OBTENÇÃO DA GALACTOMANANA DA FAVA D ANTA (Dimorphandra gardineriana): AVALIAÇÃO DE DOIS MÉTODOS DE OBTENÇÃO

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1 OBTENÇÃO DA GALACTOMANANA DA FAVA D ANTA (Dimorphandra gardineriana): AVALIAÇÃO DE DOIS MÉTODOS DE OBTENÇÃO Pablyana L. R. Cunha 1, Matheus Y. M. Matos 1, Judith P. A. Feitosa 1* 1 Depto. de Química Orgânica e Inorgânica da UFC, Caixa Postal , Fortaleza/CE *judith@dqoi.ufc.br Isolation of a galactomannan from the seed of Fava d anta (Dimorphandra gardineriana): comparison between methods A galactomannan from the seed of a native plant of Chapada do Araripe, Ceara State, popularly named as "fava d anta" (Dimorphandra gardeniana) was obtained by two different methods and the gum samples characterized. Elemental microanalysis, FT-IR, NMR, chromatography and rheology were the techniques used in the characterization. In Method 1 (GALM1) the seed was swollen in hot water and in Method 2 (GALM2) the seeds was immersed in NaOH at 5% (wt%) concentration for the endosperm removal. Besides the presence of the expected monosaccharide (galactose and mannose), GALM1 had glucose and GALM2 had glucose and arabinose, as contaminant sugars. GALM1 showed higher molar mass and viscosity, and a smaller content of protein. The mannose/galactose ratio was 1.58:1. The Method 1 is the best one considering the smaller amount of contaminants, and the highest yield. Introdução Galactomananas são polissacarídeos de reserva, oriundos de endosperma de sementes pertencentes à família Leguminosae. São classificadas como gomas originárias de sementes. São solúveis em água e formam dispersões viscosas e estáveis [1]. São constituídas por manose, que forma uma cadeia principal de manana com ligações β 1-4, ramificada com resíduos de galactose ligados à cadeia principal com ligações α 1-6 [2]. Estas estão presentes em sementes de diversas espécies em todo mundo, mas suas principais fontes comerciais são a goma guar, goma caroba ou locusta e goma tara [3]. Estas gomas são compostas por galactomananas com razão manose:galactose variável. A goma guar tem sido utilizada como suplemento de fibra solúvel [4], sendo também eficaz na diminuição de hiperglicemia e de colesterol [5]. Faveira ou fava d anta são os nomes comuns das plantas Dimorphandra gardeniana Tul. e Dimorphandra mollis Benth. A espécie Dimorphandra gardeniana é uma planta nativa da Chapada do Araripe, no Sul do Ceará. A rutina, extraída da fava d'anta, é usada para retardar o envelhecimento e tratar de doenças típicas da velhice. Melhora a circulação sanguínea e alivia as dores de varizes e hemorróidas por meio de mecanismos ainda desconhecidos [6]. O aproveitamento das sementes de fava danta para a produção de galactomanana pode aumentar o valor econômico da Dimorphandra gardeniana Tul. e Dimorphandra mollis Benth [7], já que com a quantidade de favas das duas espécies que são produzidas anualmente, é possível obter uma quantidade de sementes superior a 660 toneladas [7].

2 O objetivo deste trabalho é testar dois métodos de obtenção da galactomanana da planta fava d anta e caracterizar as galactomananas obtidas em cada um destes métodos. Experimental 1. Obtenção da galactomanana da planta fava d anta (Dimorphandra gardineriana) Vagens da Fava d anta foram coletadas na Chapada do Araripe, na região do Cariri, no estado do Ceará. As sementes foram retiradas das vagens manualmente. Foram testados dois métodos de obtenção da galactomana Isolamento em água Método 1 30 gramas de semente de fava d anta foram pesadas e postas para intumescer em 200 ml de água fervente por 20 minutos sob agitação magnética. Após este tempo, as sementes foram deixadas em repouso por 24 horas à temperatura ambiente. Parte das sementes se apresentou intumescida e foi então descascada manualmente, retirando também o tegumento e o gérmen. As sementes que não intumesceram foram separadas e pesadas. O endosperma obtido foi posto para intumescer em 200 ml de água sob agitação magnética por 12 horas a temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado a um volume de 500 ml de água e após uma rápida agitação a mistura foi triturada em liquidificador. À solução viscosa obtida foi adicionada mais 500 ml de água e deixada sob agitação magnética por 2 horas. Logo em seguida, esta solução foi centrifugada por 30 minutos a 6000 rpm. Após a centrifugação, a solução sobrenadante foi separada e o material que sedimentou foi mais uma vez adicionado a água (150 ml) sob agitação magnética, e centrifugado a 6000 rpm por 30 minutos. A solução sobrenadante obtida nesta etapa foi misturada com a solução sobrenadante anterior. Esta solução, que contém a galactomanana, foi posta para precipitar contra álcool etílico comercial 96% na proporção de 1:2 volume de solução de goma/volume de álcool. O precipitado de galactomanana obtido foi filtrado em funil de placa sinterizada porosidade média, e lavado com álcool etílico comercial e acetona p.a. Depois foi levado para um almofariz, onde foi secado com auxílio de jato de ar quente. O material seco obtido foi denominado de GALM1. A goma foi pesada e o procedimento teve seu rendimento calculado Isomento em NaOH Método 2 10 gramas de semente de fava d anta foram pesadas e imersas em 100 ml de solução de NaOH 5% e deixada sob agitação magnética durante 24 horas. Parte das sementes se apresentou intumescida e foi descascada manualmente, retirando-se também o tegumento e o gérmen. As sementes que não intumesceram foram separadas e pesadas.

3 O endosperma obtido foi posto para intumescer em 150 ml sob agitação magnética por 12 horas. Posteriormente foi adicionado um volume de 500 ml de água e após uma rápida agitação, a mistura foi triturada. À solução viscosa foi deixada sob agitação magnética por 2 horas. Logo em seguida, esta solução foi centrifugada por 30 minutos a 6000 rpm. Após centrifugação, a solução sobrenadante foi tratada como descrito anteriormente e o material seco obtido foi denominado de GALM2. Esta foi pesada e o procedimento teve seu rendimento calculado. 2. Caracterização das galactomananas obtidas pelos Métodos 1 e Análise Elementar Teor de proteínas As amostras GALM1 e GALM2 foram analisadas por análise elementar em um microanalisador CARLO ERBA EA1108. O teor de proteínas foi estimado pelo percentual de nitrogênio, utilizando-se um fator de conversão de 5, Composição monossacarídica As amostras GALM1 e GALM2 foram levadas a alditol-acetato e analisadas em um cromatógrafo líquido-gás Hewlett Packard, modelo 5890A serie II, coluna DB-225 from BAScientific (0.25mm i.d. 30 m), usando nitrogênio como gás de fluxo e acetona como eluente Espectroscopia de absorção na região do infravermelho Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em espectrômetro FT-IR da Shimadzu modelo IR Prestige 21 com varredura de 400 a 4000 cm -1. Para obtenção dos espectros, as amostras foram misturadas a brometo de potássio para obtenção de pastilhas Ressonância Magnética Nuclear de 1 H da GALM1 O espectro de 1 H da GALM1 foi obtido em espectrômetro BRUKER modelo AVANCE- DMX-500 (CENAUREMN DQOI- UFC), acoplado a um transformador de Fourier. As amostras foram dissolvidas em água deuterada durante 12 horas. A freqüência de observação do núcleo foi de 500 MHz ( 1 H) Estimativa da distribuição de massa molar por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) As soluções de GALM1, GALM2 foram preparadas na concentração de 0,1% em NaNO 3 0,1M por agitação magnética durante 12 horas. Estas soluções foram então filtradas em membrana MILIPORE 0,45 µm. A distribuição da massa molar foi determinada através de Cromatografia de Permeação em Gel, utilizando um equipamento SHIMADZU acoplado a um detector de índice de refração (RID- 6A). Foi utilizada uma coluna Ultrahydrogel Linear de 7,8 x 300 mm, com fase móvel NaNO 3 0,1M, à temperatura ambiente e fluxo de 0,5 ml/min. O volume injetado das amostras foi de 50 µl.

4 A curva padrão para a determinação da massa molar foi construída utilizando-se padrões de pululana com massas molares no intervalo de 10 3 a 10 5 g/mol Reologia de fluxo Os estudos reólogicos de fluxo foram realizados para soluções de GALM1 e GALM2 na concentração de 1% em água. A reologia de fluxo das amostras foram realizadas em reômetro da TA INSTRUMENTS, modelo AR 550, usando uma geometria cone-placa 40 mm, à temperatura de 25 C. Resultados e Discussão 1. Obtenção da galactomanana da planta fava d anta Rendimento O rendimento dos dois métodos foi calculado considerando-se a massa inicial de sementes que intumesceram e a massa de galactomanana obtida após cada método de extração. Para o Método 1, a massa de sementes que intumesceu foi 20 gramas e para o método 2, foi 5,9 gramas. O rendimento do Método 1 foi de 23% e do Método 2 foi de 19,1%. Outro rendimento foi calculado considerando a massa de galactomanana obtida e a massa total de sementes. Para o Método 1 o rendimento foi 15,3% e para o Método 2 foi 10,6%. Na obtenção de semente intumescida, o Método 1 teve uma maior % de sementes intumescidas, sendo este de 75%, enquanto que no Método 2, apenas 52% das sementes intumesceram. A Tabela 1 mostra um resumo dos rendimentos calculados para os métodos 1 e 2. Tabela 1. Valores de rendimento da extração de galactomanana para os métodos 1 e 2. Cálculo do rendimento Massa de galactomanana/ massa de sementes intumescidas Massa de galactomanana/ massa de sementes totais Massa de sementes intumescidas/ massa de sementes totais Rendimento (%) Método 1 Método ,1 15,3 10, O rendimento apresentado pelos dois métodos foi mais baixo que o rendimento médio da extração de galactomananas de mais de 30 espécies de sementes brasileiras, sendo este maior que 30% (massa da galactomanana/ massa de semente) [8].

5 2. Caracterização das galactomananas obtidas pelos Métodos 1 e Análise Elementar Teor de proteínas O teor de proteínas para as amostras GALM1 e GALM2 foi estimado pelo teor de nitrogênio (calculado por análise elementar). A Tabela 2 mostra estes valores. Tabela 2. Teor de nitrogênio e teor de proteínas para a GALM1 e GALM2. AMOSTRA % NITROGÊNIO % PROTEÍNAS GALM1 0,30 1,75 GALM2 0,59 3,45 O teor de proteína para a amostra GALM2 é quase duas vezes o teor da GALM1. Um maior teor de proteína para a amostra GALM2 pode ser devido ao método de obtenção desta galactomanana, que utiliza hidróxido de sódio para auxiliar na retirada da casca. Pequenos pedaços de casca ficam aderidos ao endosperma, sendo arrastados na etapa da trituração do endosperma intumescido. Essa contaminação com resíduos de casca pode estar aumentando o teor de proteínas da amostra GALM2, já que nas cascas pode haver uma maior presença de proteínas do que no endosperma. O teor de proteína da GALM2 é bem próximo ao apresentado pela goma guar comercial da Sigma (3,64%) [9], já a amostra GALM1 tem um teor de proteínas bem abaixo deste valor Composição monossacarídica A composição monossacarídca para as amostras GALM1 e GALM2 está mostrada na Tabela 3. Tabela 3. Composisção monossacarídica para a GALM1 e GALM2. Amostra %manose %galactose %arabinose %glicose Man/Gal GALM1 64,18 34,72-1,1 1,84 GALM2 64,54 32,99 1,54 0,93 1,95 A GALM2 contém um teor total de açúcares que não galactose e manose, de 2,47%, demonstrando a contaminação da amostra com outros monossacarídeos, sendo estes glicose e arabinose. Já a GALM1 apresenta apenas 1,10% de glicose em sua composição. Goma guar

6 comrecial da Sigma também apresenta estes dois açúcares contaminantes, sendo que a presença deles nesta goma é provavelmente devido à contaminantes oriundos da casca da semente [9] Espectroscopia de absorção na região do infravermelho Para a análise estrutural das duas galactomananas obteve-se o espectro na região do infravermelho (Figura 1). GALM1 Absorbância GALM N o de onda (cm -1 ) Figura 1 - Espectro na região do infravermelho das amostras GALM1 e GALM2 em pastilha de KBr. Os espectros mostrados na Figura 1 são semelhantes e mostram a semelhança estrutural entre as duas galactomananas. As atribuições das bandas para cada uma das amostras e os respectivos grupamentos estão resumidas na Tabela 3. Tabela 3-Atribuições das principais bandas de absorção características das galactomananas GALM1 e GALM2. FREQÜÊNCIAS (cm -1 ) GALM1 GALM2 ATRIBUIÇÕES ν(oh) de H 2 O adsorvida e de álcool ν(ch 2 ) δ(oh) de H 2 O adsorvida δ(ch 2 ) δ(c OH) ν(c O + C C) δ(ch) ν(c O) + δ(c OH) Modo simétrico do anel de monossacarídeo δ(ch)

7 Os espectros de infravermelho das duas amostras mostram grupamentos característicos de polissacarídeo, como também a semelhança estrutural das duas amostras. Uma pequena diferença na intensidade das bandas na região 1650 a 1680 cm -1 pode ser a possível presença de uma pequena quantidade de ácido urônico (na forma de carboxilato), que pode ser diferente para as duas galactomananas Estimativa da distribuição de massa molar por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) A distribuição de massa molar obtido pelo GPC das galactomananas GALM1 e GALM2 está mostrada na Figura 2. GALM1 GALM2 Resposta do detector (Indíce de refração) 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Tempo de retenção (min) Figura 2 - GPC das amostras GALM1 e GALM2. A galactomanana GALM1 apresenta uma distribuição de massa molar mais heterogênea que a mostrada pela galactomanana GALM2, que mostra uma distribuição unimodal. A amostra GALM1 mostra um pico mais acentuado com volume de eluição de 6,3 ml e um outro, menos acentuado com volume de eluição de 6,62 ml. Para a determinação da massa molar de pico das duas amostras, foi feito uma curva padrão utilizando-se pululanas de massas molares conhecidas e monodispersas, relacionando com a resposta do volume de eluição de pico com a massa molar destas. O gráfico da curva padrão originou a equação da reta que relaciona a massa molar de pico em logarítmo com o volume de eluição, sendo esta equação: log M pk = 12,65 0,96 V e. Para a amostra GALM1, a massa molar do pico principal é 4,08 x 10 6 g/mol, para o ombro a massa molar é de 1,97 x 10 6 g/mol. Estes valores de massa molar de pico estão na mesma ordem de grandeza que a massa molar da goma guar comercial da Sigma (4,5 x 10 6 g/mol) [9].

8 A GALM2 tem um único valor de massa molar de pico que foi de 8,9 x 10 5 g/mol. A utilização de hidróxido de sódio 5% para descascar a semente no Método 2, deve ter causado a hidrólise do polissacarídeo, reduzindo assim a massa molar deste Reologia de fluxo O estudo foi realizado variando-se a taxa de cisalhamento e avaliando-se a variação da viscosidade (Figura 3). Viscosidade (mpa.s) Taxa de Cisalhamento (s -1 ) GALM2 GALM1 Figura 3 - Estudo reológico das soluções de GALM1 e GALM2 na concentração de 1% em água a 25 C. A solução de GALM1 apresenta um comportamento psedouplástico. Já a solução de GALM2, apresentou comportamento Newtoniano, tendo sua viscosidade constante durante todo o experimento. A viscosidade da solução de GALM1 é bem maior que a da solução GALM2. Por exemplo, para uma taxa de cisalhamento de 580 s -1, a viscosidade da solução de GALM1 é 13 vezes maior do que a viscosidade da solução de GALM2. A menor viscosidade apresenta pela solução de GALM2, pode ser explicada pela sua menor massa molar Ressonância Magnética Nuclear de 1 H da GALM1 O espectro de RMN de 1 H para a galactomanana extraída pelo Método 1 (GALM1) em D 2 O está mostrado na Figura 4.

9 Figura 4 - Espectro de RMN de 1 H da galactomana GALM1 em D 2O. O espectro da galactomanana de fava d anta mostra uma semelhança ao espectro da galactomanana goma guar [9]. Os dois sinais entre 4,6 e 5,2 ppm devem-se aos hidrogênios dos carbonos anoméricos dos dois resíduos de monossacarídeo que constituem a galactomanana. O sinal em 4,74 ppm é atribuído ao H1 da manose e o sinal em 5,01 ppm ao H1 da galactose. A razão manose:galactose pode ser obtida diretamente da área relativa destes dois sinais, sendo de 1,58:1,00 para a GALM1. Os sinais em 3,54 ppm são atribuídos ao H5 da manose livre; 3,75 ppm ao H6 da galactose; 4,00 ppm ao H2 da galactose e 4,11 ppm de H2 da manose. Por todos os resultados apresentados, observa-se que a galactomanana obtida pelo Método 1 tem maior massa molar, indicando que este método traz menor degradação ao polissacarídeo obtido. A GALM1 tem um menor teor de proteínas (quase metade do valor de proteína para GALM2) e de monossacarídeos contaminates. Suas soluções são consideravelmente mais viscosas que as soluções da GALM2, sendo que as duas são estruturalmente semelhantes. Em termos de rendimento, na obtenção da galactomanana, o método 1 apresentou um desempenho melhor do que o método 2. No intumescimento das sementes também, o desempenho do método 1 é melhor que o método 2. Conclusões O método mais adequado para a obtenção da galactomana da semente de fava d anta é o método 1, que utiliza água para o intumescimento do endosperma, já que este apresenta maior

10 rendimento e a galactomanana obtida (GALM1) têm mais alta massa molar, mais alta viscosidade, menor teor de proteína e menor teor de açúcares contaminates. Agradecimentos Os autores do trabalho agradecem ao CNPq, à REDE NANOGLICOBIOTEC/CNPq e ao CENAUREM pela análise de ressonância magnética nuclear. Referências Bibliográficas 1. G. Meer; W.A. Meer; J. Tinker, Food Technol., 1975, 29, Y. Cheng; K. Brown; R. Prud homme, Biomacromolecules, 2002, 3, H. Neukom, Lebensm. Wiss. Technol., 1989, 22, J. L. Slavin; N. A. Greenberg, Nutrition, 2003, 19, G. Stanogias; G. R. Pearce, Br. J. Nutr. 1985, 53, SBRT - SISTEMA BRASILEIRO DE RESPOSTA TÉCNICAS; Resposta Técnica. Disponível em: < sbrt.ibict.br/upload/sbrt2065.pdf > Acesso em: 28 nov ABIQUIF - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA FARMOQUÍMICA; Exportações Disponível em: < > Acesso em: 31 de sembro de C. W. Vendruscolo, Dissertação de mestrado, Universidade do Vale do Itajaí, P. L. R. Cunha, Tese de Doutorado, Universidade Federal do Ceará, 2006.