Avaliação do Legiolert na deteção e quantificação de Legionella pneumophila em amostras de água

Transcrição

1 Avaliação do Legiolert na deteção e quantificação de Legionella pneumophila em amostras de água Sílvia Monteiro e Ricardo Santos, Laboratório Análises, Instituto Superior Técnico Silvia.monteiro@tecnico.ulisboa.pt

2 Legionella pneumophila Principal responsável pelos surtos de Legionella Bactéria saprófita, encontrada naturalmente no ambiente aquático e em solos

3 Sistemas de água quente

4 Chuveiros

5 Água Fria

6 Instalações Termais

7 Aerosois Lamas

8 Ar Condicionado

9 Torres de Refrigeração

10 Aspersores Lagos Artificiais

11 Parasita intracelular de amebas: Acanthamoeba castellanii, espécies de Hartmannella ou de Naegleria

12 Biofilme

13 Técnicas para detecção de Legionella

14 Técnicas para detecção de Legionella ISO 11731:2017 Baseada na detecção de Legionella em meio de cultura selectivo PCR em tempo real

15 Técnicas para detecção de Legionella ISO 11731:2018 PCR em tempo real Baseada na detecção de Legionella por amplificação de DNA

16 ISO 11731:2017 Vantagens Determinação de células de Legionella viáveis e cultiváveis Distinção entre serogrupos de Legionella pneumophila Isolamento de colónias de Legionella penumophila para tipagem em situações de surto Desvantagens Técnica fastidiosa Tempo desde colheita até obtenção de resultados bastante elevado Ocorrência de falsos negativos Requer bastante treino Amostras com elevado grau de interferentes apresentam acrescida dificuldade

17 Legionella viáveis Legionella viáveis-não cultiváveis Legionella dentro de protozoários Espécies que não crescem em GVPC Legionella Mortas

18 ISO 11731:2017 Vantagens Determinação de células de Legionella viáveis e cultiváveis Distinção entre serogrupos de Legionella pneumophila Isolamento de colónias de Legionella penumophila para tipagem em situações de surto Desvantagens Técnica fastidiosa Tempo desde colheita até obtenção de resultados bastante elevado Ocorrência de falsos negativos Requer bastante treino Amostras com elevado grau de interferentes apresentam acrescida dificuldade

19

20 PCR em tempo real Vantagens Resposta rápida (~4h) Elevada sensibilidade Amostras com elevado grau de interferentes não apresentam dificuldades devido a elevada especificidade Detecção de Legionella independentemente do seu estado fisiológico Detecção de todas as espécies de Legionella Desvantagens Requer bastante treino e sensibilidade Potencial para falsos positivos Em situações de surto em que esta técnica é utilizada, será de uma maneira geral necessário cultivar as amostras para obter colónias isoladas Compostos inibidores de reacção Discriminação entre serogrupos de Legionella pneumophila

21 Legionella viáveis Legionella viáveis-não cultiváveis Legionella dentro de protozoários Espécies que não crescem em GVPC Legionella Mortas

22 PCR em tempo real Vantagens Resposta rápida (~4h) Elevada sensibilidade Amostras com elevado grau de interferentes não apresentam dificuldades devido a elevada especificidade Detecção de Legionella independentemente do seu estado fisiológico Detecção de todas as espécies de Legionella Desvantagens Requer bastante treino e sensibilidade Potencial para falsos positivos Em situações de surto em que esta técnica é utilizada, será de uma maneira geral necessário cultivar as amostras para obter colónias isoladas Compostos inibidores de reacção Discriminação entre serogrupos de Legionella pneumophila

23 TM LEGIOLERT

24 LEGIOLERT TM Novo sistema para quantificação de Legionella pneumophila em amostras de água potáveis e não potáveis

25 LEGIOLERT TM Baseado na detecção de uma enzima que indica a presença de Legionella pneumophila através da utilização do substrato presente no reagente Legiolert

26 LEGIOLERT TM Reacção positiva para Legionella pneumophila Reacção negativa para Legionella pneumophila

27 LEGIOLERT TM Fácil e rápido de executar similar ao Colilert Resultados obtidos em 7 dias (para concluir negatividade das amostras) Detecta Legionella pneumophila: todos os serogrupos

28 Objectivo do estudo Comparação entre Legiolert TM, ISO 11731:2018 e PCR em tempo real em amostras de água potável e não potável

29 Métodos

30 Métodos + ISO 11731:2017: inoculação de amostra direta, tratamento ácido e calor em BCYE e GVPC BCYE com cisteína BCYE sem cisteína Serogrupo PCR: Concentração amostra + pretratamento viabilidade + extracção Amplificação e detecção por PCR Quantificação e Serogrupo LEGIOLERT TM

31 100 ml Métodos Legiolert TM Água Potável 100 ml amostra de água 100 ml amostra de água 100mL Legiolert + amostra Determinar dureza da água Adicionar 0.33 ou 1mL suplemento dureza Adicionar reagente Legiolert à amostra de água Verter para Quanti- Tray, selar, e incubar a 39 C 7 dia = Resultado confirmado

32 Métodos Legiolert TM Água não Potável Amostra de água Pretratam ento Legiolert 100mL diluente estéril Adicionar reagente Legiolert a 100 ml diluente estéril Misturar 2 ml amostra com 2 ml pretratamento; esperar 60 s 100mL Legiolert + Amostra Adicionar 2 ml amostra de água tratada Verter para Quanti- Tray, selar, e incubar a 37 C 7 dia = Resultados confirmado

33 Resultados

34 % Amostras Positivas Resultados Total de 177 amostras de água analisadas: 165 amostras de água potável e 12 amostras de água não potável Percentagem Amostras Positivas Legiolert PCR Cultura Método 6

35 Resultados Resultados 1L volume 1L Legiolert Total 177 Positivo Negativo ISO 11731:2017 Positivo 11 1 Negativo Legiolert PCR Positivo Negativo ISO 11731:2017 PCR Positivo Negativo 0 147

36 % Amostras Positivas Resultados Percentagem Amostras Positivas Legiolert, PCR e Cultura Legiolert e PCR Legiolert e Cultura PCR e Cultura Métodos

37 Resultados Teste de McNemar Legiolert Total 177 Positivo Negativo ISO 11731:2017 X 2 -Valor 23,310 ρ = 1.0 x 10-6 (dif.) Legiolert PCR X 2 -Valor 1,73 ρ = (n. dif.) ISO 11731:2017 PCR X 2 -Valor - ρ = 8.0 x 10-6 (dif.)

38 Resultados Correlação quantitativa entre Legiolert TM e Cultura (correlação Spearmans r = 0.377, n=53) Correlação quantitativa forte entre PCR e Cultura (correlação Spearmans r = 0.616, n=53)

39 Resultados R = 0.379

40 Resultados R 2 = 0.617

41 Conclusões

42 Conclusões Detecção robusta de Legionella pneumophila, com baixa interferência Não é necessária confirmação extra: positivo = confirmado Poucos falsos negativos Baixa subjectividade e baixa incerteza na contagem Range de contagem alargado, com poucos resultados superiores ao limite máximo de contagem não sendo, portanto, necessário fazer novo teste da amostra

43 Conclusões Teste fácil de executar, reacção colorimétrica como Colilert Aplicável a águas potáveis e não potáveis Técnica com elevado nível de reprodutibilidade e repetibilidade No caso de investigações epidemiológicas, os poços podem ser furados para isolamento de colónias

44 I just can't go with the flow anymore. I've been thinking about joining a biofilm.