colilert- permite detectar essas bactérias simultaneamente à concentração de 1 ufc/1 ml em horas na presença de bactérias heterotróficas em concentrações de até 2 x 1 6 por 1 ml de amostra. O Quanti-Tray foi projetado para produzir contagens quantitativas de bactérias de amostras de até 1 ml usando reagentes DST. A mistura reagente-amostra é adicionada a uma placa Quanti-Tray, que é então selada com o selador Quanti-Tray Sealer e depois incubada. A placa é projetada de forma a conter 51 cavidades com a mistura reagente-amostra após a selagem. O selador é uma ferramenta motorizada de selagem por calor, projetado para selar a Quanti-Tray. Em seguida, as cavidades positivas são contadas e os NMPs de bactérias coliformes e/ou E. coli são determinados a partir de uma tabela. 2 Aplicações do Colilert-/Quanti-Tray A principal aplicação do Colilert -/Quanti-Tray é a análise de águas, potáveis ou não. O Colilert-/Quanti-Tray já foi aprovado para tal aplicação na América do Norte (EUA, Canadá e México), América do Sul (Brasil, Argentina, Chile e Colômbia), Europa (Dinamarca, Alemanha, Hungria, Islândia, Irlanda, Itália, Noruega, Espanha e Reino Unido) e Extremo Oriente (Japão e Coréia). Também já foi aprovado para análise de água engarrafada pela International Bottled Water Association e de água purificada para uso farmacêutico pela US Pharmacopeial Convention. Nos EUA, a Agência de Proteção Ambiental (USEPA) já sancionou o Colilert-/Quanti-Tray para pesquisa de coliformes e E. coli em água de fontes e em águas subterrâneas e pesquisa de E. coli em águas ambientais, águas para uso recreativo e águas residuais. 3 Identificação de organismos-alvo (ISO/TR 43 Seções e.2) No método Colilert -/Quanti-Tray, as bactérias coliformes são aquelas que produzem coloração amarela por meio da ação da β-galactosidase sobre o ortonitrofenil-β-d-galactopiranosídeo (ONPG), e a E. coli é definida como uma bactéria coliforme que apresenta fluorescência azul sob luz UV devido à ação da β-glicuronidase sobre o 4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo (MUG). 1

4 3.1 Teste em cultura pura (ISO/TR 43 Seção 1.2.1) As definições das reações promovidas por bactérias-alvo e por outras bactériasforam confirmadas testando o Colilert-/Quanti-Tray com culturas puras de cepas de referência de E. coli, bactérias Gram-negativas coliformes e não-coliformes obtidasda American Type Culture Collection. A Tabela 1 mostra as reações típicas dessas cepas de referência, que são usadas pela IDEXX para controle de qualidade de rotina do Colilert-/Quanti-Tray. Tabela 1 Cepas de referência de E. coli, bactérias coliformes e outras bactérias Gram-negativas para confirmação das reações positivas e negativas típicas na placa Colilert -/Quanti-Tray. Bactéria Nº. ATCC* Reação no Colilert- Escherichia coli 2522 Forte coloração amarela Forte fluorescência azul sob UV Citrobacter freundii Forte coloração amarela Não fluoresce sob UV Klebsiella pneumoniae 3 Forte coloração amarela Não fluoresce sob UV Enterobacter aerogenes 4 Forte coloração amarela Não fluoresce sob UV Pseudomonas aeruginosa 15 Não cresce Sem coloração amarela Não fluoresce sob UV Aeromonas hydrophila Não cresce Sem coloração amarela Não fluoresce sob UV * American Type Culture Collection (coleção de cepas bacterianas) 3.2 Estudos de sensibilidade, especificidade e seletividade (ISO/TR 43 Seção.2) A ISO/TR 43 define essas características dos métodos microbiológicos da seguinte forma: Sensibilidade: Fração dos positivos que foi corretamente classificada na contagem presuntiva; Especificidade: Fração dos negativos que foi corretamente classificada na contagem presuntiva; Seletividade: Relação entre o número de colônias-alvo e o total de colônias no volume da amostra. No Colilert-/Quanti-Tray, essas características dizem respeito ao número de cavidades positivas para coliformes ou E. coli que realmente continham as bactérias procuradas e com o número de cavidades negativas que realmente não continham as bactérias procuradas. A sensibilidade, a especificidade e a seletividade do Colilert-/Quanti-Tray foram avaliadas identificando-se isolados positivos para β-galactosidase e β-glicuronidase em cavidades positivas produzidas usando-se amostras naturais obtidas pelo repique de água potável declorada com água de rios. Foram usadas três fontes de água de superfície dois rios e um reservatório de água de superfície para se obter um litro de amostras de água potável declorada 2

5 repicada. Após a incubação, foram escolhidas 1 cavidades amarelas e nãofluorescentes de 3 amostras (3 a 5 de cada amostra), selecionadas de forma a garantir que todas as intensidades de amarelo encontradas estivessem presentes. Da mesma forma, foram selecionadas 1 cavidades amarelas e fluorescentes, de modo a abranger todos os níveis de fluorescência encontrados. Das 3 amostras, apenas 54 cavidades negativas estavam disponíveis, sendo que duas delas apresentaram proliferação com turbidez. As reações positivas e/ou negativas para β-galactosidase ou β-glicuronidase foram confirmadas e os isolados identificados usando painéis de identificação miniatura BBL Crystal E/NF (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EUA) Cálculo da sensibilidade, especificidade, seletividade e taxas de falsos positivos e falsos negativos Para cada parâmetro, os dados de identificação foram divididos em quatro categorias: a = número de cavidades positivas que continham coliformes ou E. coli (positivos verdadeiros) b = número de cavidades negativas que continham coliformes ou E. coli (falsos negativos) c = número de cavidades positivas que não continham coliformes ou E. coli (falsos positivos) d = número de cavidades negativas que apresentaram proliferação e não continham coliformes ou E. coli (negativos verdadeiros). A sensibilidade, especificidade, seletividade e as taxas de falsos positivos e falsos negativos foram calculadas pelas seguintes equações: Sensibilidade = a / (a+b) Especificidade = d / (c+d) Seletividade = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] Taxa de falsos positivos = c / (a+c) Taxa de falsos negativos = b / (b+d) Foi calculado ainda um outro parâmetro, a eficiência (E), definido como a fração de cavidades classificadas corretamente, pela fórmula E = (a+d) / (a+b+c+d) Coliformes não-e. coli Foram obtidos isolados para β-galactosidase de todas as 1 cavidades amarelas sem fluorescência que foram subcultivadas. Nenhuma dessas placas apresentou reação de β-glicuronidase. O Apêndice A1 apresenta as reações de oxidase e indol, perfis BBL Crystal E/NF e identificação desses isolados. Todos foram identificados como positivos para β-galactosidase, e os negativos para β-glicuronidase são outras Enterobacteriaceae que não E. coli. Ao todo, foram identificadas 23 espécies de E. coli (Tabela 2) E. coli Os isolados de ß-galactosidase foram obtidos de todas as 1 cavidades amarelas sem fluorescência que foram subcultivadas. O Apêndice A1 apresenta as reações de oxidase e indol, perfis BBL Crystal E/NF e identificação desses isolados. 3

6 Noventa e nove isolados foram identificados como E. coli e o isolado restante, que apresentou reação positiva para β-glicuronidase no painel Crystal E/NF, foi caracterizado como Klebsiella oxytoca Cavidades negativas Cinqüenta e quatro cavidades negativas foram subcultivadas e houve crescimento em duas delas, com produção de colônias negativas para β-galactosidase e β-glicuronidase, positivas para oxidase e negativas para indol (Apêndice A3). Ambas foram classificadas como Shewanella putrefaciens pelo sistema BBL Crystal E/NF. Não houve crescimento em nenhuma das outras 52 cavidades. Tabela 2 Identificação pelo sistema Colilert -/Quanti-Tray de bactérias coliformes (número de isolados) obtidas de cavidades positivas para coliformes não-e. coli Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata () Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera cryocrescens (3) Citrobacter freundii (1) Leclercia adecarboxylata (1) Enterobacter aerogenes (1) Pantoea agglomerans () Enterobacter asburiae (1) Serratia fonticola (1) Enterobacter cancerogenus (1) Serratia liquefaciens (3) Enterobacter cloacae (25) Serratia marcescens (1) Enterobacter sakazakii (7) Serratia odorifera (1) Escherichia vulneris (4) Serratia plymuthica (4) Hafnia alvei (1) Serratia rubidea (1) Klebsiella oxytoca (4) Serratia spp (1) Klebsiella pneumoniae (6) 3.3 Determinação das características relacionadas à sensibilidade e à especificidade Bactérias coliformes No sistema Colilert-/Quanti-Tray, os coliformes são microrganismos que produzem coloração amarela (com ou sem fluorescência) e os resultados dos parâmetros calculados foram: Sensibilidade = a / (a+b) = 2 / (2+) = 1 Especificidade = d / (c+d) = 2 / (+2) = 1 Seletividade = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 1 [(2+) / (2+++2)] = -,4 Taxa de falsos positivos = c / (a+c) = / (2+) = Taxa de falsos negativos = b / (b+d) = / (+2) = Eficiência (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (2+2) / (2+++2) = E. coli No sistema Colilert-/Quanti-Tray, a E. coli é o microrganismo que produz coloração amarela e fluorescência. Os resultados dos parâmetros calculados foram: Sensibilidade = a / (a+b) = / (+) = 1 Especificidade = d / (c+d) = / (1+) =, Seletividade = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 1 [(+1) / (++1+)] = -,35 4

7 Taxa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (+1) =,1 Taxa de falsos negativos = b / (b+d) = / (+) = Eficiência (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (+) / (++1+) =,5 As análises dos dados mostraram que, para as bactérias coliformes, o método Colilert- /Quanti-Tray tem alta sensibilidade e especificidade, com zero de falsos positivos e falsos negativos. A seletividade também é elevada: o valor encontrado de -,4 é muito superior ao valor de referência -1 sugerido pelo ISO/TR 43 para métodos de contagem de colônias. Como sua eficiência é igual a 1, o método pode ser considerado altamente eficiente para bactérias coliformes. Os dados de identificação mostraram que o Colilert-/Quanti-Tray permite detectar uma ampla variedade de bactérias coliformes. O Colilert-/Quanti-Tray também é altamente sensível e específico para E. coli: a seletividade (-,35) é inferior à observada para bactérias coliformes, mas essa diferença é esperada porque o teste tem natureza dual, ou seja, a E. coli é um subtipo de bactéria coliforme. Apesar disso, a seletividade é superior ao valor de referência estipulado pela norma ISO/TR 43. O método é altamente eficiente (E =,5) para detecção de E. coli. 4 Incerteza na contagem (ISO 43 Seção e Anexo B) A repetibilidade e a reprodutibilidade são duas variáveis que estimam a confiabilidade de um método analítico. Pode-se medi-las em um método como um todo por meio de testes em amostras naturais apropriadas ou observando-se a incerteza na contagem durante a leitura dos resultados do método em questão. Os resultados produzidos por qualquer método dependem da facilidade com que o operador consegue contar as colônias ou reações de NMP positivo. Esses fatores são influenciados pelas diferenças na morfologia das colônias dos microrganismos (procurados ou não) durante a contagem em placas de ágar e pela clareza das reações positivas e negativas em testes NMP em caldos de cultura. Portanto, as medições das incertezas associadas à contagem podem indicar possíveis problemas associados à adoção disseminada do método. As definições de repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R) são: Repetibilidade: Grau de concordância dos resultados de medições sucessivas do mesmo objeto, realizadas sob condições idênticas de medição Reprodutibilidade: Grau de concordância dos resultados de medições do mesmo objeto, realizadas sob condições diferentes de medição Na contagem de colônias microbiológicas em placas de ágar ou reações positivas em testes NMP, a 'condição' que varia ou permanece a mesma é o indivíduo que faz a contagem. Nesse contexto, portanto, a repetibilidade é a obtenção de contagens idênticas quando um operador conta mais de uma vez, e a reprodutibilidade é a obtenção de contagens semelhantes quando dois ou mais operadores fazem a contagem. De modo geral, a avaliação da reprodutibilidade é mais informativa que o estudo da repetibilidade. O Anexo B da ISO/TR 43 dá orientações sobre o uso de desvios padrão relativos (DPR) para avaliar a repetibilidade e a reprodutibilidade das contagens. Também recomenda que o valor ideal do DPR com o uso de culturas puras seja inferior a,2, ou seja, o desvio padrão máximo não deve superar 2%. Os analistas da IDEXX fizeram estudos de incerteza das contagens, cujos resultados são apresentados no 5

8 Apêndice B. As contagens foram feitas sem que os analistas soubessem os valores obtidos pelos outros analistas. Os NMPs foram anotados como números inteiros nãofracionários. Os DPRs relativos dos NMPs em um sistema Colilert -/Quanti-Tray inoculado com um coliforme típico (Klebsiella pneumoniae ATCC 336) e E. coli (ATCC 2522) foram: Klebsiella pneumoniae Repetibilidade =,22 Reprodutibilidade =,2 Escherichia coli Repetibilidade =, Reprodutibilidade =,7 Os valores para o coliforme típico são da ordem do valor de referência de <,2 (ISO/TR 43 Seção B1) e os valores para E. coli são bem inferiores ao valor de referência. Isso indica que o Colilert-/Quanti-Tray é capaz de produzir contagens confiáveis de NMP para Klebsiella pneumoniae e E. coli. 5 Robustez: Sensibilidade ao tempo (ISO/TR 43 Seções e B.4) Dois aspectos da robustez são importantes para o sistema Colilert -/Quanti-Tray : o período de incubação recomendado de 22 horas e a vida útil de 15 meses do meio Colilert- armazenado a 4 25ºC. O Apêndice C mostra as contagens pareadas de análises de suspensões de pequenos números de culturas de referência de E. coli, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii depois de horas e 22 horas de incubação no mesmo lote de Colilert- após armazenamento a 25 C por até 541 dias. 5.1 Robustez do tempo de incubação Após e 22 horas de incubação, houve 4 resultados de contagens pareadas. Todos os 4 pares tiveram valores idênticos para E. coli após o tempo de incubação. Para Klebsiella pneumoniae, 47 (%) das contagens foram idênticas. Na última contagem pareada, apenas uma cavidade se tornou positiva após 22 horas de incubação. Com o Citrobacter freundii, porém, a contagem aumentou após 22 horas de incubação, com (27%) a mais de amostras positivas que após horas de incubação. Todas menos uma dessas contagens mais elevadas foram aumentos de uma ou duas cavidades positivas. A cepa de Citrobacter parece mostrar uma taxa de crescimento mais lenta ou uma cinética enzimática mais fraca em comparação a outras bactérias testadas. Segundo os dados de experimentos, o período de incubação recomendado de 22 horas é robusto para E. coli e bactérias coliformes resistentes como a Klebsiella pneumoniae, mas pode haver aumento das contagens àpós 22 horas de incubação, em comparação a horas, com algumas bactérias coliformes que crescem mais lentamente ou produzem enzimas em pequena quantidade. O aumento das contagens durante um período específico de incubação (p.ex. 24 horas para métodos de filtração em membrana típicos, como os descritos na ISO 3-1) são um fenômeno bem descrito, especialmente com coliformes ambientais. No entanto, o uso das contagens após horas é considerado aceitável, por motivos operacionais e práticos, se não houver aumento excessivo das contagens após incubação prolongada. 5.3 Robustez na armazenagem do Colilert - 6

9 O meio Colilert- armazenado a 4 25 C tem uma vida de prateleira de meses. Os dados para as três bactérias testadas com a mesma amostra de meio de cultura armazenado a 25ºC não mostraram diferença no desempenho após armazenagem por até 541 dias, uma durabilidade muito superior ao período de um ano estipulado pela norma. Para esse teste, foi escolhida uma temperatura de armazenagem mais elevada, pois ela seria mais passível de desestabilizar o meio de cultura Colilert- que em temperaturas de refrigeração. 6 Limite superior das contagens (ISO/TR 43 Seções e 6.3.3) O Colilert -/Quanti-Tray é um método NMP com intervalo de contagem arbitrário entre e 21, definido pelo número de cavidades na placa Quanti-Tray. Segundo a Seção da ISO/TR 43, não se pode, por motivos práticos e estatísticos, definir um limite superior para métodos NMP, "pois não existe uma relação simples entre a precisão e o número de partículas introduzidas no sistema de detecção". 7 Precisão (ISO/TR 43 Seções e.5.5) A precisão dos métodos NMP é descrita pelos intervalos de 5% de confiança calculados para cada valor de NMP (ISO/TR 43 Seção.5.5). O Apêndice D mostra os intervalos de confiança para contagens obtidas com o Colilert -/Quanti- Tray, calculadas usando o programa do Bacteriological Analytical Manual (BAM) da US Food and Drug Administration (FDA), disponibilizado on-line em É possível calcular um valor teórico para a repetibilidade de um NMP a partir dos valores do NMP e de seus intervalos de confiança. O Apêndice D também mostra os valores relativos de incerteza para cada NMP (log 1 SD, calculado a partir do intervalo de 5% de confiança para NMP) e de repetibilidade (incerteza padrão relativa) na forma de coeficientes de variação (CV%). Esses valores de Poisson servem como indicadores de precisão mínima, podendo ser associados a outros dados disponíveis em um laboratório (p.ex. variabilidade na decantação do volume de teste ou incertezas na contagem) para se obter uma estimativa total da repetibilidade para cada NMP. Bibliografia.1 Normas ISO ISO 3-1:2 Qualidade da água: Detecção e contagem de Escherichia coli e bactérias coliformes. Parte 1: Método de filtração por membrana. Genebra: International Organisation for Standardization. ISO/TR 43:2(E) Qualidade da água: Orientação sobre a validação de métodos microbiológicos. Genebra: International Organisation for Standardization. 7

10 Apêndice A Dados de estudos de sensibilidade, especificidade e seletividade (ver Seção 3.2) Apêndice A1 Identificação de isolados de cavidades amarelas e nãofluorescentes no sistema Colilert -/Quanti-Tray Isolado ref. Oxidase Indol Perfil Crystal E/NF Identificação Confiança Y Enterobacter sakazakii,561 Y Pantoea agglomerans,72 Y Kluyvera cryocrescens,2 Y Enterobacter cloacae,62 Y Kluyvera cryocrescens,627 Y Pantoea agglomerans,77 Y Klebsiella oxytoca,25 Y Pantoea agglomerans,41 Y Kluyvera ascorbata,264 Y Enterobacter cloacae,6 Y Citrobacter freundii,335 Y Enterobacter cloacae,26 Y Enterobacter sakazakii,6 Y Kluyvera ascorbata,25 Y Kluyvera ascorbata,72 Y Escherichia vulneris,5764 Y Pantoea agglomerans,32 Y Klebsiella oxytoca,524 Y Serratia liquefaciens,57 Y Enterobacter cloacae,43 Y Cedecea lapagei,35 Y Pantoea agglomerans,76 Y Enterobacter sakazakii,734 Y Leclercia adecarboxylata, Y Klebsiella pneumoniae,154 Y Pantoea agglomerans,776 Y Serratia rubidaea,42 Y Enterobacter asburiae,54 Y Serratia liquefaciens,5545 Y Kluyvera ascorbata,2 Y Klebsiella oxytoca,555 Y Enterobacter cloacae,7 Y Enterobacter cloacae,61 Y Citrobacter freundii, Y Citrobacter freundii,4 Y Pantoea agglomerans,76 Y Citrobacter freundii,73 Y Klebsiella pneumoniae,241 Y Klebsiella pneumoniae,4 Y Escherichia vulneris,475 Y Enterobacter cloacae,43 Y Enterobacter cloacae,673 Y Kluyvera ascorbata,25

11 Y Enterobacter sakazakii,1 Y Enterobacter sakazakii,4 Y Kluyvera ascorbata,43 Y Klebsiella pneumoniae,53 Y Enterobacter sakazakii,4 Y Enterobacter cloacae, Y Enterobacter cancerogenus,533 Y Kluyvera cryocrescens,422 Y Enterobacter aerogenes,747 Y Citrobacter freundii,62 Y Enterobacter cloacae, Y Enterobacter cloacae,6 Y Enterobacter cloacae,4 Y Serratia plymuthica,677 Y Serratia odorifera,763 Y Citrobacter amalonaticus,735 Y Enterobacter cloacae,627 Y Enterobacter cloacae,6 Y Kluyvera ascorbata,64 Y Kluyvera ascorbata,3 Y Enterobacter sakazakii,7 Y Enterobacter cloacae,66 Y Enterobacter cloacae,37 Y Enterobacter cloacae,62 Y Serratia plymuthica,32 Y Enterobacter cloacae,21 Y Serratia plymuthica,677 Y Citrobacter freundii,6 Y Serratia fonticola,33 Y Enterobacter cloacae,6 Y Klebsiella pneumoniae,1 Y Escherichia vulneris,7 Y Enterobacter cloacae,66 Y Citrobacter amalonaticus,735 Y Serratia liquefaciens,61 Y Citrobacter freundii,7 Y Serratia marcescens,547 Y Enterobacter cloacae,72 Y Hafnia alvei,47 Y Kluyvera ascorbata,42 Y Klebsiella oxytoca,715 Y Enterobacter cloacae,226 Y Enterobacter cloacae,7434 Y Kluyvera ascorbata,76 Y Serratia plymuthica,32 Y Kluyvera ascorbata,34 Y Citrobacter freundii, Y Escherichia vulneris,6454 Y Klebsiella pneumoniae,54 Y Pantoea agglomerans,656 Y Serratia spp.,46

12 Y Enterobacter cloacae,57 Y Citrobacter freundii,771 Y Kluyvera ascorbata,36 Y Pantoea agglomerans,76 Y Enterobacter cloacae,4 Y Citrobacter freundii,4 1

13 Apêndice A2 Identificação de isolados de cavidades amarelas e fluorescentes no sistema Colilert -/Quanti-Tray Isolado ref. Oxidase Indol Perfil Crystal E/NF Identificação Confiança F Escherichia coli, F Escherichia coli,737 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,76 F Escherichia coli,76 F Escherichia coli, F Escherichia coli,45 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,

14 F Escherichia coli,62 F Escherichia coli, F Escherichia coli,3 F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,62 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,3 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,35 F Escherichia coli, F Escherichia coli,45 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,3 F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli,

15 F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Klebsiella oxytoca,746

16 Apêndice A3 Identificação de isolados em cavidades negativas no sistema Colilert -/Quanti-Tray Isolado Perfil Crystal β-gal β-glic Oxidase Indol ref. E/NF Identificação Confiança N1 N2 N3 N Shewanella putrefaciens,4 N5 N6 N7 N N N1 N N N N N15 N N Shewanella putrefaciens,4 N N1 N2 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N2 N2 N3 N31 N32 N33 N34 N35 N36 N37 N3 N3 N4 N41 N42 N43 N44 N45 N46

17 N47 N4 N4 N5 N51 N52 N53 N54 15

18 Apêndice B Dados de estudos de incerteza de contagem (ver Seção 4) Apêndice B1 Incerteza de contagem para NMPs* de cavidades amarelas e nãofluorescentes no Colilert -/Quanti-Tray inoculadas com Klebsiella pneumoniae ATCC 336 * Número mais provável, registrado como inteiro não fracionário Analista A Leitura 1 Analista A Leitura 2 Analista B Leitura Analista C Leitura Amostra NMP NMP NMP NMP Média Repetibilidade Desv. pad DPR ao quadrad o Reprodutibilidade Média Desv. pad DPR ao quadrad o ,,, 2,,, ,,, 6,,, ,,, 1,,, 4,,,,,, ,,, 36,,, ,,, 34,67 1,1547, ,,, 31,,, ,,, 27,,, ,,, 56,,, ,,, 5,,, ,,, 41,,, ,,, 4,,, ,,, 56,,,,,,,,, ,,, 7,,, , 2,24, 6,67 2,34, ,,, 1,,, 7 3,5 7,772,7 5,33 6,35, ,,, 5,,, ,,, 5,,, 21 5, 4,2426,1, 3,4641, , 4,2426,24 7, 3,4641, ,,, 1,,, ,,,,33 4,6, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 21,,, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 21,,, Soma DPR,7 Soma DPR,5 DPRc,221 DPRc,24

19 Apêndice B2 Incerteza de contagem para NMPs* de cavidades amarelas e fluorescentes no Colilert -/Quanti-Tray inoculadas com E. coli ATCC 2522 * Número mais provável, descrito como inteiro não fracionário Analista Analista A Analista A B Leitura 1 Leitura 2 Leitura Analista C Leitura Repetibilidade Reprodutibilidade Desv. Amostra NMP NMP NMP NMP Média Amostra NMP NMP NMP pad ,,, 6,,, 2,,,,,, 3,,,,,, ,,, 2,,, ,,, 32,,, ,,, 21,,, ,,, 36,,, ,,, 32,,, ,,, 56,,, ,,, 5,,, ,,, 4,,, ,,, 46, 1,7321, ,,, 7,,, ,,, 7,,, ,,, 66,,, ,,, 7,,, ,,, 5,,, ,,, 1,,, 1,,,,,, 2,,,,,, 21,,,,,, ,,, 5,,, ,,, 7,,, ,,, 74,,, ,,, 1,,, 26,,,,,, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 1,,, 3,,,,,, Soma DPR, Soma DPR, DPRc, DPRc,6

20 Apêndice C Contagens replicadas de suspensões de E. coli, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii no sistema Colilert -/Quanti-Tray após horas e 22 horas de incubação usando Colilert- armazenado a 25 C por até 541 dias (ver Seção 5) Dias após fabricação Número de cavidades positivas Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii h 22h % % % h 22h h 22h variação variação variação % % +% +% +1% +% +1% +% +5% +25% +15% +%

21 % +% 1

22 Apêndice D Intervalos de 5% de confiança e repetibilidade teóricas para cada valor de NMP no Colilert -/Quanti-Tray de 51 cavidades (ver Seção 7) Nº. de cavidades com reação positiva NMP por amostra de 1 ml Intervalos de 5% de confiança Repetibilidade teórica Desvio padrão Inferior da Superior repetibilidade Log 1 SD <1,, 3,7 - - Incerteza relativa padrão CV% 1 1,,3 5,6,4343 1, 2 2,,6 7,3,371 7,7 3 3,1 1,1,,25 57,7 4 4,2 1,7 1,7,22 5, 5 5,3 2,3,3,143 44,7 6 6,4 3,,,74 4, 7 7,5 3,7 15,5,43 37,,7 4,5,1, ,4, 5,3,,5 33,4 1,1 6,1 2,5,76 31,7,4 7, 22,1, 3,2,7 7, 23,,57 2, 15,, 25,7, 27,,4, 27,5,16 26, 15, 1, 2,4,17 26, 1,2, 31,3,12 25,1 2,7, 33,3,1 24,4 22,2,1 35,2,2 23, 1 23, 15,3 37,3,15 23,1 2 25,4,5 3,4,1 22, ,1,7 41,6,5 22,1 22 2, 1, 43,,3 21,6 23 3,6 2,4 46,3,1 21, ,4 21, 4,7,2 2, 25 34,4 23,3 51,2,5 2, ,4 24,7 53,,7 2, 27 3,4 26,4 56,6,56 1,7 2 4,6 2, 5,5,43 1,4 2 42, 2,7 62,5,3 1,1 3 45,3 31,5 65,6,1, 31 47, 33,4 6,,,6 32 5,4 35,4 72,5,7, ,1 37,5 76,2,71, , 3,7,1,73, 35 5,1 42, 4,4,776, 2

23 36 62,4 44,6,,77, , 47,2 3,7,765,6 3 6,7 5,,,761,5 3 73, 53,1,,75,4 4 7,2 56,4 1,2,756,4 41 3,1 5, 1,3,756,4 42,5 63, 6,2,757,4 43 4,5 6,2 5,4,761,5 44,3 73,1 6,,76,7 45 1,1 7,6 15,7,77, 46 1,4 5, 4,5,74,3 47, 2,7 15,,1, 4 4,5,3 224,1,5 1, 4 5,2 5,2 272,2,2 21,4 5 2,5 5, 37,6,14 25,2 51 >2,5 6,1 infinito