Métodos laboratoriais para pesquisa e identificação de Legionella species em amostras ambientais

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1 Métodos laboratoriais para pesquisa e identificação de Legionella species em amostras ambientais 05 de abril de 2018 Raquel Esaguy Rodrigues raquel.rodrigues@insa.min-saude.pt

2 Enquadramento Geral > 61 espécies e 70 serogrupos distintos; Pelo menos 26 espécies de Legionella estão associadas a doenças no ser humano, como por exemplo, Legionella micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii, e L. longbeachae; Fonte: Norma ISO 11731:2017 Legionella pneumophila (16 serogrupos) é responsável por 70 a 90% das infeções no Homem. 2

3 Bacilos gram-negativos; Características Gerais: 0,3 a 0,9 m de largura; 2 a 20 m de comprimento; Móveis, exceto Legionella oakridgensis; Algumas espécies exibem fluorescência quando observadas sobre luz U.V; L-cisteína e sais de ferro; Crescem em BCYE e GVPC. Aspeto vidro-martelado 3

4 Habitat Ambiente: rios, lagos, ribeiros, nascentes, solos húmidos e águas subterrâneas Reservatórios artificiais: torres de arrefecimento de ar condicionado, sistemas de distribuição de água, condensadores, entre outros; Capazes de se multiplicarem em 14 espécies de amibas e em 2 espécies de protozoários ciliados; Bactérias do género Legionella, tornam-se mais resistentes a condições adversas quando associadas a biofilmes. 4

5 Condições favoráveis ao desenvolvimento da Legionella Temperatura da água entre 20ºC e 45ºC; Redução dos níveis de cloro; Estagnação da água, pontos mortos na rede de abastecimento; Matéria orgânica, sedimentos, biofilmes; Presença de algas, fungos, protozoários e outras bactérias; Reservatórios de água artificiais: corrosão, incrustações. 5

6 Infeções e sintomas provocados nos seres humanos LEGIONELOSE Doença dos Legionários (pneumonia) Má disposição (dores de cabeça e tosse) Febres muito altas, arrepios Diarreia e vómitos Febre de Pontiac (síndrome gripal) Sintomas idênticos a uma constipação Período de incubação 24 a 48 horas Período de incubação 2 a 10 dias 6

7 Risco de infeção depende de fatores como: Concentração de Legionella na água; Condições para a sua multiplicação; Patogenicidade da bactéria; Formação de aerossóis; Tempo de exposição; Suscetibilidade do indivíduo exposto. 7

8 Caracterização da Doença dos Legionários em Portugal Alguns exemplos publicados de surtos epidémicos da Doença dos Legionários em território nacional: 1994 Hospital de Santa Cruz em Lisboa; 1997 Unidade hoteleira no Algarve; 2000 Concerto de Rock, Município de Vizela; 2006 Hospital de Coimbra Hospital de Bragança Vila Franca de Xira (375 casos de doença e 12 óbitos) Hospital São Francisco Xavier 2018 Hospital CUF Descobertas 8

9 Caracterização da Doença dos Legionários em Portugal casos; casos; casos; casos; casos; casos; casos; casos; casos; casos; casos; casos; Casos confirmados apenas Fonte: Vigilância em saúde Pública: Doença dos Legionários em Portugal 2004_2013 _DGS (2014) SURVEILLANCE REPORT - Annual epidemiological report for 2015 _ECDC 9

10 Legislação Nacional Portaria 1220/2000, de 29 de Dezembro, aplicada apenas às águas minerais naturais e as águas de nascente. Parâmetros Valores Máximos Recomendados Legionella pneumophila Legionella spp. não pneumophila Por ingestão e em contacto com as mucosas Não detetada/l Não detetada/l Por via externa Não detetada/l 100 ufc/l 10

11 Legislação Nacional (cont) Portaria n.º 353-A/2013, de 4 de dezembro. Parâmetro Legionella spp Condições de referência Concentração inferior a 100 ufc/l, exceto no caso da pesquisa em tanques de torres de arrefecimento em que deve verificar-se uma concentração inferior a 1000 UFC/L. Ausência de Legionella pneumophila. 11

12 Orientação Número 20/

13 Orientação Número 20/

14 European Technical Guidelines for the prevention, control and investigation of infeccions caused by Legionella species (2017) O método de PCR em Tempo real pode ser útil na investigação de potenciais fontes de infeção e na monitorização das ações corretivas aplicadas; ( ) Continua a não haver consenso na interpretação dos resultados obtidos por esta metodologia. 14

15 European Technical Guidelines for the prevention, control and investigation of infeccions caused by Legionella species. (2017) Um resultado negativo por PCR é praticamente certo que será igualmente um resultado negativo pelo método cultural; Este momento é recomendado para uma realização de uma análise rápida a diversos locais de colheita associados a casos/surtos de modo a eliminar rapidamente os negativos e identificar os positivos. No entanto, os resultados devem ser sempres confirmados pelo método cultural _ Gold Standard. 15

16 Componente Ambiental Norma ISO 12869: 2012 Water quality Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Norma ISO 11731:2017 Water Quality - Enumeration of Legionella 16

17 PCR em Tempo Real (RT-PCR) Técnica que possibilita a monitorização do estado de uma reação de PCR, através da adição de um sinal (fluorescência) emitido em cada ciclo da reação de PCR, como um indicador de amplificação produzida; Possibilita a medição do aparecimento dos produtos amplificados durante o próprio processo de amplificação, para resultados quantitativos e qualitativos: deteção qualitativa (resposta Sim/Não) quantificação absoluta (resultado: p.ex. UG/ L) 17

18 Protocolo de colheitas de amostras Colheita de 2 L de amostra de água. As amostras devem ser entregues no Laboratório o mais rapidamente possível, de preferência no prazo de 24h e não excedendo as 48 horas. Caso a amostra seja analisada no prazo de 24 horas, estas devem ser guardadas à temperatura ambiente. Caso só sejam processadas no prazo de 48 horas, estas devem ser armazenadas entre 2ºC a 8ºC. NOTA: Amostras de água que sofreram tratamento por biocida só devem ser submetidas a este tipo de análise 48 horas após a realização do mesmo. 18

19 Protocolo do PCR em Tempo Real Concentração da amostra através de filtração - membranas de policarbonato; Extração de DNA; PCR em Tempo Real Qualitativo; PCR em Tempo Real Quantitativo; Expressão de resultados. 19

20 Amplificação do gene pretendido 20

21 Interpretação resultados 1º Análise: Presença / Ausência Legionella spp e Legionella pneumophila; 2ª Análise: Quantificação de Legionella spp e Legionella pneumophila (resultado expresso em Unidades Genómicas (UG)). 21

22 Apresentação Resultados Curvas de amplificação amostras positivas 22

23 Apresentação de um caso real _ Inquérito Epidemiológico Leg. spp 23

24 Apresentação de um caso real _ Inquérito Epidemiológico Leg. spp 24

25 Apresentação de um caso real _ Inquérito Epidemiológico Leg. pneumophila 25

26 Apresentação de um caso real _ Inquérito Epidemiológico Leg. pneumophila 26

27 Vantagens do método de PCR em Tempo Real Capacidade de resposta em poucas horas; Extremamente sensível; Necessita de quantidades de DNA muito inferiores às necessárias para uma reação de PCR. 27

28 Desvantagens PCR em tempo Real Elevado custo; Necessidade de pessoal técnico qualificado para a correta interpretação dos resultados obtidos; Não existência de correlação entre UG (unidades genómicas) e UFC (Unidades formadoras de colónias) Grande entrave em Termos Legislativos. 28

29 Método Cultural Sementeira direta em amostras suspeitas de elevada contaminação por Legionella (>10 4 UFC/L). Filtração por membrana, seguida de sementeira direta em meio de cultura. Filtração por membrana, seguida de um processo de eluição. 29

30 Método Cultural Norma ISO Filtração Sementeira da amostra em BCYE e GVPC Incubação 7 a 10 dias, a 36±2ºC Leitura e Confirmação das colónias suspeitas; Identificação Legionella pneumophila ou Legionella spp. não pneumophila (Teste de aglutinação) 30

31 Método Cultural ISO Filtração Sementeira da amostra Sem tratamento Tratamento da amostra Calor Ácido Calor +Ácido 0,1 ml GVPC; BCYE e/ ou BCYE +AB Incubação 7 a 10 dias, a 36±2ºC Leitura e Confirmação das colónias suspeitas; Identificação Legionella pneumophila ou Legionella spp. não pneumophila (Teste de aglutinação) 31

32 Método Cultural: ISO Matriz de decisão 1º passo: determinar a origem a as características da água; 2º passo: determinar o nível de deteção desejado (LD_limite de deteção); 3º passo: selecionar os tratamentos a serem efetuados; 4º passo: Selecionar o(s) meio(s) de cultura a ser(em) utilizado(s). 32

33 Método Cultural: ISO 11731: Matriz de decisão Inoculação direta : Limite de deteção ufc/l. (1,0x10 4 ufc/l) Filtração por membrana _ inoculação direta: filtração de 10 ml de amostra, o limite de deteção é de 100 ufc/l. Filtração por membrana seguida de eluição: filtração de 1 Litro de amostra, o limite de deteção é de 50 ufc/l. 33

34 Colónias características : Leitura das placas Colónias que crescem em meio específico (GVPC), nunca antes das 48 horas de incubação, podendo apresentar uma coloração branca, esverdeada ou outras cores, com aspeto vidro moído. Sem tratamento Calor Ácido 34

35 Leitura das placas Leitura das placas após incubação, com o auxilio de uma lupa binocular com luz incidente num ângulo de 45º; 35

36 Identificação das colónias suspeitas Reisolamento de colónias suspeitas em BCYE e BCYE sem cisteína (ou gelose de sangue) Seroaglutinação com Kit comercial: o kit utilizado no laboratório inclui partículas azuis de látex, sensibilizadas com anticorpos que aglutinam na presença de antigénios específicos da parede celular da Legionella, formando agregados visíveis a olho nu; Permite distinguir entre: L. pneumophila (serogrupos 1, 2-14 ou 2-15) e Legionella spp. não L. pneumophila: 36

37 Amostra proveniente de uma Torre de Refrigeração _ Caso Real Placa de GVPC - concentrado sem tratamento Placa de GVPC - concentrado com tratamento por calor Placa de GVPC - concentrado com tratamento por ácido 37

38 Amostra proveniente de uma Torre de Refrigeração _ Caso Real Placa de GVPC - direto sem tratamento Placa de GVPC - direto com tratamento por calor Placa de GVPC - direto com tratamento por ácido 38

39 Expressão dos resultados Não detetada (LD=50 ufc/l) Positiva Nº ufc / L (ufc unidades formadoras de colónias) Legionella pneumophila serogrupo 1 Legionella pneumophila serogrupo 2-14 ou 2-15 Legionella spp. não pneumophila 39

40 Método Cultural Vantagens: Capacidade de isolar as diferentes estirpes de Legionella; Possibilidade de descobrir o agente etiológico nos IE; Possibilidade de comparação de estirpes clínicas com estirpes ambientais; Apenas são recuperadas as bactérias viáveis. Método complexo e exigente em tempo, meios de cultura, reagentes e experiência técnica. 40

41 Apesar de ainda haver alguma discussão acerca da comparação dos resultados obtidos pelos dois métodos referidos (cultural versus PCR em Tempo Real), estes podem ser usados de uma forma expedita e complementar na análise de amostras ambientais. O PCR em Tempo Real deve ser a primeira escolha sempre que se necessita de um resultado rápido. Este método é capaz de produzir resultados definitivos em menos de 12 horas, o que se traduz numa mais valia em situações de risco. De ressalvar que as amostras positivas por PCR em Tempo Real devem ser confirmadas pelo método cultural, o que permitirá também complementar a identificação da espécie e serogrupo da Legionella em causa. 41

42 Muito obrigada! 42