Validação de Métodos Analíticos

Transcrição

1 METROALIMENTOS Validação de Métodos Analíticos São Paulo, 25 de setembro de

2 Validação (NBR ISO IEC item ) É a confirmação por fornecimento de evidência objetiva, que os requisitos específicos do método para um determinado uso foram satisfeitos para o uso pretendido 2

3 NORMAS/GUIAS/MANUAIS PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOSM INMETRO ANVISA AOAC FDA IUPAC EURACHEM CODE NATA EUROPEAN COMMUNITIES PERIÓDICOS EM GERAL 3

4 Validação de um método m analítico Características de desempenho Limitações de um método Identificação das influências que podem alterar essas características e qual extensão 4

5 Quando deve ser validado: Modificações no método normalizado Novo método desenvolvido para um problema específico Método estabelecido utilizado em laboratórios diferentes, equipamentos diferentes ou equipes distintas Situações fora do controle interno da qualidade Desempenho insatisfatório em PEP Demonstração de equivalência entre dois métodos (ex: um método novo rápido x método normalizado) 5

6 Verificação de um método m analítico É a confirmação, por fornecimento de evidência objetiva, que os dados das características analíticas fornecidos por um produtor, um laboratório ou instituição de referência foram alcançados As ferramentas são as mesmas da validação O laboratório só precisa verificar se as características de desempenho documentadas podem ser cumpridas (ex: acurácia) 6

7 Critérios rios de decisão para a extensão de uma validação Ponto de vista analítico Condições técnicas e pessoal capacitado Complexidade do método Nível de concentração Ponto de vista político Risco potencial para o cliente/empresa Objetivo real da validação Considerações sobre legislação ou outros requisitos 7

8 Classificação de um métodom Análise de contaminantes (resíduos de pesticidas, metais pesados) Análise de composição dos alimentos Medidas físicas (ph, condutividade) Determinações qualitativas Métodos microbiológicos 8

9 Parâmetro Descrição do método Calibração Parâmetros da validação para cada tipo de métodom Análise de contaminan -tes Análise de Constituintes Métodos convencionais Métodos sem calibração Métodos Físicos Métodos Qualitativos Métodos Bacteriológicos Faixa de trabalho Limite de Detecção Limite de Quantificação Recuperação Repetitividade Acurácia Epecificidade Reprodutibilid ade Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível 9

10 Necessidades comuns de validação para métodos m conhecidos Método Acurácia Precisão Seletividade Linearidade Limites Detecção e Quantificação Robustez AAS,AES,ICP, UV-VIS Polarografia x Titulação Umidade Comatografia Espectroscopi a TOC Eletroforese Capilar Imuno ensaio 10

11 Determinação das características do métodom Calibração Linearidade Sensibilidade Faixa de Trabalho Limite de detecção Limite de quantificação Acurácia Veracidade Precisão Repetitividade Reprodutibilidade Robustez Seletividade 11

12 Determinação das características do métodom Calibração Linearidade Sensibilidade Faixa de Trabalho Limite de detecção Limite de quantificação Acurácia Precisão Repetitividade Reprodutibilidade Robustez Seletividade 12

13 Determinação das características do métodom Características da calibração: Linearidade Sensibilidade Coeficiente de Correlação R 2 >0,99 Linearidade é determinada pelo coeficiente de correlação da curva Sensibilidade é determinada pelo coeficiente da curva de calibração 13

14 Linearidade Detrminada com o uso de padrões com diferentes concentrações e cálculo da regressão Cinco concentrações de padrão, se a linearidade é satisfeita; caso contrário, usar mais padrões 14

15 Calibração Valores de calibração devem ser aplicados dentro da faixa de trabalho Menor concentração da curva deve ser o limite de quantificação Usar soluções padrão, ou curva de adição de padrão Usar pelo menos cinco concentrações do padrão Pode ser determinada: Sensibilidade (resolução) ão) A meio da curva de calibração Pelo uso de amostras com diferentes concentrações 15

16 Determinação das características do métodom Calibração Linearidade Sensibilidade Faixa de Trabalho Limite de detecção Limite de quantificação Acurácia Veracidade Precisão Repetitividade Reprodutibilidade Robustez Seletividade 16

17 Faixa de trabalho Faixa de concentração do analito no qual o método pode ser aplicado com acurácia e precisão Determinação do intervalo de trabalho: Diferentes matrizes Variando as concentrações 17

18 Características da Faixa Limite de detecção LOD =3.s L /b ( Método do Branco) LOD =3.s xo (Método da Curva de Calibração) LOD LOD : limite de detecção s L : Desvio padrão do branco S xo : Desvio padrão da curva de calibração b: coeficiente angular da curva de calibração Convenção LOD = média branco + 3.s L 18

19 Características da Faixa Limite de quantificação LOQ =9.s L /b ( Método do Branco) LOQ =11.s xo (Método da Curva de Calibração) LOQ Várias convenções LOQ : limite de quantificação s L : Desvio padrão do branco S xo : Desvio padrão da curva de calibração b: coeficiente angular da curva de calibração LOD = 5 ou 6 ou 10.s L 19

20 Técnicas Limite de Quantificação Legislação Técnica Limite de quantificação mgl -1 Alumínio AAS Chama 1,1 AAS Forno 0,002 ICP OES 0,040 Limite para água de diálise mgl -1 Alumínio 0,01 ICP MS 0,001 20

21 Determinação das características do métodom Calibração Linearidade Sensibilidade Faixa de Trabalho Limite de detecção Limite de quantificação Acurácia Veracidade Precisão Repetitividade Reprodutibilidade Robustez Seletividade 21

22 Acurácia cia = Precisão + veracidade Acurácia Grau de concordância dos resultados experimentais com o valor de referência aceito ou valor verdadeiro convencional = exatidão do método analítico a) Precisão Grau de concordância entre resultados de ensaios independentes obtidos sob condições específicas Repetitividade Recuperação/ Bias Reprodutibilidade Incerteza b) Veracidade Erro sistemático/valor correto 22

23 Desvios aleatórios e sistemáticos ticos Preciso e Correto Impreciso mas correto Preciso mas incorreto Impreciso e errado 23

24 Características da Acurácia cia a) Veracidade Medida da veracidade, incluindo erros sistemáticos e aleatórios (uso de MRC, comparação com método de referência) b) Precisão Medida do grau de repetitividade, incluindo erros sistemáticos Repetitividade: um laboratório ou Reprodutibilidade interna Reprodutibilidade : mais que um laboratório 24

25 Veracidade Utiliza um dos seguintes métodos para assegurar veracidade: Análise de MRC Participação em PI Comparação com método de refer6encia Se não disponível: Documente qualquer dado que prove veracidade Providencie MRC Use um método similar em paralelo 25

26 Precisão Grau de concordância entre resultados de ensaios independentes obtidos sob condições específicas Geralmente expressa como desvio-padrão ou desvio-padrão relativo; As medições mais comuns de precisão são: repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade Depende da concentração do analito Repetitividade: Mesma amostra Mesmo método Mesmo analista Mesmo laboratório Curto espaço de tempo 26

27 Recuperação Determinada com a adição do analito à matriz Matriz deve ser homogenea, livre do analito ou em concentração abaixo do LOQ, ou preparar uma matriz de composição similar Recuperação só poderá ser feita se o analito estiver disponível na forma pura e na mesma forma que ocorre na natureza 27

28 Concentração analito versus RSD e recuperação Conc. analito Razão analito% Unidade RSD % Recuperação % % 1, % 2, % 2, , ,1% 3, , ppm 5, , ppm 7, , ppm , ppb , ppb , ppb Fonte: Huber, L, 1998

29 Correção pela Recuperação Análise de uma amostra % Recuperação do método=70% Limite da legislação: 5 µg/kg Laboratório Resultado (µg/kg) Recuperação Conclusão A 4,0 Sem correção Satisfatório B 6,8 Corrigido Insatisfatório 29

30 Reprodutibilidade Interna Comparação de Desvio padrão Desvio padrão de replicatas Externa Participação em PEP Participação em PI 30

31 CRITÉRIOS RIOS DE ACEITAÇÃO DE REPETITIVIDADE E REPRODUTIBILIDADE Conc. Repetitividade CV Reprodutibilidade CV C > 1 ppm < 14% < 19% 100 ppb < C 1ppm < 18% < 25% 10 ppb < C 100 ppb < 22% < 34% 1 ppb < C 10 ppb < 32% < 46% C 1ppb < 36% < 54% Fonte: FAO 31

32 Participação em PEP ou Estudos colaborativos PEP - Método mais aceito para a validação Estudos Colaborativos - Vários problemas práticos para quem organiza Custo, tempo Coordenação Remessa de amostras Análise estatística e interpretação de resultados. 32

33 Análise de Materiais de Referência Geralmente aceito na validação de método Materiais fornecidos com certificados O analista deve demonstrar que o método é exato e preciso 33

34 Determinação das características do métodom Calibração Linearidade Sensibilidade Faixa de Trabalho Limite de detecção Limite de quantificação Acurácia Veracidade Precisão Repetitividade Reprodutibilidade Robustez Seletividade 34

35 Seletividade e Especificidade Extensão no qual um analito pode ser determinado em uma mistura complexa Seletividade/ Especificidade Demonstra interferentes e restrição ao uso do método Codex recomenda o uso do termo seletividade 35

36 Determinação das características do métodom Calibração Linearidade Sensibilidade Faixa de Trabalho Limite de detecção Limite de quantificação Acurácia Veracidade Precisão Repetitividade Reprodutibilidade Robustez Seletividade 36

37 Robustez Mede a sensibilidade que um método apresenta, face a pequenas variações: Tempo Temperatura Marca de reagente Tamanho da amostra Concentração de ácido Agitação É determinada pelo teste de Youden 37

38 Validação é sempre o equilíbrio entre custos, riscos e possibilidades técnicas 38

39 Muito Obrigada! Alice M. Sakuma Fone: