Isolamento e Identificação de Legionella spp.

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1 Isolamento e Identificação de Legionella spp. Milton Costa Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Coimbra e Biocant Associação de Transferência de Tecnologia, Cantanhede

2 Primeiros passos Prof. Luis de Oliveira, Director Clínico das Termas do Luso, pretende saber se existem legionelas nastermas. Fui fazer um curto estágio no PHLS, Porton Down, UK com Julian Dennis. Primeiros isolamentos de Legionella spp. em tabuleiros de água morna na unidade de prematuros no Hospital Pediátrico de Coimbra. Veríssimo, A., G. Vesey, M. G. Rocha, G. Marrão, J. Colbourne, P. J. Dennis & M. S. da Costa. (1990) A hot water supply as the source of Legionella pneumophila in incubators of a neonatology unit. Journal of Hospital Infections, 15: O António Verissimo e eu relacionámos as temperaturas de isolamento de Legionella com temperatura de nascentes termais e decidimos saber se colonizavam nascentes termais. Veríssimo, A., G. Marrão, F. Gomes da Silva & M. S. da Costa. (1991) Distribution of Legionella spp. in hydrothermal areas in Continental Portugal and on the Island of S. Miguel, Azores. Applied and Environmental Microbiology, 57:

3 As espécies do género Legionella L. adelaidensis L. anisa L. belardiensis L. birminghamensis L. bozemanii L. brunensis L. busanensis L. cherrii L. cincinnatiensis L. drancurtii L. dresdenensis L. drozanskii L. dumoffii L. erythra L. fairfieldensis L. fallonii L. feeleii L. geestiana L. gormanii L. gratiana L. gresilensis L. hackeliae L. impletisoli L. israelensis L. jamestowniensis L. jordanis L. lansingensis L. londiniensis L. longbeachae L. lytica L. maceachernii L. massiliensis L. micdadei L. moravica L. nagasakiensis L. nautarum L. oakridgensis L. parisiensis L. pneumophila L. quateirensis L. quinlivanii L. rowbathamii L. rubrilucens L. sainthelensi L. santicrucis L. shakespearei L. spiritensis L. steigerwaltii L. tauriensis L. tucsonensis L. tunisiensis L. wadsworthii L. waltersii L. worsleiensis L. yabuuchiae Cerca de 22 espécies associadas a doença

4 Imunofluorescência indirecta Anticorpos Policlonais Anticorpos Monoclonais para L. pneumophila L. pneumophila sg 1 L. micdadei L. pneumophila sg 2 L. santicrucis L. pneumophila sg 3 L. spiritensis L. pneumophila sg 4 L. steigerwaltii L. pneumophila sg 5 L. wadsworthi L. pneumophila sg 6 L. dumofii L. pneumophila sg 7 L. gormanii L. pneumophila sg 8 L. oakridgensis L. pneumophila sg 9 L. londiniensis L. pneumophila sg 10 L. moravica L. pneumophila sg 11 L. nautorum L. pneumophila sg 12 L. pneumophila sg 13 L. pneumophila sg 14 L. pneumophila sg 15 L. bozemanii sg1 L. bozemanii sg2 L. erythra L. feelei sg1 L. feelei sg2 L. israelensis L. jamestowniensis L. jordanis L. longbeachae sg1 L. longbeachae sg2 L. rubrilucensis MAB 1 MAB 2 MAB 3 W32 33G2 32A12 144C2 W29 P4C3 P9C3 P W36 W W39 JR5 K1 G6 Um flagelante

5 Processar amostras Amostra de água Filtração Norma ISO Concentrado Directo Tratamento calor Tratamento ácido Espalhamento em GVPC ou BCYE Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias ou a temperaturas mais baixas

6 Identificação presumptiva Visualização das colónias suspeitas Norma ISO Identificação presumptiva de Legionella spp. BCYE BCYE sem cisteína Purificação Preservação Identificação Latex Ser1, Ser2-14, Ser2-15 Ácidos gordos ou 16s rrna

7 Identificação de Legionella a partir dos perfís proteicos Veríssimo, A., P. V. Morais, A. Diogo, C. Gomes & M. S. da Costa. (1996) Characterization of Legionella species by numerical analysis of whole-cell protein electrophoresis International Journal of Systematic Bacteriology, 46:

8 Identificação de Legionella pelos ácidos gordos 6790 amostras examinadas entre 1997 e 2013 para legionelas. Cerca de 1600 estirpes de Legionella identificadas pela análise dos ácidos gordos. Este banco de dados, foi adoptado pela MIDI e estamos agora acreditadso o método dentro da Norma ISO e prnp4422. Em casos de dúvida podemos pesquisar o gene dota for PCR para confirmar L. pneumophila. De 375 estirpes de Legionella, só Temos conservadas todas as estirpes de espécies de Legionella isoladas desde. As não-pneumophila, mais isoladas pertencem a L. oakridgensis, L. londiniensis, L. parisiensis, L. steigerwaltii Diogo, A., A. Veríssimo, M. F. Nobre & M. S. da Costa. (1999). Usefulness of fatty acid composition for the differentiation of Legionella species. Journal of Clinical Microbiology, 37:

9 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Santos, P., I. Pinhal, F. A. Rainey, N. Empadinhas, J. Costa, B. Fields, R. Benson, A. Veríssimo & M. S. da Costa (2003). The Gamma-Proteobacteria, Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov. and Aquicella siphonis, sp. nov., infect protozoa and require activated charcoal for growth in laboratory media. Applied and Environmental Microbiology, 69:

10 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Parentes mais próximos são Rickettsiella (doença em insectos). Rickettsiella spp., parasitas intracelulares, nunca foram cultivadas. Legionella spp. e Aquicella spp. são cultiváveis. Aquicella spp. Crescem só em meios com carvão, extracto de levedura e a-cetoglutarato ou piruvato. Crescimento aeróbio ou microaeróbio. Não cresce em anaerobiose.

11 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Este processo permitiu-nos examinar várias condições de crescimento de Legionella e Aquicella que não seria possível com meios sólidos contendo carvão. Gama de temperatura de crescimento, Gama de ph de crescimento, Substratos assimilados, Meio de cutura líquido Espaçamento de agar Carvão Activado

12 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Thermomonas hydrothermalis Meiothermus cerbereus Albidovulum inexpectatum ph 9.0 ph 10.0 Legionella oakridgensis Legionella anisa Aquicella lusitana Aquicella siphonis ph

13 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Aquicella spp. infectam Hartmanella vermiformis Hartmannella vermiformis Infecção crónica (10 3 /cell), não é aguda ( /cell) como Legionella spp. Aquicella lusitana Aquicella siphonis Células humans infectadas com Legionella Aquicella spp. não infectam macrófagos humanos

14 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem mip gene dota gene 2642 bp 500 bp 697 bp 1- Marker 2- Sgt 39 (Aquicella) 3- Sgt 108 (Aquicella) 4- L. pneumophila 5- L. anisa 1- Marker 2- L. pneumophila 3- L. anisa 4- Sgt 39 (Aquicella) 5- Sgt 50 (L. pneumophila) 6- Sgt 59 (L.pneumophila) 7- Sgt 108 (Aquicella)

15 AS PESSOAS E AS ORGANIZAÇÔES FINANCIADORAS António Verissímo Fernanda Nobre Joana Costa Graça Rocha Gina Marrão Alexandra Diogo Paula Morais Richard Bowker Barry Fields Fundação para a Ciência e a Tecnologia Sociedade das Águas de Luso, SA Cinágua