UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS TESE DE DOUTORADO CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE LENTIVÍRUS DE PEQUENOS RUMINANTES ISOLADOS NO BRASIL Doutoranda: Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa Orientadora: Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira FORTALEZA CE 2011

2 2 ARYANA LUSHESE VASCONCELOS LIMA FEITOSA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE LENTIVÍRUS DE PEQUENOS RUMINANTES ISOLADOS NO BRASIL Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária da Faculdade de Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira FORTALEZA CEARÁ 2011

3 3 F311c Feitosa, Aryana Lushese Vasconcelos Lima Caracterização molecular de lentivírus de pequenos ruminantes isolados no Brasil / Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (Doutorado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Profª. Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira. Co-orientação: Prof. Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro. 1. Lentivírus. 2. Filogenia. 3. gag. 4. pol. 5. CAEV. 6. MVV.. I. Título. CDD: ARYANA LUSHESE VASCONCELOS LIMA FEITOSA

4 4 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE LENTIVÍRUS DE PEQUENOS RUMINANTES ISOLADOS NO BRASIL Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Aprovada em: 05/12/2011 BANCA EXAMINADORA

5 5 LINHA DE PESQUISA Reprodução e Sanidade de pequenos ruminantes LOCAL DE EXECUÇÃO 1. Laboratório de Virologia (LABOVIR) do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Faculdade de Veterinária (FAVET) Universidade Estadual do Ceará (UECE); 2. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa Caprinos e Ovinos Sobral-CE 3. Núcleo de Biotecnologia de Sobral NUBIS em parceria com Universidade Estadual Vale do Acaraú (UVA); Universidade Federal do Ceará Faculdade de Medicina (UFC) e Embrapa Caprinos e Ovinos. 4. Laboratório Aplicado à Biologia Molecular e Sorologia - LABMAS Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ VPS Universidade de São Paulo USP. EQUIPE EXECUTORA 1. Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira Orientadora PPGCV/FAVET/UECE, Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq; 2. Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro Coorientador, Pesquisador Embrapa CNPC; 3. Dra. Alice Andrioli Colaboradora; Pesquisadora Embrapa CNPC; 4. MSc. Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa Doutoranda PPGCV/UECE; 5. Dra. Lúcia Sider Colaboradora; Pesquisadora Embrapa CNPC; 6. Prof. Rodrigo Maranguape S. da Cunha Pesquisador e Coordenador do NUBIS; 7. Prof. Dr. João Paulo de Matos Pesquisador da Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN; 8. Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão FMVZ-VPS-USP;

6 6 9. Dalva Alana Aragão de Azevedo - Bolsistas IC/Embrapa (Curso de Ciências Biológicas - UEVA) 10. Bolsistas IC/CNPq (Curso de Medicina Veterinária FAVET/UECE)

7 7 Aos meus pais, Aos meus irmãos, Ao meu noivo Leonardo E. Marinho, Dedico.

8 8 Nada em biologia faz sentido a não ser à luz da evolução. Theodosius Dobzhansky ( )

9 9 AGRADECIMENTOS À UECE e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias que propiciou a realização deste projeto. À Embrapa e ao Centro Nacional de Pesquisa em Caprinos que disponibilizou as condições técnicas e pessoal para a realização deste trabalho. Ao Núcleo de Biotecnologia de Sobral, NUBIS-UEVA, que disponibilizou infraestrutura, reagentes, equipamentos e pessoal. Ao Laboratório Aplicado à Biologia Molecular e Sorologia - LABMAS Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ VPS Universidade de São Paulo USP, que muito gentilmente disponibilizou infraestrutura, reagentes, equipamentos e pessoal. À FUNCAP e ao Banco do Nordeste pelo auxílio financeiro que possibilitou a realização deste trabalho.

10 10 AGRADECIMENTOS A Deus pela força nos momentos difíceis. Aos meus pais Jauneval e Irlene pelo amor, incentivo e exemplo de luta. À Profa. Maria Fátima Teixeira pela orientação, confiança e exemplo profissional. Ao Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro por ter me iniciado na pesquisa e pelos ensinamentos e à Dra. Alice Andrioli que juntos me propiciaram incalculável apoio neste trabalho. Ao Professor Rodrigo Maranguape NUBIS-UEVA, que disponibilizou infraestrutura, reagentes e equipamentos, além de transmitir todos os seus conhecimentos de biologia molecular. Ao Dr. João Paulo Mattos, por me ajudar com as sequências do capítulo III. Ao Professor Paulo Eduardo Brandão LABMAS-USP, que me acolheu de forma tão generosa, disponibilizando infraestrutura, livre acesso a reagentes e equipamentos, pela contribuição imensurável à realização deste trabalho. Ao Prof. Fábio Gregori, por sua disponibilidade em ajudar, tirando dúvidas, dando sugestões, por auxiliar na edição das sequências do capítulo IV, meu muito obrigada! Aos colegas do LABOVIR: Tânia (agora orgulhosamente presente na banca como Pesquisadora da Embrapa). Além Neilson, Valeska, Edmara, Dávila, Esmaile, Cinthia, Gabrielle, Igor, Alfredo, Rosivaldo Júnior, Ronaldo, Carlos, Luís Antônio, pelo convívio e cooperação na realização deste trabalho. Aos colegas de laboratório da Embrapa: Dra. Lúcia Sider, por me disponibilizar reagentes; Dalva Azevedo, sua ajuda foi essencial no cultivo, obrigada por me acompanhar sempre que precisei. Samilly, Kelma, Osmarilda e Ricardo, pelo auxílio nas horas precisas.

11 11 Às colegas do LABMAS: Haila, Karen, Carol, Cinthia Baldin, Cíntia Favero, Camila, Sueli, Giselle, Katarina, obrigada pelas sugestões, pelo convívio, pelas horas de descontração. Em especial à Dra. Alessandra Marnie, pela ajuda, sugestões e dicas valiosas e à Sheila de Oliveira pelos sequenciamentos e pelas sugestões. Aos meus irmãos por acreditarem em mim, pelo carinho. Ao meu noivo Leonardo Ellery Marinho pelo amor, apoio e exemplo. Aos meus sogros que me acolheram em Fortaleza, Helenira Ellery e João Batista Marinho; à Francisca por cuidar de mim. Aos meus amigos de Sobral, Isana Mara, Juracy e Bartolomeu e Daniele Val, por me acolherem e pela estimável amizade. A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho, os meus mais sinceros agradecimentos!

12 12 RESUMO Os Lentivírus de Pequenos Ruminantes incluem os Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e o Vírus Maedi-Visna (MVV), estes têm sido considerados geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados como patógenos de caprinos e ovinos, respectivamente. Além disso, foi demonstrado que estes vírus estão constantes e facilmente transgredindo a barreira entre caprinos e ovinos, com CAEV infectando ovinos e MVV infectando caprinos. Assim, como todos os lentivírus, o genoma do CAEV tem uma alta taxa de mutação e o seu grau de heterogeneidade pode estar relacionado com a baixa fidelidade da transcriptase reversa, que carece da atividade de leitura da enzima exonuclease (proof reading). A análise genética de Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPRs) pode ajudar a compreender a genética, proteínas e antigenicidade destes vírus; sua patogênese, epidemiologia, relações filogenéticas e, assim, a sua inclusão nos subgrupos de LVPRs recentemente criados. Também pode ser relevante para o desenvolvimento de testes de diagnósticos específicos às estirpes locais. Neste sentido, os principais objetivos deste trabalho consistem em isolar cepas virais circulantes e analisar a filogenia por meio de sequências gag e pol; bem como, implementar uma biblioteca genômica de LVPRs isolados em alguns estados brasileiros. Para isso, inicialmente, amostras sanguíneas de caprinos e ovinos foram analisados utilizando a técnica de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA), confirmados por Western Blotting com consequente isolamento dos vírus em Mem brana Sinovial Caprina (MSC) a partir de amostras positivas. Em seguida, foi realizada Reação em Cadeia da Polimerase (Nested-PCR) para confirmação da presença de vírus, assim como para a amplificação e sequenciamento das regiões de interesse. Também foram realizadas comparações através de alinhamentos entre as regiões gag e pol das cepas isoladas, além da montagem da biblioteca genômica de LVPRs isolados. Foram isoladas cepas virais circulantes de animais naturalmente infectados nos estados do Rio Grande do Norte, Ceará, Piauí, Bahia e Minas Gerais. A cepa isolada, denominada BrRN-CNPC.G1 foi considerada o primeiro isolamento do CAEV no Estado do Rio Grande do Norte. Todas as cepas isoladas mostraram-se ser fenotipicamente líticas, do tipo rápido/alto. Foram amplificadas e sequenciadas cepas virais isoladas do Ceará e Minas Gerais e Rio Grande do Norte, tanto para o gene gag quanto para o gene pol. Pela genealogia proposta com base nas sequências nucleotídicas dos genes gag e pol, a sua

13 13 topologia mostrou-se compatível com os genótipos do subtipo B de CAEV. O alinhamento das sequências de aminoácidos da região gag indicaram divergências entre as linhagens deste estudo com a cepa padrão CAEV-Cork. Essa divergência de aminoácidos foi ainda mais acentuada quando comparas sequências de aminoácidos do gene pol.. Palavras-chave: Lentivírus, Filogenia, gag, pol, CAEV, MVV.

14 14 ABSTRACT CAEV and MVV have been considered genetically distinct but antigenically related as pathogens of goats and sheep, respectively. Moreover, it was demonstrated that these viruses are constantly and easily breaking the barrier between sheep and goats, sheep being infected with CAEV and MVV infecting goats. Like all lentiviruses, the genome of CAEV has a high mutation rate and degree of heterogeneity that may be related to the low fidelity of reverse transcriptase, which lacks proof reading activity of the exonuclease subunit. Genetic analysis of Small Ruminants Lentiviruses (SRLVs) may help to understand the genetics, the proteins and the antigenicity of these viruses, their pathogenesis, epidemiology, phylogenetic relationships and thus their inclusion in the newly created subgroups of SRLVs. It may also be relevant to the development of diagnostic tests specific to the local strains. In this sense, the aim of this work was to isolate circulating viral strains and to study the phylogeny with gag and pol sequences, as well as to implement a genomic library of SRLVs isolated in some Brazilian states. Initially, goats and sheep were screened using the AGID technique, confirmed by Western blotting with subsequent isolation of virus in goat synovial membrane (GSM) from positive samples. Nested-PCR was performed to confirm the presence of the virus and for amplification of regions of interest, followed by sequencing of individual samples. Comparisons were made through alignments of the gag and pol regions of the strains, besides assembling the genomic library of isolated SRLVs. The results were the isolation of circulating virus strains of naturally infected animals at Rio Grande do Norte, Ceará, Piauí, Bahia and Minas Gerais states. The strain isolate, called BrRN- CNPC.G1 were considered the first isolation of small ruminant lentiviruses from naturally infected goat in flock of Rio Grande do Norte, Brazil. The strains demonstrated phenotypically litic, type rapid/high. In the present work, virus strains isolated from Ceará, Minas Gerais and Rio Grande do Norte were amplified and sequenced for gag and pol genes. The genealogy proposed for gag and pol gene was compatible with subtypes B from CAEV. The alignment of amino acid sequences from gag gene was divergent between the strains this study and the standart strain CAEV- Cork. The amino acids were more divergent in sequences of the pol gene. Key-words: Lentiviruses, Phylogeny, gag, pol, CAEV, MVV

15 15 LISTA DE FIGURAS Revisão de Literatura Figura 1. Mapa do genoma do lentivírus. Figura 2. Um esboço do ciclo infeccioso de retrovírus. Painel A: passos da primeira fase do ciclo de replicação. Fixação do vírus ao se ligar aos receptores de membrana presentes nas células hospedeiras suscetíveis ocorre através das proteínas virais Env. Esta interação leva a alterações conformacionais nas proteínas Env que facilitam a fusão das membranas celular e viral, entregando o capsídeo viral para o citoplasma. Painel B: A transcrição reversa ocorre no citoplasma e produz uma molécula de DNA de fita dupla que se integra no genoma do hospedeiro, gerando um provírus. Últimos estágios do ciclo de vida incluem a expressão do RNA viral a partir do provírus. Alguns desses RNAs são emendados e exportados para o citoplasma juntamente com RNAs unspliced. O RNA unspliced serve tanto como RNA genômico como para a síntese das poliproteínas Gag e Gag-Pol. Formas unidas são usadas para fazer proteínas de Env e complexo de proteínas reguladoras do retrovírus. Painel C: Montagem das proteínas virais e encapsidação dos RNAs genômicos são representados, levando à formação da progênie viral. Adaptada do Livro Viral Genome Replication (2009). Figura 3. DNA províral resultante da retrotranscrição.

16 16 Capítulo II Figura 1. Isolamento a partir de cocultivo de monócitos/macrófagos em MSC apresentando efeito citopático característico do CAEV com presença de células gigantes multinucleadas. Capítulo III Figura 1. In the phylogenetic tree a group identified by the prototype VISNA was clearly distinguished from the CAEVs with a high bootstrap value of 100. Figura 2. Alignment of nucleotide sequences from the gag region of SRLV strains. Asterisks indicate identity among the strains. Figura 3. Alignment of deduced amino acid sequences from the capsid protein of SRLV strains. Asterisks indicate identity between the strains. Capítulo IV Figura 1. Eletroferograma mostrando a sobreposição de bases nas cepas 229CE e Pan12CE para o gene gag. Figura 2. Alinhamento do fragmento parcial de 620 nucleotídeos do gene codificador da proteína p28 do capsídeo gerados no presente estudo comparadas com sequências padrões depositadas no Genbank. Figura 3. Alinhamento do fragmento parcial de 472 nucleotídeos do gene gerados no presente estudo comparadas com sequências padrões depositadas no Genbank.

17 17 Figura 4. Árvore filogenética diferenciando os grupos de CAEV e MVV com alto valor de bootstrap. Figura 5. Alinhamento do fragmento parcial de 472 nucleotídeos do gene pol gerados no presente estudo comparadas com sequências padrões depositadas no Genbank. Figura 6. Alinhamento das sequências de aminoácidos do gene pol correspondente a uma região intergência de dutpase e integrase. Figura 7. Árvore filogenética do gene pol diferenciando os grupos de CAEV e MVV com alto valor de bootstrap.

18 18 LISTA DE TABELAS Capítulo II Tabela 1 - Sequências de primers utilizados nas reações de Nested-PCR e seus respectivos tamanhos de fragmentos amplificados. Tabela 2. Correlação: dia do experimento, coleta de sobrenadante e resultado de Nested- PCR. Capítulo IV Tabela 1 - Sequências de primers utilizados nas reações de PCR e seus respectivos tamanhos de fragmentos amplificados. Tabela 2 - Sequências e nucleotídeos analisados neste estudo. Tabela 3 Relação da origem das amostras e tamanho do fragmento dos respectivos genes sequenciados. Tabela 4. Matriz de identidade com os valores de similaridade nucleotídica do fragmento parcial do gene gag comparadas com as demais cepas depositadas do Genbank. Tabela 5. Matriz de identidade com os valores de similaridade nucleotídica do fragmento parcial do gene pol comparadas com as demais cepas depositadas do Genbank.

19 19 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % - Porcentagem 3'OH hidroxila na porção 3 do DNA A25 garrafa de cultivo celular com capacidade de 25 cm 3 AGID sigla em inglês para Imunodifusão em gel de agarose AIE Anemia infecciosa equina AP-1 - Ativador de proteína-1 AP2 Ativador de proteína-1 BDV Borna Disease Virus BIV Vírus da imunodeficiência bovina bp sigla do inglês para pares de bases BR/CNPC BR, Brasil; CNPC, Centro Nacional de Pesquisa em Caprinos BR/MG Cepa brasileira de LVPRs isolada em Minas Gerais G - goat BrRN-CNPC.G1 BR, Brasil; RN, Rio Grande do Norte; CNPC, Centro Nacional de Pesquisa em Caprinos CA Proteína do Capsídeo CAE Artrite Encefalite Caprina CAEV Vírus da Artrite Encefalite Caprina CAEV-Cork Cepa padrão de CAEV CE Ceará c-fos Fator celular presente nos macrófagos que participa da ativação viral c-jun Fator celular presente nos macrófagos que participa da ativação viral celisa ELISA competitivo cm 2 centímetro quadrado CNPC Centro Nacional de Pesquisa em Caprinos/ Embrapa Caprinos e Ovinos CO Monóxido de Carbono CO 2 Dióxido de Carbono CPE sigla do inglês para Efeito Citopático Característico DNA Ácido desoxirribonucléico dntps Desoxinucleotídeo trifosfato dutpase - Enzima codificada pelo gene pol

20 20 e - ativador de expressão ECP Efeito citopático EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EIAV sigla do inglês para anemia infecciosa equina ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay env - Gene que codifica as proteínas do envelope viral ENV - proteínas do envelope viral EUA Estados Unidos da América EV-1 cepa britânica do vírus MV FAVET Faculdade de Veterinária da UECE FBS sigla do inglês para soro fetal bovino Fig Figura FIV Vírus da Imunodeficiência Felina FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP Fos - produto de c-fos FUNCAP Fundação Cearense de Apoio à Pesquisa g Unidade da força centrífuga relativa gag - Gene viral que codifica as proteínas interna dos vírus GAG proteínas interna dos vírus GenBank Banco de dados genéticos gp Glicoproteína GSM Membrana Sinovial Caprina HCl Ácido Clorídrico HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IDGA Imunodifusão em gel de Agar IgG Imunoglobulina G K1514 cepa Islandesa do vírus MV kb kilobases KCl Cloreto de Potássio kda Kilodaltons KV1772 cepa Islandesa do vírus MV LABMAS Laboratório Aplicado à Biologia Molecular e Sorologia - USP LABOVIR - Laboratório de Virologia - UECE LSP - Leucócitos do sangue periférico

21 21 LTR Seqüências longas repetidas LVPRs Lentivírus de pequenos ruminantes M molar MA Proteína da Matriz MEM Meio Essencial Mínimo mg miligramas Mg 2+ Magnésio MHC I ou II Complexo Principal de Histocompatibilidade min minutos ml - Mililitros mm mili-molar MSC Membrana sinovial caprina MV Maedi-visna MVV Vírus Maedi-Visna NC Proteína do nucleocapsídeo ng nanograma NJ - neighbor joining nm nanômetro nt nucleotídeo NUBIS Núcleo de Biotecnologia de Sobral ºC Graus Celsius OIE Organização Internacional de Epizootias ORFs Pequena região do genoma viral P1OLV cepa portuguesa do vírus MV p28 protein do capsídeo pb Pares de bases PBL sigla do inglês para Leucócitos do sangue periférico PBS Solução de tampão de fosfato PCR Reação em cadeia da Polimerase ph potencial hidrogeniônico pmol picomol pol - Gene que codifica as enzimas virais POL proteína codificada a partir do gene pol PPGCV Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias

22 22 PPO Pneumonia Progressiva Ovina RNA Ácido ribonucléico RNAm Ácido Rribonucléico mensageiro rpm rotação por minuto SA-OMVV cepa Sul-Africana do vírus MV SIV Vírus da imunodeficiência símia SMF - sistema monocítico fagocitário SNC Sistema Nervoso Central SRLVs sigla em inglês para Lentivírus de pequenos ruminantes SU Glicoproteína de superfície Taq DNA Taq Polimerase TBE - Tris-Borato; 1 mm EDTA TE - Tris 10 mm/ EDTA 1 mm ph 8,0 TM proteína transmembranica Tris Trisma U Unidade U3 upstrem 3 U5 upstrem 5 UECE Universidade Estadual do Ceará UFC Universidade Federal do Ceará USA United States of America USP Universidade de São Paulo UVA Universidade Estadual Vale do Acarú vif - Gene de regulação viral VISNA Doença causada pelo vírus Maedi-visna vpr gene envolvido na regulação da síntese e processamento do RNA viral e outras funções na replicação WB - Western Blotting ZP Zona pelúcida L microlitro M micromol - sinal de encapsidação

23 23 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Histórico Taxonomia dos Retrovírus Agente Etiológico e Classificação Viral Estrutura e Genoma dos vírus Replicação e Transcrição Heterogeneidade Genética Tropismo celular Epidemiologia e Transmissão Sinais Clínicos Diagnóstico clínico Diagnóstico laboratorial Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto Isolamento viral Reação em cadeia de polimerase (PCR) Imunodifusão em gel de agarose (IDGA) Western blotting ou imunoblotting Prevenção e controle JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS Objetivos Gerais Objetivos Específicos CAPÍTULO I... 55

24 24 7 CAPÍTULO II CAPÍTULO III CAPÍTULO IV CONCLUSÕES GERAIS PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS

25 25 INTRODUÇÃO Os Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPRs) estão amplamente distribuídos entre caprinos e ovinos no mundo, causando grandes perdas econômicas. Diferentes formas clínicas da doença têm sido descritas em pequenos ruminantes infectados com LVPRs no Brasil, como artrite, pneumonia, mastite infectando caprinos e também recentemente a forma nervosa da doença em ovinos (BENAVIDES et al., 2006). O Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e o Vírus Maedi-Visna (MVV) têm sido considerados como patógenos geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados entre si. Estes vírus estão constantes e facilmente transpondo a barreira entre espécies de caprinos e ovinos (VALAS et al., 2000; KARR et al., 1996; SHAH et al., 2004b). Em meados dos anos 90, as primeiras sequências genômicas tornaram-se disponíveis. LVPRs de regiões geográficas distintas foram agrupados de acordo com as espécies que foram isoladas. Dois grupos distintos, mas taxonomicamente relacionados mostraram-se evidentes, um grupo evoluindo a partir de sequências de ovinos e os outros evoluindo a partir sequências caprinas. A partir desse período, como mais sequências de LVPRs foram caracterizadas, uma distribuição mais complexa tornou-se evidentes sobre reconstruções filogenéticas, sugerindo que não os LVPRs não podiam mais ser agrupados exclusivamente com base nas espécies que foram obtidas. Numerosos estudos filogenéticos subsequentes trouxeram evidências adicionais desde fato. Essa descoberta modificou a percepção sobre a relação entre os LVPRs e seus hospedeiros e levou ao conceito de transmissão cruzada entre espécies. Atualmente, MVV e CAEV não são mais vistos como duas espécies virais infectantes distintas exclusivamente de ovinos e caprinos, respectivamente, e sim como quasispecies virais que podem ser transmitidos entre pequenos ruminantes sob condições favoráveis (LʼHOMME, et al., 2011). Dados recentes baseados em estudos filogenéticos ajudaram a classificar os LVPRs de acordo com seus hospedeiros (CASTRO et al., 1999; LEROUX et al., 1997; CHEBLOUNE et al., 1996). Estes estão classificados dentro de cinco grupos relativamente equidistantes (SHAH et al., 2004a). A alta heterogeneidade das sequências de nucleotídeos e aminoácidos em lentivírus pode determinar a sua antigenicidade,

26 26 virulência e crescimento e pode ainda afetar sua persistência e o seu mecanismo de evasão. A alta heterogeneidade das sequências de nucleotídeos e aminoácidos em lentivírus pode determinar a sua antigenicidade, virulência e crescimento e pode ainda afetar sua persistência e o seu mecanismo de evasão. A caracterização molecular desses LVPRs pode ajudar a entender suas relações genéticas, protéicas e antigênicas, sua patogênese, epidemiologia, relações filogenéticas e sua inclusão nos grupos recentemente estabelecidos (SHAH et al., 2004a). Isto também pode ser relevante para o desenvolvimento de testes de diagnósticos mais sensíveis e específicos. A análise filogenética de sequências de CAEV e MVV e consequentemente a aquisição do conhecimento sobre a heterogeneidade genética dos LVPRs é de imensa importância para a análise epidemiológica de infecções por lentivírus de pequenos ruminantes e também para estudar as diferenças de virulência entre linhagens de LVPRs circulantes.

27 27 REVISÃO DE LITERATURA Histórico A síndrome Artrite-encefalite caprina (CAE) foi inicialmente descrita nos Estados Unidos da América, sob a forma clínica de leucoencefalomielite em cabritos e o vírus foi isolado em 1980, por CRAWFORD e colaboradores em explants de membrana sinovial de um caprino adulto com artrite. A Maedi-Visna (MV) ou a equivalente norte-americana Pneumonia Progressiva Ovina (PPO) foi uma das primeiras doenças denominadas como infecção lenta (SIGURDSSON, 1954). Os dois nomes são de origem islandesa: Maedi, que significa dispnéia e é caracterizada por pneumonia intersticial progressiva, e Visna, que significa desorientação, caracterizada por leucoencefalomielite (DAWSON, 1980). Inicialmente, Visna/Maedi foi reconhecida como duas entidades distintas. O primeiro isolado de MVV foi feito por SIGURDSSON et al. (1960) a partir do Sistema Nervoso Central (SNC) de ovinos. Quando as primeiras amostras dos vírus foram isoladas de ovinos infectados com Visna e Maedi (SIGURDARDÓTTIR E THOMAR, 1964), foi observada similaridade entre esses vírus. Posteriormente estudos revelaram que tanto Maedi quanto Visna eram doenças causadas pelo mesmo agente, originando assim a denominação Maedi-Visna ou MVV. Os vírus foram introduzidos através da importação, de ovinos Karakul da Alemanha em 1933, para melhorar rebanhos da Islândia, mas esta raça também introduziu a adenomatose pulmonar, paratuberculose e visna. Os primeiros relatos da doença com sinais clínicos semelhantes à Maedi-Visna ocorreram na África do Sul em 1915 e, posteriormente, nos Estados Unidos em A doença foi observada, mais tarde, em outras regiões do mundo, sendo a síndrome respiratória de maior prevalência. Na Holanda esta enfermidade recebeu o nome de Zwoegerziekte (DE BÔER, 1975; HOUWERS, 1985), Na África do Sul, recebeu o nome de Jaagsiekte (VERWOERD et al., 1983) e nos Estados Unidos, de Pneunonia Progressiva Ovina (PPO) e Doença Pulmonar da Montanha (CUTLIP E LAIRD, 1976).

28 28 Taxonomia dos Retrovírus A família Retroviridae inclui a subfamília Orthoretrovirinae a qual contém o gênero Lentivirus. Deste fazem parte as nove espécies: Vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), Vírus Maedi-Visna (MVV), Vírus da Anemia Infecciosa Equina (AIE), Vírus da imunodeficiência felina (FIV), Vírus da imonodeficiência humana (HIV tipo-1), Vírus da imonodeficiência humana (HIV tipo-2), Lentivírus de Puma, Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV) e Vírus imunodeficiência bovina (BIV) (ICTV, 2011). Agente Etiológico e Classificação Viral O vírus Maedi-visna (MVV) e o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) afetam ovinos e caprinos, respectivamente, pertencem à família Retroviridae e ao gênero Lentivirus (PASICK, 1998). São vírus complexos e não oncogênicos. Os lentivírus geralmente limitam a infecção a um simples hospedeiro, levando a sérios problemas ou à morte de caprinos jovens e de ovinos; multiplicam-se também em células em repouso (não ativadas); infectam monócitos, macrófagos e/ou linfócitos, causando infecção persistente e multissistêmica (AIEV, MVV e CAEV), associada à síndrome de imunodeficiência (SIV, HIV e FIV); com altas taxas de mutação, e consequente diversidade genotípica, fenotípica e antigênica (CLEMENTS E PAYNE, 1994; GONDA, 1994; REISCHAK, 2000; PINHEIRO, 2001). Os LVPRs podem ser classificados em cinco grupos filogenéticos: O genótipo A, que compreende o grupo Maedi-visna (SHAH et al., 2004), este grupo pode ser subdividido em nove subtipos A1-A9, onde o subtipo A1 é identificado por MVV por ser genética e geograficamente heterogêneos. Recentemente, foram encontrados dois novos subtipos do Grupo A, A8 (isolado de caprino) e A9 (isolado tanto de caprino quanto de ovino), na Itália (GREGO et al., 2007). O genótipo B, inluindo CAEV como isolados (PISONI et al., 2005), compreende apenas dois subtipos distintos, B1 e B2, que estão associados principalmente com artrite em caprinos (PISONI et al., 2005) e ovinos (GLARIA et al., 2009; ROSATI et al., 2004), respectivamente.

29 29 O genótipo C, afeta pequenos ruminantes norueguêses (GJERSET et al., 2007). O genótipo D foi caracterizado através do gene pol em isolados suíços e espanhóis (REINA et al., 2006; SHAH et al., 2004) e o genótipo E inclui os isolados caprinos italianos (GREGO et al., 2007; REINA et al., 2009a). O último grupo foi identificado pela primeira vez em rebanhos assintomático da raça local Roccaverano, daí o nome dado à cepa. Até o momento o genótipo E compreende dois subtipos: E1, cepa Roccaverano, descrita como de baixa patogenicidade por não levar à sintomas clínicos em caprinos (REINA et al., 2011) e E2, cepa Seui. Estrutura e Genoma dos vírus MVV e CAEV, como os demais lentivírus apresentam-se como vírions envelopados, com diâmetro de 80 a 100 nm, núcleo cônico e denso, contendo duas moléculas idênticas de RNA fita simples, não complementares, unidas por pontes de hidrogênio, de polaridade positiva. Neste caso, o RNAm serve como molde para a transcriptase reversa. O genoma tem cerca de 9.3 kb, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg 2+ e proteínas do nucleocapsídeo (GONDA et al., 1986). O envelope está associado covalentemente com glicoproteínas transmembranárias (TM) e de superfície (SU). A matriz (MA) também é outra estrutura presente na partícula viral e esta está situada entre o capsídeo e o envelope (PÉPIN et al., 1998). São pleomórficos, esferóides e têm um coeficiente de sedimentação de 1,14 a 1,18 g/ml (CLEMENTS et al., 1980), apresentando uma grande quantidade de ácido N-acetilneurâminico (ácido siálico) em sua superfície (HUSO et al., 1988) (Figura 1). O genoma é constituído por genes que codificam as proteínas estruturais (gag), um precursor que é posteriormente clivado em três proteínas principais: matriz (MA), capsídeo (CA) e nucleocapsídeo (NC) (PÉPIN et al., 1998), e o gene (env), que codifica as glicoproteínas de superfície (SU) e transmembranária (TM) do envelope viral. O gene (pol) que codifica as proteínas de atividade enzimática: transcriptase reversa, protease, integrase e dutpase, além de pequenos ORFs, que codificam proteínas que regulam a expressão gênica como os genes acessórios (tat, vif), (ou Q, no HIV) e (rev), codificantes de proteínas de regulação da expressão viral (CLEMENTS E PAYNE 1994).

30 30 Estas proteínas não se encontram nos vírus e somente são traduzidas durante a replicação viral, na qual participam ativamente. Figura 1. Estrutura dos Vírus da Artrite Encefalite Caprina (Coffin, 1996). Adaptado por Rizaldo (2001). Os tamanhos das proteínas codificadas são: MA ~17kDa; CA~24 kda; NC ~7-11 kda; PR ~14 kda; RT ~66 kda; DU (em todos, exceto nos lentivírus de primatas), IN ~32 kda; SU ~120 kda; TM ~41 kda. Além dos genes estruturais gag, pro, pol, env, existem genes adicionais, dependendo do vírus (p. e., vírus da imunodeficiência humana 1, HIV-1): vif, vpr, vpu, tat, rev, nef em que os produtos estão envolvidos na regulação da síntese e processamento do RNA viral e outras funções na replicação. A LTR tem cerca de 600 nt de comprimento, dos quais 450 nt compõem a região U3, 100 nt na região R e aproximadamente 80 nt na região U5. Estes vírus estão associados com uma variedade de doenças, incluindo imunodeficiencias, desordens neurológicas, artrites entre outros (FAUQUET et al., 2005).

31 31 Os genes gag e pol são os mais conservados, enquanto o gene env é altamente heterogêneo (NARAYAN E CLEMENTS, 1989) e são típicos da família Retroviridae. Estes genes, únicos de lentivírus, apresentam um nucleotídeo ou aminoácido homólogo diferenciando as várias lentiviroses, no entanto, suas funções são preservadas (CLEMENTS E PAYNE, 1994). Replicação e Transcrição O ciclo de replicação dos retrovírus é constituído por uma série de passos que, após transferência de informação genética do RNA para as moléculas de DNA, leva ao estabelecimento de uma infecção persistente após a integração do DNA proviral nas células do hospedeiro (Figura 2). Para iniciar a infecção, os retrovírus interagem com receptores específicos na superfície das células-alvo por meio das proteínas do envelope presentes do lado de fora da membrana viral. Após a ligação inicial, as proteínas de envelope estão sujeitas à mudanças conformacionais que levam à fusão viral com as membranas celulares e posterior liberação do núcleo viral para o citoplasma. Os eventos iniciais após a penetração são, até à data, pouco compreendidos. Enquanto em alguns casos, propõe-se que o desencapsulamento do núcleo viral ocorre após a internalização, existem outras indicações sugerindo que este capsídeo pode permanecer intacto, permitindo que a transcrição reversa ocorra neste ambiente fechado. Após a penetração do capsídeo viral no citoplasma da célula-alvo, a transcrição reversa começa e segue para a geração de uma fita dupla de DNA a partir do genoma RNA de fita simples. Este passo característico tem dado o nome a esta família de vírus. A molécula de DNA deve então entrar no núcleo, a fim de integrar no genoma do hospedeiro, dando origem a uma "provírus", que será permanentemente estabelecido no genoma do hospedeiro. A fase final do ciclo de replicação, que geralmente depende do maquinário celular, ocorre após esta etapa de integração. O RNA viral é expresso a partir de seu promotor, localizado na região U3, e a regulação da transcrição é controlado por fatores virais, bem como, fatores de transcrição do hospedeiro.

32 32 Durante a fase inicial da expressão do DNA proviral, a transcrição é processada para dar origem a uma série de forma sub-genômica que serão usadas para tradução. Mais tarde o RNA genômico será empacotado em partículas nascentes virais. Figura 2 adaptada do Livro Viral Genome Replication (2009). Um esboço do ciclo infeccioso de retrovírus. Painel A: Primeiros passos da primeira fase do ciclo de replicação. Fixação do vírus ao se ligar aos receptores de membrana presentes nas células hospedeiras suscetíveis ocorre através das proteínas virais Env. Esta interação leva a alterações conformacionais nas proteínas Env que facilitam a fusão das membranas celular e viral, entregando o capsídeo viral para o citoplasma. Painel B: A transcrição reversa ocorre no citoplasma e produz uma molécula de DNA de fita dupla que se integra no genoma do hospedeiro, gerando um provírus. Últimos estágios do ciclo de vida incluem a expressão do RNA viral a partir do provírus. Alguns desses RNAs são emendados e exportados para o citoplasma juntamente com RNAs não processado. O RNA ainda não processado serve tanto como RNA genômico como para a síntese das poliproteínas Gag e Gag-Pol. Formas unidas são usadas para fazer proteínas de Env e complexo de proteínas reguladoras do retrovírus. Painel C: Montagem das proteínas virais e encapsidação dos RNAs genômicos são representados, levando à formação da progênie viral.

33 33 Uma vez que o produto dupla-fita final da transcrição reversa é gerado, o DNA pré-proviral deve ser integrado ao genoma da célula infectada, um processo mediado pela integrase retroviral. Para que o DNA pré-proviral possa ter acesso aos cromossomos celulares, certos retrovírus requerem a desintegração da membrana nuclear ou progressão do ciclo celular de suas células-alvo. No caso dos lentivírus, os complexos pré-integração podem entrar no núcleo das células em não divisão através do transporte ativo do DNA viral pela membrana nuclear intacta, provavelmente mediada por fatores celulares e virais. Ambas as extremidades das moléculas de DNA geradas após transcrição reversa são constituídas pela LTRs, que contêm as sequências reconhecidas pela integrase. A integração ocorre em duas etapas: numa primeira instância, a remoção de dois nucleotídeos a partir de extremidades 3' do DNA préproviral ocorre, enquanto na segunda etapa, os grupamento 3'OH ataca o DNA-alvo e, através de um processo de transferência de cadeia, essas são ligadas ao DNA do hospedeiro. Este processo gera uma duplicação de sequências curtas que flanqueiam o DNA proviral, cujo tamanho dependerá da distância em que o ataque foi feito pela integrase no DNA do hospedeiro. Esta distância varia de 4 a 6 nt dependendo do retrovírus. A integração no DNA da célula infectada não ocorre em sequências específicas. No entanto, as preferências para a integração em regiões ativamente transcritas foram relatadas (SCHRODER et al., 2002; WU et al., 2003). Vírus diferentes marcam preferências por diferentes sequências (MITCHELL et al., 2004). Após a integração há formação do provírus; síntese do RNA viral pela RNA polimerase II celular, utilizando o provírus como molde; transcrição do genoma em RNA-mensageiros (RNAm); síntese das proteínas virais; montagem; construção do capsídeo e brotamento do vírus (COFFIN, 1996; PERTURSON et al., 1992). O provírus, uma vez integrado, é estável, não existindo evidência de qualquer mecanismo para remoção dos provírus do DNA celular, transposição direta dele para outro sítio ou replicação independente (COFFIN, 1996). A integração do DNA proviral ao DNA celular não é essencial à replicação dos lentivírus, mas é fundamental para a persistência da infecção (HAASE, 1986). A transcrição e o genoma viral iniciam um papel crucial no ciclo de vida dos vírus, como prover o molde para a síntese de proteínas estruturais e regulatórias,

34 34 resultando na geração de novas cópias de RNA viral. O DNA do provírus resultante da retrotranscrição apresenta no centro do genoma viral, as sequências trans (GAG, ENV e POL) que codificam as proteínas estruturais e enzimas. Essas sequências são enquadradas por duas sequências cis, necessárias para sua expressão, como o enhancer (e, ativador de expressão) e ( sinal de encapsidação) (Figura 3). A repetição das sequências de transcrição forma as repetições terminais longas (LTR, na sigla em inglês), necessárias à integração do provírus ao genoma da célula (PAGÈS E PIVER, 2008). Figura 3. DNA províral resultante da retrotranscrição. (Revista American Science, 2008). A transcrição é regulada pela ligação de várias proteínas celulares à sequência de DNA. AP-1, que é um ativador de proteína, atua com um dos fatores de transcrição, sendo este um produto de c-jun, que interage com Fos (produto de c-fos) para formar um dímero. Apresentam dois domínios funcionais, um responsável pela ligação ao DNA e um para ligação à Fos, e inclui o zíper de leucina. AP2 interage com elementos virais e celulares estimulando a transcrição de genes selecionados. Vários estudos têm demonstrado que AP-1 e AP-4 ligam-se a sítios, que estão localizados na região promotora U3 da LTR, tendo um papel central na regulação e transcrição viral (BARROS et al., 2004, 2005; CAMPBELL E AVERY, 1996; GABUZDA et al., 1989; GDOVIN E CLEMENTS, 1992; HESS et al., 1986; SUTTON et al., 1997). Heterogeneidade Genética A enorme diversidade dos lentivírus é devida às altas taxas de mutação, de 0,5 a 1 genoma por ciclo de replicação, ou seja, por dia cerca de 10 bilhões de partículas

35 35 virais são produzidas in vivo, todas essas partículas têm pelo menos uma mutação em seu código genético, que quando são acumuladas, auxiliam à rápida evolução desse grupo de vírus (CASTRO, 1998) e são atribuídas ao fato de que esses vírus de RNA em geral, especialmente os lentivírus, têm altas taxas de erro provocadas pela RNA polimerase e pela falta do mecanismo de correção de bases (STEINHAUER E HOLLAND, 1987). Alguns autores relataram que estas mutações decorrem, geralmente, de erros nas polimerizações, durante o ciclo de replicação dos lentivírus com substituições de bases, deslocamento de janelas, rearranjo genético, recombinação e hipermutações (COFFIN, 1996; PRESTON E DOUGHERTY, 1996). A transcriptase reversa é a principal responsável por erros e, ao contrário das polimerases celulares, apresenta baixa fidelidade, devido à ausência da ação da enzima 3' - 5' exonuclease, necessária às correções de erros surgidos durante a polimerização. Porém algumas mutações podem ser causadas durante a replicação do DNA proviral, por erros da DNA polimerase celular, e da RNA polimerase celular II, quando da síntese de RNA a partir do DNA proviral (PRESTON E DOUGHERTY, 1996). Essa alta variabilidade genética dos lentivírus (CLEMENTS e ZINK,1996; LEROUX et al.,1997), exemplificada pela variação observada nas regiões de LTR do genoma viral, foi associada com a alta capacidade dos LVPRs serem ativados até o nível transcricional em muitos ambientes celulares diferentes, podendo favorecer a seleção de vírus que podem replicar em células e órgãos particulares, portanto afetando diretamente o tropismo celular e a patogenicidade dos vírus (CLEMENTS e PAYNE, 1994; AGNARSDOTTIR et al., 2000; ANGELOPOULOU et al., 2006a). Mundialmente são conhecidas apenas as seguintes sequências genômicas completas de LVPRs, as estirpes Islandesas em K1514 e KV1772 (ANDRÉSSON et al., 1993; SONIGO et al., 1985), CAEV Cork (SALTARELLI et al., 1990), os vírus Sul Africano em (SA-OMVV) (QUERAT et al., 1990) e Britânico (EV-1) (SARGAN et al., 1991), todos eles do tipo rápido/alto. Em 2004, FEVEREIRO et al., através de análise filogenética baseada nos alinhamentos das sequências nucleotídicas dos genes pol e env, revelaram uma nova cepa de MVV em Portugal, denominada P1OLV. Até o momento, este é o único lentivírus ovino com padrão de replicação do tipo lento/baixo cujo genoma foi totalmente sequenciado. Além das estirpes recentemente publicadas VOLTERRA e FONNI (Bertolotti et al., 2011); SEUI (Reina et al., 2010) e FESC-752 (Ramirez et al., 2011, dados não publicado). Os LVPRs podem ser classificados como

36 36 rápido/alto ou baixo/lento de acordo com sua replicação in vitro. A linhagem do tipo rápida/alta replica rapidamente, induzindo a lise celular e alcançando altos títulos, enquanto o tipo baixo/lento cresce lentamente e apresenta baixos títulos (BARROS et al., 2004; LAIRMORE et al., 1987; QUERAT et al., 1984; WOODWARD et al., 1995). LEROUX et al. (1997) sugerem que as cepas K1514, SA-OMVV e EV1 tenham uma origem comum, talvez a Alemanha. As sequências nucleotídicas desses lentivírus encontram-se registradas em bancos de dados genéticos internacionais (Genbank) (MARCHESIN et al., 1997; FEITOSA et al., 2010). Estudos subsequentes, baseados em sequências parciais dos genes gag, pol e env, mostraram que estes vírus de ovinos e caprinos estão entremeando na árvore filogenética independente do hospedeiro, sugerindo que as infecções interespécies têm ocorrido entre os animais hospedeiros (CHEBLOUNE et al., 1996; LEROUX et al., 1997; ZANONI, 1998; CASTRO et al., 1999; GREGO et al., 2002; ROLLAND et al., 2002; SHAH et al., 2004a;). O genoma completo da linhagem de CAEV-Cork dos Estados Unidos, considerado o protótipo de lentivirus caprino, foi clonado e a sequência de DNA proviral, determinada (SALTARELLI et al., 1990). Sequências nucleotídicas completas e parciais de muitos outros lentivírus têm sido recentemente determinadas a partir de isolados de caprinos e ovinos como as do Brasil, Irlanda, Estados Unidos, Suíça, Grécia, França, Espanha, Itália, Finlândia, Polônia, Noruega e recentemente no Canadá (MARCHESIN, 1997; RAVAZZOLO et al., 2001; ROLLAND et al., 2002; ABELSON E SCHOBORG, 2003; HERRMANN et al., 2004; SHAH et al., 2004a; ANGELOPOULOU et al., 2005; PISONI et al., 2005,2006; GERMAIN E VALAS E GERMAIN, 2006; REINA et al., 2006; CONTRERAS et al., 2006; LAAMANEN et al., 2007; KUZMAK et al., 2007; GJERSET et al., 2007; FEITOSA et al., 2010, L'HOMME et al., 2011). Análises filogenéticas utilizando as sequências gag/pol revelaram a presença dos subtipos de LVPRs do grupo A em diferentes países da Europa, incluindo França, Itália, Portugal, Espanha e Suíça (BARROS et al., 2004; GREGO et al., 2002; LEROUX et al., 1997; SHAH et al., 2004a; GREGO et al., 2007). Embora a classificação filogenética de LVPRs esteja correta quando algumas sequências de isolados são avaliadas para mais de um gene (ZANONI, 1998), tais como a caracterização das sequências gag e pol, nenhuma caracterização para as sequências env

37 37 está completa. Este gene codifica glicoproteínas do envelope que iniciam um papel importante no hospedeiro, na infectividade e na progressão da doença. Vários estudos demonstraram que as linhagens de lentivírus podem diferir em suas propriedades biológicas, incluindo efeito citopático e tropismo in vitro (BARROS et al., 2004; BRUETT e CLEMENTS, 2001; HÖTZEL e CHEEVERS, 2001; LAIRMORE et al., 1987; QUERAT et al., 1984). No Brasil, os primeiros estudos de caracterização molecular e isolamento de parte do gene gag foram realizados em isolados nos Estados de Minas Gerais e Rio Grande do Sul. Em Minas Gerais, cinco amostras de CAEV isoladas de animais soropositivos foram comparadas com outros lentivírus existentes no GenBank e revelaram-se únicas e distintas das demais amostras de LVPRs com maior identidade com amostras de CAEV do que com a de MVV. Entretanto, no Rio Grande do Sul, outros cinco isolados de CAEV, de animais infectados foram comparados com as sequências de seis lentivírus de pequenos ruminantes, permitindo separar as amostras em três grupos distintos (MARCHESIN, 1997). CASTRO (1998) amplificou e sequenciou parte do gene pol e o gene tat de isolados de CAEV dos estados de Minas Gerais e Pernambuco. A análise filogenética das sequências destes genes indicou que o isolado de Pernambuco foi estreitamente relacionado ao isolado islandês MVV K1514, enquanto os isolados de Minas Gerais foram mais relacionados ao CAEV. REISCHAK (2000), estudando três isolados caprinos e um isolado ovino do Rio Grande do Sul, verificou que dois destes apresentavam características líticas nos cultivos celulares secundários e de linhagem, indicando diversidade quanto ao ciclo de replicação viral in vitro destes isolados. No Ceará, foi realizado pela primeira vez um estudo filogenético de lentivírus de pequenos ruminantes. FEITOSA et al (2010) amplificou e sequenciou o gene gag a partir de PCR de quatro isolados de CAEV no Estado do Ceará. Os alinhamentos dessas sequências cearenses quando comparadas com as sequências padrões e outros isolados nacionais, já disponíveis em bancos de dados genéticos, revelaram que essas linhagens estão relacionadas com o subtipo B1 de CAEV. Porém ao comparar as sequências dos isolados do Ceará com noventa sequências do gene gag disponíveis em bancos de dados genéticos, a árvore filogenética gerada mostrou as sequências Cearenses agrupadas em um grupo distinto, demostrando uma

38 38 forte relação filogenética com as sequências dos isolados da França, Noruega e uma do Brasil, mais especificamente do Rio Grande do Sul. Recentemente GLARIA e colaboradores (2011), observaram pela primeira vez na Espanha um ovino apresentando a forma artrítica da doença. Ao estudarem a sequência completa do vírus isolado, observaram que este pertencia ao subgrupo B2 de CAEV de acordo com a nova nomenclatura, sugerindo assim, uma adaptação do vírus caprino ao novo hospedeiro ovino, adquirindo propriedades genéticas que conferem o fenótipo do tipo rápido/alto. Ao longo do tempo, estudos de epidemiologia molecular têm mostrado que CAEV e MVV estão relacionados, mas são vírus geneticamente distintos e que pertencem a dois conjuntos filogenéticos principais (ROLLAND et al., 2002; SHAH et al., 2004a; ZANONI, 1998). Os pequenos ruminantes são reservatórios de lentivírus com uma linha filogenética própria e os dendogramas inferidos a partir das sequências dos genes gag, pol e env de vários lentivírus ovinos e caprinos, sugerem que o CAEV teve origem no MVV (VALAS et al., 1997). À medida que um maior número de sequências de lentivírus for incorporado ao Genbank, será possível avaliar se os perfis observados estão mais relacionados com CAEV ou com MVV. Trabalhos baseados em estudos filogenéticos têm ajudado na classificação de lentivirus caprino e ovino de acordo com seus hospedeiros. Foi demonstrado que estes vírus estão constantes e facilmente transgredindo a barreira entre caprinos e ovinos (SHAH et al., 2004b; BANKS et al., 1983), devendo isto ser levado em consideração nos estudos epidemiológicos e nos planos de erradicação das infecções por LVPRs. Dados de análise filogenética mostraram também que sequências de lentivírus caprino/ovino estão frequentemente dispersos dentro de árvores filogenéticas, indicando assim várias transmissões entre caprinos e ovinos e vice-versa, e que o gene env pode ser mais informativo que as regiões gag e pol, pois este último gene, por ser uma região do genoma viral bastante conservado, retém menos sinais filogenéticos (FEITOSA et al., 2010; ROLLAND et al., 2002).

39 39 Tropismo celular Os lentivírus de pequenos ruminantes têm tropismo por as células da linhagem monocito-fagocitária. Nestas células, a expressão viral está estreitamente associada à diferenciação e maturação dos monócitos em macrófagos (GENDELMAN et al., 1986; NARAYAN et al., 1983). Os lentivírus infectam células da linhagem dos macrófagos, incluindo microglia, astrócitos, e oligodendrócitos, assim como os tipos I e II de pneumócitos, fibroblastos, fibroblastos imortalizados e células epideliais e endoletiais (TEIXEIRA et al., 1997; SANNA et al., 1999; CARROZZA et al., 2003; CHI et al., 2000). Células epiteliais do leite de caprinos têm demonstrado susceptibilidade à infecção com CAEV tanto in vitro quanto in vivo (MSELLI-LAKHAL et al., 1999). Estes vírus podem ser detectados por hibridização in situ e/ou por métodos de imunohistoquímica em drenagem de nódulos linfáticos, porém a frequência de células infectadas é baixa, sugerindo que apenas a minoria das células são infectadas (BLACKLAWS et al., 1995; CARROZZA et al., 2003; GROSSI et al., 2005; LECHNER et al., 1997; STORSET et al., 1997). In vivo, infectam principalmente células do sistema monocitos-fagocitário, sendo os macrófagos a grande maioria das células infectadas (NARAYAN E CLEMENTS, 1989; LUJÁN et al., 1994; BRODIE et al., 1995). A infecção das células depende da presença de receptores para os vírus. Poucos monócitos têm estes receptores, entretanto estes aumentam após sua maturação (GENDELMAN et al., 1986). Linfócitos também são infectados, entretanto sem multiplicação viral (ZINK E JOHNSON, 1994). Ainda foi detectado o RNA viral em células endoteliais, epiteliais, fibroblásticas, várias células do sistema nervoso (plexo coróide, células microgliais, astrócitos, oligodentrócitos e neurônios) e da glândula mamária (ZINK et al., 1990; BRODIE et al., 1995; SANNA et al., 1999, MSELLI-LAKHAL et al., 1999; LERONDELLE et al., 1999). Os vírus também já foram detectados na medula óssea (fibrócitos, células endotelias e adipócitos) de caprinos positivos para CAEV através de imunohistoquimica, porém células hematopoéticas foram negativas (GROSSI et al., 2005).

40 40 Nos tecidos-alvos, tais como sinóvias, interstício pulmonar, plexo coróide e úbere, a ativação da replicação viral, juntamente com a maturação dos macrófagos, induzem à formação das lesões. Segundo ZINK et al. (1990), outras células podem também servir como áreas de replicação viral, como as células da membrana sinovial, oligodentrócitos (PERK, 1990), células epiteliais intestinais, células tubulares renais, e células glandulares da paratireóide, adrenais e da tireóide. Contudo, é o tropismo do vírus por células do sistema imune, particularmente monócitos e macrófagos, o principal fator responsável pela habilidade dos lentivírus em causar infecções crônicas, que persistem por toda a vida do animal. A forma nervosa da doença em ovinos jovens doentes sugere a existência de linhagens de MVV neurotrópicas e altamente neurovirulentas (BENAVIDES et al., 2006). Em outros casos de encefalites lentivirais (O NEIL et al., 2004) foi afirmado que a progressão da doença está associada com a carga viral e resposta inicial do hospedeira à infecção. Isto também ocorre na infecção por MVV (DAWSON, 1980; HOUWERS, 1990) quando animais jovens infectados, sendo incapazes de uma resposta defensiva, permetiriam que os vírus alcançassem o encéfalo (BENAVIDES et al., 2006). A detecção de RNA viral e DNA proviral em secções de tecidos caprinos e ovinos infectados, revelou que os LVPRs poderiam entrar em uma gama de tipos celulares como células dendríticas, linfócitos, plasmócitos, células endoteliais e fibroblastos, adipócitos, células microgliais e pericitos, assim como em células epiteliais dos brônquios, alvéolos, glândulas mamárias e plexo coróide, intestino delgado e túbulos renais e terceira pálpebra (GEORGSSON et al., 1989; ZINK et al., 1990; STASKUS et al., 1991; RYAN et al., 2000; CAPUCCHIO et al., 2003; CARROZZA et al., 2003; PREZIUSO et al., 2004; BIESCAS et al., 2005; ANGELOPOULOU et al., 2006b; BOLEA et al., 2006). Ainda células endoteliais caprinas podem ser infectadas in vitro por transmigração de leucócitos infectados com CAEV (LECHAT et al., 2005). Entretanto a infecção produtiva é restrita às células da linhagem dos macrófagos (DE LA CONCHA- BERMEJILLO, 1995) e da glândula mamária (MSELLI-LAKHAL et al., 1999; LERONDELLE et al., 1999).

41 41 Um estudo para determinar a carga viral em áreas selecionadas e a expressão de RNAm de CAEV em caprinos, oito anos após a infecção, demonstrou que os nódulos linfáticos são um importante reservatório viral. A glândula mamária e células do leite são os sítios preferidos para a replicação do vírus. A carga viral variou significantemente entre os animais, demostrando a importância da carga genética frente à infecção. Foi encontrada uma associação clara entre a ocorrência de lesões histopatológicas e carga viral em sítios específicos. As análises da expressão de RNAm de várias citocinas não revelam diferenças significantes entre animais o que poderiam esclarecer uma considerável variação individual na carga viral observada (RAVAZZOLO et al., 2006). Recentemente, utilizando a técnica de PCR e imunohistoquímica, MVV foram indiretamente detectados no fígado e no coração de seis ovinos naturalmente infectados. Além disso, estes testes revelaram antígenos no citoplasma de hepatócitos e cardiomiócitos. Porém exames histopatológicos mostraram níveis de leve a moderado de colangi-hepatite e miocardite linfocítica crônica, mas não a presença de pequenos agregados linfóides, as lesões linfoproliferativas típicas de MVV nestes órgãos (BRELLOU et al., 2007). A evidência de células infectadas com CAEV no útero e no oviduto coborroram com o achado destas células em secreções genitais pós-parto. Recentemente CAEV proviral foi detectado em tecidos do trato genital: útero, oviduto e ovários. Células da granulosa (LAMARA et al., 2001) e células epiteliais do oviduto (LAMARA et al., 2002a) são completamente susceptíveis à infecção por CAEV in vitro. O DNA proviral de CAEV foi detectado em células do cumulus oophorus, mas não em oócitos de cabras naturalmente infectadas. Um estudo mostrou que vinte e dois por cento dos oócitos com células do cumulus intactas foram positivos para a presença de DNA proviral e nenhum dos oócitos em que as células do cumulus foram removidas mecanicamente foram positivos para o CAEV através de RT-PCR (ALI AL AHMAD et al., 2005). Este resultado contradiz estudos feitos por FIENI et al. (2002, 2003) em que sugerem a presença de CAEV em células infectadas no meio de lavagem do oviduto de cabras infectadas doadoras de embriões e uma potencial transmissão de CAEV para o embrião ou feto. Este estudo demonstra que oócitos livres de CAEV podem ser obtidos

42 42 de cabras infectadas. O DNA proviral do CAEV foi detectado pela primeira vez em folículos pré-antrais de cabras sorologicamente positivas (SILVA, 2006). Estudos in vitro mostraram que a zona pelúcida intacta é uma forte barreira que protege o embrião caprino na infecção por CAEV, mas embriões sem zona pelúcida quando incubados com CAEV e lavados extensivamente, poderiam transmitir a infecção para células MSC (LAMARA et al., 2002b). Células embrionárias prematuras caprinas são susceptíveis à infecção por CAEV e a infecção com estes vírus são produtivas, porém, a única barreira natural que pode prevenir a infecção por CAEV de blastômeros caprinos é a presença de uma zona pelúcida intacta (ZP) (ALI AL AHMAD et al., 2006). In vitro os LVPRs infectam e replicam em cultivo celulares de macrófagos (NARAYAN et al., 1983), membrana sinovial (NARAYAN et al., 1980; QUÉRAT et al., 1984), glândula mamária (MSELLI-LAKHAL et al., 1999; LERONDELLE et al., 1999), células fetais do plexo coróide (SIGURDSSON et al., 1960), músculo cardíaco (LEROUX et al., 1995), baço, timo, linfonodo escapular (NARAYAN et al., 1980), células da linhagem fibroblástica imortalizadas (TEIXEIRA et al., 1997) e tecido epitelial (LEE et al., 1996). E produzem efeito citopático, que consiste na formação de células gigantes multinucleadas ou sincícios e lise celular (CAREY E DALZIEL, 1983). JUGANARU et al., (2010) demostraram ser fraca a associação entre patologia induzida por lentivírus e atividade promotora de LTR, pelo menos nos lentivírus do genótipo E, de baixa patogenicidade, fornecendo evidências indiretas de que o tropismo celular pode ser mediado por sítio de ligação à receptores ao invés de fatores de transcrição. Embora o mecanismo de tropismo tecidual e patogênese da doença por CAEV permanceça indeterminado, várias hipóteses possíveis são previstas: (i) a região do envelope (env) é a porção menos conservada do genoma viral e códigos para ligantes do receptor viral (proteínas de superfície-su e transmembrânica-tm), onde a variabilidade na sequência de nucleotídeos no gene env poderá afetar o tropismo tecidual, direta ou indiretamente. Tem sido ainda proposto que as alterações no tropismo tecidual podem ser responsáveis, pelo menos em parte, por conduzir mudanças na região variável de env. (ii) cofatores poderiam estar atuando em sinergia com o vírus para influenciar o tropismo e (iii) fatores relacionados ao hospedeiro poderiam determinar ou afetar o

43 43 tropismo tecidual (em caprinos MHC I ou II) ou (iv) o tropismo tecidual de CAEV pode vir a culminar com eventos estocáticos aleatórios que ocorrem no início da infecção (MURPHY, 2010). Epidemiologia e Transmissão A menor soroprevalência de infecção por CAEV através de celisa encontrada foi no México, 0,4% (TORRES-ACOSTA et al., 2003); TURQUIA 1,9% (BURGU et al., 1994); Suíça, 2% (KRIEG and PETERHANS, 1990); Itália, 4,2% (GUFLER e BAUMGARTNER, 2007) e Reino Unido, 4,3% (DAWSON E WILESMITH, 1985). Ao contrário, os países com maior soroprevalência foram BRASIL, 36,5%; Noruega, 49,5% (NORD et al., 1998); EUA, 73-81% (CUTLIP et al., 1992; ADAMS et al. 1984) e Austrália, 82% (GREWAL et al., 1986). Por meio de isolamento a partir de células infectadas de ovinos soropositivos, que foram submetidas à microscopia eletrônica, foi concluído o primeiro isolamento deste vírus no país (MOOJEN et al., 1986) nos Estados do Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, Minas Gerais, e por ABREU e colaboradores no ano de 1998 em Pernambuco. No Brasil a infecção por LVPRs está amplamente distribuída. Achados nacionais revelam que 36,5% dos rebanhos caprinos e ovinos estão infectados com vírus (Bandeira et al., 2009). No Ceará, 31,61% dos ovinos avaliados foram positivos para o Maedi-visna, através de levantamento soro epidemiológico utilizando a técnica de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) feito por ALMEIDA e TEIXEIRA (1999). Em 2004, ARAÚJO e colaboradores (2004) verificaram que 4,96 % dos 222 ovinos predestinados ao abate foram positivos para MVV na região metropolitana de Fortaleza. Em 2006, em estudo epidemiológico da região Norte do Ceará, PRIMO e colaboradores (2006) confirmaram a presença de ovinos positivos, com prevalência de 0,5% dos 415 animais testados pelo IDGA. CAMINHA e colaboradores (2008) realizaram o levantamento sorológico por IDGA, de CAEV, na região metropolitana de Fortaleza e encontraram 16 (12,8%) positivos entre os 125 caprinos testados.

44 44 Nos outros estados da região Nordeste, a prevalência encontrada para ovino e/ou caprino foi de 13,40%; 0,73% e 26,1% na Bahia (ALMEIDA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2006; TIGRE et al., 2006), de 4,4% e 2,5% no Piauí (PINHEIRO et al., 1996; BATISTA et al., 2004), de 2,2% e 8,2% na Paraíba (CASTRO et al., 2002; BANDEIRA et al., 2009), de 11,0% no Rio Grande do Norte (SILVA et al., 2005), de 50,6% no Maranhão (ALVES e PINHEIRO, 1997), de 17,7% e 3,9% em Pernambuco (CASTRO et al., 1994, 2002) e de 4,25% em Sergipe (MELO et al., 2003). SILVA e colaboradores (2005) analisaram amostras de soro caprino no Estado do Rio Grande do Norte, verificando na ocasião que, do total dos 184 animais testados, 2,71% foram positivos. Em Pernambuco, OLIVEIRA et al. (2006), analisando amostras de soro caprino, provenientes de abatedouros, notificaram o fato de que 3,8% eram positivos a CAEV. Nos estados da região Sudeste do Brasil, a ocorrência de animais com CAE observada em São Paulo foi de 43,01% e 34,93% (LEITE et al., 2004; MADUREIRA e GOMES, 2007), em Minas Gerais de 33,3% e 23,6% (ASSIS e GOUVEIA, 1994; GOUVEIA et al., 1998), Espírito Santo de 47,5% (GOUVEIA et al., 1998) e no Rio de Janeiro de 29,7%; 21,0% e 10,6% (ASSIS e GOUVEIA, 1994; CUNHA e NASCIMENTO, 1995; GOUVEIA et al., 1998). Na região Sul do Brasil a prevalência encontrada no Paraná foi de 28,2% (SOTOMAIORe MILCZEWSKI, 1997). No Rio Grande do Sul, de 6,0% (MOOJEN et al., 1986) e em Santa Catarina de 6,72% (SELL, 2000). Em estados de outras regiões brasileiras como, Goiás, a prevalência relatada foi de 10,0% (GOUVEIA et al., 1998) e no Pará de 40,0% (RAMOS et al., 1996). Evidências diretas de transmissão natural de ovinos para caprinos e vice-versa, particularmente dos subtipos A4 e B1, dos vírus têm sido relatadas (SHAH et al., 2004b; PISONI et al., 2005). Até agora, os subtipos B1 e B2 (VALAS E GERMAIN, 2006; GREGO et al., 2007), assim como quatro de sete subtipos do grupo A (A1, A3, A4 e A6), foram isolados de ambos, caprinos e ovinos, sugerindo que os subtipos são particularmente propensos a atravessar a barreira entre espécies (VALAS E GERMAIN, 2006). O fato de alguns lentivírus terem sido isolados de caprinos e ovinos indica que a transmissão interespécie deve ter ocorrido pelo menos uma vez em cada um dos subtipos, embora a frequência e direção da transmissão permaneçam desconhecidas (LEROUX et al., 1997; RAVAZZOLO et al., 2001; ROLLAND et al., 2002; ZANONI, 1998).

45 45 A principal forma de infecção de rebanhos livres se dá por meio da introdução de animais portadores oriundos de rebanhos contaminados (ZINK E JOHNSON, 1994). A infecção pelo leite/colostro é a principal via de transmissão em cabritos seguida da transmissão horizontal através de secreções contaminadas (PETERHANS et al., 2004; BLACKLAWS et al., 2004; HERRMANN-HOESING, 2007). A via digestiva, geralmente ocorre no período neonatal, através do leite e/ou colostro de mães infectadas (ROWE et al., 1992), onde os vírus podem se encontrar tanto livre como em células somáticas. Estudos recentes sugerem que a depuração de células associadas aos lentivírus na circulação após a transferência passiva de anticorpos do colostro pode ocorrer após 32 semanas em resposta ao provírus e aos anticorpos anti-lvprs e estes permanecem não detectáveis até os quatro anos de idade (HERRMANN-HOESING, 2007). GUEDES (1999) verificou que em ovinos, em regime de criação intensivo, existem evidências da transmissão do MVV via secreção respiratória ou aerossóis (HOUWERS et al., 1987). Em relação ao potencial risco de transmissão sexual, estudos recentes verificaram a presença de RNAm viral e DNA proviral de CAEV no sêmen (plasma seminal e células não espermáticas, respectivamente) e em tecidos do trato genital de machos naturalmente infectados (ALI AL AHMAD et al., 2008). Recentemente, RICARTE e colaboradores (2010), através de análise de imunohistoquímica e ultraestrutural detectaram a presença do vírus em espermatozóides de caprinos infectados com CAEV. Outros estudos anteriores mostraram que a infecção recorrente ou inflamação nos testículos induziram a liberação do MVV e CAEV no sêmen (LAMARA et al., 2002b; ANDRIOLI et al., 2006). Porém, carneiros infectados com MVV utilizados para procriação com ovelhas não infectadas, e alojadas separadamente, não causou soroconversão nas mesmas (LAMARA et al., 2002b). Experimentos recentes, usando inoculações de MVV intranasal e intratraqueal em ovinos, têm mostrado que a rota intratraqueal, em infecções experimentais, é mais eficiente que a rota de transmissão intranasal (TORSTEINSDOTTIR et al., 2003). Além das vias de infecção, devem-se levar em conta os fatores que afetam o risco de transmissão como estresse, imunossupressão, dose do vírus e rota de infecção, cepa do vírus, idade, alta densidade e tempo de exposição aos vírus (BLACKLAWS et al., 2004).

46 46 Sinais Clínicos O período de incubação da CAE é variável, podendo se estender por vários anos. O aparecimento da manifestação clínica da doença e a produção de patologia significativa induzida pelo vírus podem ocorrer meses ou anos após a infecção (NARAYAN e CLEMENTS, 1989). A manifestação sintomatológica da CAE pode ser dividida em quatro aspectos clínicos principais, podendo ocorrer de forma isolada ou simultânea, incluindo artrite, encefalite, mamite e pneumonia (FRANKE, 1998). A CAE também compromete o estado geral dos animais infectados. A infecção tem longa incubação e a doença evolução crônica, com instalação progressiva das lesões, sendo, na maioria dos casos, manifestada em animais adultos (CASTRO, 1998). Diagnóstico clínico Observam-se as manifestações da sintomatologia como pneumonia, artrite, mamite ou encefalite, dados epidemiológicos e manejo dos animais, porém, o diagnóstico de CAE só é confirmado com testes laboratoriais (PINHEIRO, 2001). Diagnóstico laboratorial Muitos fatores influenciam no diagnóstico sorológico de caprinos infectados com CAEV, incluindo a variação no tempo relativo ao início da infecção, especificidade da proteína viral dos anticorpos do soro e sua quantidade, efeitos da cepa viral e diferenças baseadas nos hospedeiros com relação à resposta imunológica para infecção (DEMARTINI et al., 1999). As características da relação hospedeiro-lentivírus que afetam a detecção em caprinos infectados incluem: heterogeneidade viral, mutação em animais infectados, bem como baixos níveis de replicação viral in vivo. Os caprinos infectados podem ser detectados com base na presença de anticorpos antivirais no soro, pela detecção de proteínas ou do ácido nucléico, além do isolamento viral (DEMARTINI et al., 1999). Essa enfermidade pode ser diagnosticada por vários métodos, sendo o principal a imunodifusão em gel de agarose (IDGA), que é o teste recomendado pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). Existe também o teste de ELISA, Western Blot, imunofluorescência indireta, isolamento do vírus por

47 47 cultivo celular, reação em cadeia de polimerase (PCR), imunohistoquímica e microscopia eletrônica, porém esses procedimentos são mais empregados nas pesquisas científicas (DANTAS, et al., 2008). Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto Nesse teste utilizam-se duas IgG, uma para reconhecer o antígeno e outra (anti- IgG) produzida em diferentes espécies de animal que reconhece a primeira IgG, com a qual se ligará (ALMEIDA; LIMA, 2001). É um ensaio amplamente utilizado para a detecção e/ou quantificação de anticorpos em amostras de soro, com destaque em estudos soroepidemiológicos. A especificidade dessa prova é garantida principalmente pela qualidade do antígeno adsorvido à placa (MADRUGA; ARAÚJO; SOARES, 2001). Vários métodos de ELISA indiretos usando vírus inteiro, proteínas do capsídeo CAEV ou recombinante têm sido descritos (REYBURN et al., 1992; CAREY; ROY; DALZIEL,1993; DANTAS et al., 2008). Esse teste permite a detecção de estirpes de um mesmo vírus que, embora sejam sorologicamente relacionadas, apresentam maior variação entre si (ALMEIDA; LIMA, 2001). Isolamento viral O isolamento viral em cultivo celular é a principal técnica utilizada para o diagnóstico da maioria das infecções virais. Baseia-se na capacidade de demonstrar a propagação dos vírus em cultura de células, mediante observação de alterações morfofisiológicas apresentadas pela monocamada celular ou efeito citopático (CPE). Essa técnica é aplicável ao diagnóstico de quase todas as viroses de interesse veterinário inclusive CAE, capaz de detectar quantidades mínimas de vírus, sendo considerado um teste padrão de diagnóstico em virologia. Existem, no entanto, algumas restrições, uma vez que é demorada, dispendiosa, necessita da implantação de cultivos celulares especiais e, além disso, é incapaz de detectar vírus que não causam efeito citopático (KNOWLES, 1997). Geralmente, o CAEV pode ser isolado de animais vivos pelo cocultivo de células, como leucócitos do sangue periférico, células somáticas de leite ou células de membrana sinovial caprina (MSC) (PINHEIRO, 2001).

48 48 Reação em cadeia de polimerase (PCR) A detecção de DNA proviral pode ser feita também através da PCR. Esta é sensível na detecção de pequenas quantidades de ácidos nucléicos virais e é utilizada para demonstrar a presença de DNA proviral tanto in vivo quanto in vitro. Vários trabalhos têm demonstrado, com sucesso, o uso da técnica de PCR na detecção do DNA proviral dos LVPRs. A PCR permite por amplificação direta de parte do ácido nucléico viral específica de fluidos e tecidos de um animal infectado (ZANONI et al.,1990; REDDY et al., 1993; RIMSTAD et al., 1993; WAGTER et al., 1998). O DNA proviral pode ser detectado em células mononucleares e granulócitos presentes no soro de leite, inferindo que o soro lácteo pode ser infectante, difundindo, consequentemente, os vírus (RUSSO et al., 1997). As variações de PCR aplicadas são: PCR quantitativa em tempo real que foi desenvolvida e caracterizada in vitro (GUDMUNDSSON et al., 2003; ZHANG et al., 2000) e semi-nested PCR utilizando primers degenerados, desenvolvida por ELTAHIR et al. (2006). REDDY et al. (1993) verificaram também que três animais negativos por IDGA foram positivos por PCR, enquanto dois animais positivos por IDGA apresentaram resultado negativo por PCR. Devido à alta variabilidade genômica dos lentivírus, a escolha dos primers em genes relativamente conservados como pol, gag e da LTR, combinado a com as condições de reação para a máxima sensibilidade é decisiva para detecção de um grande espectro de cepas de campo de ambos CAEV e MVV (ZANONI, 1998). WAGTER e colaboradores (1998) através de PCR, utilizando um mix de seis primers de três cepas de lentivírus ovino e um de caprino da região conservada do gene gag, encontraram resultados discordantes com quantidades diferentes de amostras de sangue (monócitos) demonstrando que a sensibilidade do teste é dependende da carga viral, e que o volume da amostra é diretamente proporcional a possibilidade de detecção do vírus. Verificaram que quando amostraram 1 ml de sangue de seis animais nenhum reagiu positivamente, entretanto quando aumentaram a alíquota para 5 ml, cinco dos seis animais foram positivos e quando utilizaram 10 ml de sangue todos os animais foram positivos. De 60 animais soropositivos pela IDGA, o PCR do sangue detectou somente 53. Observaram, também, que a resposta sorológica pode ser bem lenta até 18

49 49 meses após a detecção pelo PCR ou até mesmo não soroconverter e que a PCR é mais eficiente em detectar DNA no sangue nos estágios iniciais da doença. A detecção de infecção por LVPR através de PCR é indicativa de uma infecção persistente e é dependente da quantidade amplificada da sequência alvo e da especificidade do primer. Entretanto esta técnica poderá ser utilizada em programas de erradicação, quando estiver disponível rotineiramente, para identificar os animais não diagnosticados por sorologia, inclusive antes da soroconversão. É recomendado que esta técnica seja empregada para esclarecer resultados sorológicos indeterminados ou negativos, devido ao alto custo e aos resultados discordantes entre testes sorológicos e PCR (KNOWLES, 1997; RIET-CORREA, 2001). Imunodifusão em gel de agarose (IDGA) Recomendado pela OIE, por ser de fácil aplicabilidade e não exigir equipamentos nem instalações sofisticadas, o IDGA é a forma diagnóstica mais utilizada em todo o mundo, principalmente em programas de controle da doença (MOOJEN et al., 1986). O IDGA tem alta especificidade, característica essa que o credencia a ser empregado como padrão no diagnóstico de triagem (VAREA et al., 2001). Segundo VITU e colaboradores (1982), o teste de IDGA é capaz de identificar animais experimentalmente infectados com CAEV cerca de quatro a cinco meses após a infecção. Os autores indicam ainda que esse teste se mostrou mais sensível que o teste de fixação do complemento e, ao ser comparado com o ELISA, mostrou resultados bastante correlacionados. Vale salientar que, ao se empregar o ELISA, a infecção pode ser identificada de modo mais precoce, até sete semanas após o período de incubação. Esse fato foi confirmado por LARSEN et al., (1982), ao avaliarem caprinos experimentalmente infectados, afirmando a presença de anticorpos precipitantes, os quais podiam ser detectados de maneira mais precoce e com maior intensidade do que na fixação do complemento. O teste IDGA pode ser utilizado para a detecção de anticorpos anti-caev tanto no soro sanguíneo quanto no colostro de animais infectados e a presença de anticorpos no colostro pode ser utilizada na detecção da infecção no rebanho (ALKAN e TAN, 1998).

50 50 Western blotting ou imunoblotting É uma técnica imunoenzimática de detecção de proteínas. Foi largamente empregado em estudos bioquímicos e imunológicos e com o advento das técnicas de Biologia Molecular, tal método é aplicado como ferramenta valiosa nos estudos de expressão gênica. As análises de Western blotting são deveras úteis na identificação e quantificação de proteínas específicas, em uma mistura complexa de proteínas, com a vantagem de não se empregar qualquer marcação radioativa (REGITANO e COUTINHO, 2001). Prevenção e controle Até o presente, não existe tratamento nem vacina contra CAEV. Com isso, o controle dessa lentivirose é muito difícil, devendo-se impedir a entrada de animais infectados no plantel e fazer exames periódicos do rebanho, para que os animais doentes possam ser identificados e separados dos sadios ou mesmo eliminados do rebanho (CASTRO, 1998). Quando a prevalência for maior do que 30% sugere-se a formação de um rebanho de animais negativos separado dos positivos, de modo a estabelecer o saneamento da propriedade mediante um rigoroso manejo sanitário de ambos os grupos e da gradativa eliminação do grupo dos animais infectados (FRANKE, 1998). Nos plantéis suspeitos ou sabidamente positivos, devem-se separar os cabritos imediatamente após o nascimento, evitando ao máximo seu contato com as secreções da mãe; administrar colostro de cabras soronegativas por IDGA tratado a 56 ºC por 60 min, ou de vaca; alimentar os cabritos com leite de vaca ou leite de cabras pasteurizado; testar os cabritos a cada seis meses e separar os positivos (CASTRO, 1998). Apesar da inexistência de tratamento, ARAÚJO (2008), estudando a atividade antiviral de inibidores da enzima transcriptase reversa (lamivudina, estavudina, zidovudina e efavirens), observou que estes inibiram in vitro a replicação dos LVPRs, enquanto os inibidores da enzima protease não impediram a multiplicação do agente. Nesse mesmo trabalho, o autor avaliou a atividade antiviral dos extratos, tanto do cinamomo (Melia azedarach L.) quanto do nim (Azadirachta indica A. Juss) e verificou que estes inibiram in vitro a replicação dos vírus da artrite encefalite caprina e do Vírus Maedi-visna.

51 51 O desenvolvimento de uma vacina é um processo longo e dispendioso. Várias vacinas já foram e estão sendo testadas contra os LVPRs, porém nenhuma apresentou uma proteção eficaz, embora algumas tenham apresentado produção de anticorpos precipitantes e neutralizantes. Pesquisadores utilizando um vírus inativado por calor, formalina com ou sem adjuvante incompleto de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio para vacinar ovinos, observaram que os ovinos produziram anticorpos precipitantes contra o vírus, os quais não protegeram contra a infecção quando desafiado com o MVV in vivo. Não obstante, experimentos de vacinação com o vírus da imunodeficiência símia (SIV) atenuado têm mostrado reduzir a carga viral e atrasar a progressão da infecção para a doença clínica (WYAND et al., 1996). Resultados similares são relatados com vírus da imunodeficiência felina (FIV) (PISTELLO et al., 2003). PERTUSSON et al., (2005) utilizando clone do vírus MVV atenuado, por via intratraqueal, observaram em dois dos ovinos vacinados que os anticorpos neutralizantes foram específicos para o vírus vacinado, mas não neutralizaram o vírus do desafio, apesar da grande similaridade genética de ambos os vírus. Caprinos Saanen foram imunizados com glicoproteína de superfície gp 135 purificada de isolado (CAEV-63), e avaliados para a produção de anticorpos neutralizantes homólogos e a ocorrência de reação cruzada. Os anticorpos neutralizantes CAEV-63 foram detectados em todos os animais após sete imunizações com gp 135 em adjuvante Quil A. Além disso, o soro de três dos quatro testados neutralizou um isolado do CAEVco; todavia, o soro de um dos caprinos não manifestou neutralização para o CAEVco heterólogo, porém inibiu um CAEVco neutralizado por outro soro. Em suma, o estudo demonstrou que a vacina de subunidades da glicoproteína desse lentivírus pode induzir resposta humoral neutralizante cruzada em caprinos (KEMP et al., 2000).

52 52 JUSTIFICATIVA A natureza de uma doença, especialmente sua epidemiologia e impacto econômico potencial sobre populações de animais são fatores de elevada importância para autoridades veterinárias nacionais, quando forem ponderar as ameaças a países importadores, regiões ou rebanhos (GARNER et al., 1995). No Brasil, importações de animais de alta linhagem procedentes de países com alta prevalência para a lentivirose caprina e ovina têm ocorrido no decorrer de vários anos. Relatos comprovaram que a introdução e disseminação do CAEV e MVV no rebanho nacional ocorreram pelas importações de raças leiteiras, precedentes de distintos países, sem adequada supervisão, acarretando graves problemas sanitários (ASSIS E GOUVEIA, 1994). A introdução de novas cepas merece atenção especial, pois estas podem se apresentar mais virulentas que as nativas, além disso, muitos agentes como os vírus de RNA, que não apresentam a função de leitura e correção genética, podem ter altas taxas de mutação, de aproximadamente um milhão de vezes mais que a de animais e plantas. Consequentemente há uma enorme diversidade de populações de vírus de RNA que podem se tornar mais patogênicos e causarem novas doenças quando recémintroduzidos em novos ambientes (ANDRIOLI, 2001). Dessa forma, a caracterização molecular dessas amostras é importante para evidenciar a diversidade de propriedades biológicas dos vírus que podem redundar em diferenças de citopatogenicidade tanto in vivo quanto in vitro, e de manifestações clínicas da doença, além de auxiliar o desenvolvimento de métodos de diagnósticos mais sensíveis. O isolamento e a caracterização de novas amostras virais provenientes de regiões geográficas distintas possibilitarão um estudo mais detalhado da heterogeneidade genética entre os LVPRs, fundamental tanto para os estudos epidemiológicos relacionados à transmissão intra e interespecífica dos vírus, quanto para esclarecer a origem e a evolução desse grupo viral. O conhecimento dos sorotipos virais existentes servirá de base para a produção de antígenos para testes de diagnósticos mais eficientes e possíveis antígenos vacinais.

53 53 HIPÓTESE CIENTÍFICA Devido à alta variabilidade genética dos lentivírus, as sequências dos genes gag, env e pol de isolados de animais naturalmente infectados de vários estados brasileiros são diferentes das sequências dos genes gag, env e pol obtidas das cepas padrões (CAEV-Cork e K1514).

54 54 OBJETIVOS Objetivos Gerais Isolar cepas virais circulantes, de animais naturalmente infectados, em vários Estados do Brasil, tais como: Ceará, Piauí, Rio Grande do Norte, Bahia e Minas Gerais. Caracterizar molecularmente as sequências parciais dos genes gag, env e pol, obtidas de amostras virais isoladas. Implementar uma biblioteca genômica de LVPRs isolados no Brasil. Objetivos Específicos Classificar as amostras virais isoladas nos tipo rápido/alto ou lento/baixo por isolamento viral; Amplificar os genes de interesse através da PCR. Sequenciar parcialmente os genes gag, env e pol das amostras virais isoladas; Comparar as sequências parciais de gag, env e pol com outras sequências disponíveis no GenBank através da construção de uma árvore filogenética.

55 55 CAPÍTULO I Primeiro Isolamento de Lentivírus de Pequenos Ruminantes em Caprino Naturalmente Infectado em Rebanho do Rio Grande do Norte, Brasil First Isolation of Small Ruminant Lentiviruses from Naturally Infected Goat in Flock of Rio Grande do Norte, Brazil. Periódico: Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.78, n.4, p , out./dez., 2011

56 56 Resumo O Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e Vírus Maedi-visna (MVV) pertencem ao gênero Lentivírus da família Retroviridae. São considerados geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados. O objetivo desde trabalho foi isolar o vírus da CAE de um animal oriundo de um rebanho do Rio Grande do Norte,positivo pelo teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA), através do cocultivo de leucócitos infectados do sangue periférico em Membrana Sinovial Caprina (MSC). Dezesseis caprinos da raça Saanen, com suspeitas clínicas para CAE foi testado por IDGA e Western Blotting. Para o isolamento viral, os leucócitos do sangue periférico foram isolados por cocultivo em MSC. Monócitos/Macrófagos coletados foram inoculados em monocamadas pré-formadas em garrafas A25. O resultado do IDGA foi positivo para um animal, confirmado por Western Blotting. Após 50 dias de cocultivo, foi realizada a coloração da monocamada com cristal de violeta a 0,1% para visualização do ECP e realizada Nested-PCR do sobrenadante do cocultivo, com confirmação do efeito citopático viral. A cepa isolada, denominada BrRN-CNPC.G1 foi considerada o primeiro isolamento do CAEV no Estado do Rio Grande do Norte. Esse estudo permitirá em breve, realizar a caracterização molecular do genoma do vírus isolado, através da análise de seus diferentes genes estruturais e comparar com outras sequencias virais isoladas para identificar a provável origem da infecção desse animal e estabelecer as possíveis divergências entre cepas padrões de Lentivírus e cepas regionais circulantes. Palavras-chave: Cocultivo, Membrana Sinovial Caprina, CAEV.

57 57 Abstract Caprine Arthritis Encephalitis virus (CAEV) and Visna/maedi virus (VISNA) belong to the genus Lentivirus family Retroviridae. The aim of the present study was to isolate the CAE goat from positive goats when tested by agarose gel immunodifusion (AGID) by cocultivation techniques of infected peripheral blood leukocytes in goat synovial membrane (GSM). In this study, one flock of 16 goats, obtained from a flock of Rio Grande do Norte with suspected clinics for CAEV, was screened using Agar-gel Immunodiffusion (AGID) and Western Blotting. The result was positive for an animal, confirmed by Western Blotting. For virus isolation, peripheral blood leukocytes (PBL) were isolated from the blood for the co-culture on goat sinovial membrane (GSM) cells. Monocytes/macrophages collected were inoculated in monolayer of 90% semiconfluent cells in the A25 culture bottles. After 50 days co-culture was performed staining of the monolayer with crystal violet 0.1% for viewing viral cytopathic effects (CPE) characteristic of viruses and nested-pcr performed with the supernatant of co-culture for confirmation of CPE. The isolate, named BrRN-CNPC.G1 was considered the first isolation of Small Ruminant Lentiviruses from Naturally Infected Goat in Flock of Rio Grande do Norte, Brazil. This study will soon perform the characterization molecular isolation of the virus genome, by analysis of their different structural genes and compare with other viral sequences isolated to identify the likely source of infection of that animal and establish the possible differences between strains of lentiviruses and regional strains circulating. Key-words: Co-culture, Goat sinovial membrane, CAEV.

58 58 Primeiro Isolamento de Lentivírus de Pequenos Ruminantes em Caprino Naturalmente Infectado em Rebanho do Rio Grande do Norte, Brasil. 1 Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa; 2 Maria Fátima da Silva Teixeira; 3 Raymundo Rizaldo Pinheiro; 4 Dalva Alana Aragão de Azevedo; 4 Samilly Mesquita Alves, 3 Alice Andrioli Pinheiro 1 Autor correspondente: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE, Av. Paranjana 1700, , Fortaleza, CE, Brasil, Tel.: ; Fax: aryanalima@yahoo.com.br 2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE, 3 Embrapa Caprinos e Ovinos, Laboratório de Virologia; 4 Iniciação Científica CNPq/PIBIC e FUNCAP, Universidade Estadual Vale do Acaraú UVA.

59 59 Introdução Os Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPRs) estão amplamente distribuídos entre caprinos e ovinos. Diferentes formas clínicas da doença foram descritas em pequenos ruminantes infectados com o vírus, tais como artrite progressiva crônica, pneumonia e mastite em animais adultos e, mais raramente, leucoencefalomielite em animais de dois a quatro anos de idade (CRAWFORD E ADAMS, 1981). O Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e Vírus Maedi-visna (VISNA) pertencem ao gênero Lentivírus da família Retroviridae. São considerados geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados. De acordo com a nova nomenclatura, os LVPRs são classificados em cinco grupos: A-D proposto por SHAH et al. (2004) e o grupo E, altamente divergente, proposto por REINA et al. (2009). Segundo CORREL et al. 1992, CAEV possui tropismo por células do sistema imune da linhagem dos monócitos/macrófagos, na qual incorpora seu genoma, escapando dos mecanismos de defesa do hospedeiro. No Brasil, por meio de isolamento em células infectadas de ovinos soropositivos, que foram submetidas à microscopia eletrônica, foi concluído o primeiro isolamento deste vírus no país (MOOJEN, et al., 1986) nos Estados do Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, em Minas Gerais, por ABREU e colaboradores no ano de 1998 em Pernambuco, TIGRE et al. (2006) na Bahia e por FEITOSA et al. (2010) no Estado do Ceará. O isolamento de cepas regionais contribui para um melhor conhecimento da diversidade genética circulantes desses vírus e pode ainda contribuir para melhorar o controle da doença. O objetivo desde trabalho foi isolar o vírus da CAE de um animal oriundo de um rebanho do Rio Grande do Norte, positivo pelo teste de Imunodifusão

60 60 em Gel de Agarose (IDGA), através do cocultivo de leucócitos infectados do sangue periférico em Membrana Sinovial Caprina (MSC). Material e Métodos IDGA e Western Blotting Dezesseis caprinos da raça Saanen, obtido de um rebanho do Rio Grande do Norte com suspeitas clínicas para CAE foi testado sorologicamente para a presença de anticorpos contra a proteína Gag do capsídeo (p28) usando o kit IDGA produzido pela Embrapa Caprinos e Ovinos, este sendo previamente testado contra o controle positivo do kit Americano (Caprine Arthritis-Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology, Inc - USA). O rebanho foi posteriormente testado para a CAE por Western Blotting, segundo a metodologia descrita por PINHEIRO (2001). Isolamento dos Leucócitos do Sangue Periférico Foram coletados 10 ml de sangue por venipuntura da jugular em tubo com anticoagulante (EDTA) para obtenção dos leucócitos do sangue periférico. Estes foram isolados por centrifugação a 380 g por 10 minutos. Os eritrócitos foram hemolisados com 8 ml de cloreto de amônio (0,84%), por duas vezes. O pellet foi lavado em 10 ml de solução salina fosfato PBS a 380 g por 5 min e finalmente ressuspendido em 1 ml de PBS para uso no cocultivo em células MSC.

61 61 Cultivo de Células de Membrana Sinovial Caprina (MSC) Explantes das membranas sinoviais caprinas das articulações intercarpais de membros anteriores de cabritos livres de CAEV foram cultivados em Meio Essencial Mínimo (MEM-G), acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), incubadas a 37 o C em atmosfera de 5% de CO 2 (ABREU et al., 1998) em garrafas de cultura celular A25. O meio foi trocado até a monocamada obter 90% de confluência. Cocultivo de Monócito/Macrófagos com MSC Monócitos/Macrófagos (200 L) coletados foram inoculados em monocamadas pré-formadas em garrafas A25 (capacidade 25 cm 2 ) e incubados durante 60 minutos em estufa 37 o C a 5% de CO 2 acrescidos de 1 ml de meio essencial mínimo (MEM) sem soro fetal bovino (SFB) (Sigma ; BDV Free). Após o período de incubação foram adicionados 3,5 ml de MEM com 10% de soro fetal bovino. O meio foi trocado a cada sete dias e a passagem foi realizada a cada 21 dias, com adição de 200 L de células da MSC a cada troca de meio ou passagem. A monocamada foi examinada diariamente em microscópio invertido para verificação de efeito citopático viral (ECP), formação de sincícios, fusão nuclear ou vacuolização. Após 50 dias de cocultivo, foi realizada a coloração da monocamada com cristal de violeta a 0,1% para visualização do ECP. Extração de DNA proviral a partir de sobrenadante de cocultivo O sobrenadante de cocultivo coletado a cada sete dias foi utilizado para extração do DNA proviral. Uma proporção de 1:1 de PBS 1X foi utilizada para centrifugar 5 ml

62 62 de sobrenadante de cocultivo a 250 g por 5 minutos. Após a centrifugação a fase superior foi descartada e o pellet novamente lavado em PBS nas mesmas condições anteriores. Em seguida o pellet foi ressuspendido em 2 ml de tampão hipertônico, durante 2 minutos a temperatura ambiente, para lise do citoplasma celular, seguido de centrifugação a 1100 g por 10 minutos. O pellet foi ressuspendido em 2 ml de PBS e submetido a centrifugação a 1100 g por 10 minutos. Por fim, o sedimento foi novamente ressuspendido em 250 L de tampão de PCR e homogeneizado. O material foi, então, tratado com proteinase K (0,1 g/ L), durante 60 minutos, em banho-maria a 56 o C. A proteinase K foi inativada termicamente em água fervente a 100 o C por 10 minutos e acondicionadas em freezer a -20 o C até a sua utilização. Nested-PCR Duas rodadas de PCR (Nested-PCR) foram realizados para amplificar um fragmento de 187 pb de DNA proviral, correspondente ao gene gag de CAEV. Todos os primers foram desenhados baseados na sequencia padrão de CAEV-Cork publicadas por SALTARELLI et al., (1990). Foram utilizados dois pares de primers. Os oligonucleotídeos externos GEX5 (5 -CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3 ) e GEX3 (5 -TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3 ) foram utilizados na primeira amplificação, correspondendo as bases e o complemento , respectivamente. Os oligonucleotídeos internos GIN5 (5 - GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3 ) e GIN3 (5 - ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC- 3 ) foram usados na segunda amplificação, correspondendo as bases e o complemento , respectivamente. Para cada round de amplificação, foi utilizado um controle positivo

63 63 referente ao CAEV-Cork e um controle negativo sem amostra de DNA em paralelo com todas as amostras. O mix de PCR constituiu de 34,6 L de água sem DNA, 5 L de tampão sem MgCl 2 (Tris HCl 10 mm, KCl 50 mm,) 3,5 L de MgCl 2 (1,5 mm), 1 L de cada dntps (100 M) (Invitrogen ), 2 L de cada primers (20 pmol), 0,4 L de Taq (2U) e 5 L de amostra de DNA, tanto para o primeiro como para o segundo round. As amplificações foram realizadas usando termociclador da BioRad em 35 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 C por cinco minutos, 1 minuto a 94 C, anelamento a 56 C por um minuto e extensão a 72 C por 45 segundos, com extensão final por 7 minutos 72 C no último ciclo. Os produtos obtidos foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1 %, corado com brometo de etídio e visualizados em foto documentador de luz ultravioleta com densidade ótica de 260 nm. Resultados IDGA e Western Blotting Um caprino naturalmente infectado foi detectado do teste de IDGA e confirmado por Western Blotting. Isolamento dos Leucócitos do Sangue Periférico e Cocultivo A garrafa de cultura celular foi corada no dia 50. O cocultivo de Monócito/Macrófagos com MSC apresentou formação de poucos sincícios na monocamada, a partir do 27º dia de cocultivo, por observação em microscópio invertido. A cepa isolada, denominada BrRN-CNPC.G1 apresentou fenotipagem altamente lítica, causando a destruição quase total da monocamada desde os primeiros

64 64 dias até o final do cocultivo sendo necessário a adição de mais células a garrafa A25. A presença do efeito citopático viral na monocamada de MSC foi observada, com células gigantes, multinucleadas, variando de 4 a 8 núcleos por célula, confirmando a presença do vírus em células do sistema monocítico fagocitário (SMF). Nested-PCR A confirmação do isolamento foi feita pela amplificação do DNA proviral de CAEV, através de Nested-PCR que detectou a presença fragmento de 187 bp do gene gag no sobrenadante de cultivo celular em todas as 6 coletas de sobrenadante do cocultivo. Discussão A partir de um caprino da raça Saanen, foi isolada uma cepa de LVPR, denominada BrRB-CNPC.G1. Através da técnica de PCR, foi confirmada a presença do DNA proviral no sobrenadante do cocultivo. Os achados desse isolamento viral foram compatíveis com outros relacionados a amostras líticas de LVPR. Os Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e os Vírus Maedi-visna (MVV) têm sido considerados como patógenos geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados entre si. Estes vírus estão constantes e facilmente transpondo a barreira entre espécies de caprinos e ovinos (VALAS et al., 2000; KARR et al., 1996; SHAH et al., 2004). Os LVPRs estão classificados dentro de cinco grupos relativamente equidistante, denominados de A-E (SHAH et al., 2004; REINA et al., 2009). A alta heterogeneidade de sequências de nucleotídeos e aminoácidos em lentivírus pode determinar a sua

65 65 antigenicidade, virulência e crescimento e pode afetar sua persistência e o seu mecanismo de evasão. Apesar das diferenças no tropismo celular, órgãos alvo e patogenicidade, comumente encontrados entre CAEV e MVV, ambos os vírus foram recentemente atribuído a um único grupo, os LVPRs. A introdução de novas cepas merece atenção especial, pois podem se apresentar mais virulentas que as nativas, além do que muitos agentes como os vírus de RNA, que não apresentam a função de leitura e correção genética, podem ter altas taxas de mutação, de aproximadamente um milhão de vezes mais que a de animais e plantas. Consequentemente há uma enorme diversidade de populações de vírus de RNA que podem se tornar mais patogênicos e causarem novas doenças quando recém-introduzidos em ambientes (ANDRIOLI, 2001). Somente um pequeno número de LVPRs foi isolado no Brasil. Até agora foi concluído o isolamento deste vírus no país nos Estados do Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Pernambuco, Bahia e no Ceará. O isolamento de cepas regionais contribui para um melhor conhecimento da diversidade genética desses vírus (FEITOSA et al., 2010). O conhecimento da variabilidade genética pode ajudar a entender melhor os mecanismos de evolução molecular e heterogeneidade epidemiológica da infecção. A variabilidade genotípica e fenotípica das cepas circulantes pode ser útil para melhorar as ferramentas de diagnóstico, importantes para o controle e erradicação da doença. Futuros estudos de caracterização molecular das amostras virais isoladas poderão ajudar a desenvolver testes de diagnósticos mais sensíveis. Esse trabalho permitirá em breve, estudar a caracterização molecular do genoma do vírus isolado, através da análise de seus diferentes genes estruturais, tais como gag, env e pol e comparar com outras sequencias virais isoladas para identificar a provável origem da infecção desse animal e estabelecer as possíveis divergências entre cepas padrões de Lentivírus e cepas regionais circulantes.

66 66 Conclusão Foi realizado o primeiro isolamento do CAEV no Estado do Rio Grande do Norte a partir de monócitos/macrófagos co-cultivados em monocamadas de membrana sinovial caprina. A cepa foi caracterizada fenotipicamente como lítica, do tipo rápida/alta. Agradecimentos UECE, EMBRAPA Caprinos e Ovinos, FUNCAP, CNPq e Banco do Nordeste pelo apoio financeiro para realização deste projeto. Referências Bibliográficas ABREU, S. R. O., CASTRO, R. S., NASCIMENTO, S. A., Produção de antígeno nucleoprotéico dos vírus da artrite encefalite caprina e comparação com os vírus Maedivisna para imunodifusão em ágar-gel. Pesq. Vet. Bras. 18, ANDRIOLI, A. Vírus da Artrite Encefalite Caprina: PCR e Isolamento Viral em amostras de sêmen, fluido uterino e embriões. Belo Horizonte MG: Escola de Veterinária UFMG, Tese (Doutorado). CORREL, M. D.; BRANDON, M. R.; SHEFFER D. et al., Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in Tlymphocytes. J. Virol. 66,

67 67 CRAWFORD, T. B.; ADAMS, D. S., Caprine arthritis-encephalitis: clinical features and presence of antibody in selected populations. J. Am. Vet. Med. Assoc., v. 178, FEITOSA, A.L.V.L., TEIXEIRA, M. F. S., PINHEIRO, R. R., et al., Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses from Northern Brazil. Small Ruminant Res., 94(1-3), KARR BM, CHEBLOUNE Y, LEUNG K, NARAYAN O., Genetic characterization of two phenotipically distinct North American ovine lentiviruses and their possible origin from caprine arthritisencephalitis virus. Virology. 225(1),1 10. MOOJEN, V., SOARES, H.C., RAVAZZOLO, A.P., PIZZOL, M., GOMES, M., Evidência de infecção pelo lentivirus (Maedi-visna/artrite encefalite caprina) em caprinos no Rio Grande do Sul, Brasil. Arq. Fac. Med. Vet. UFRGS. 14, PINHEIRO, R.R., Vírus da artrite encefalite caprina: Desenvolvimento e padronização de ensaios imunoenzimáticos (ELISA e Dot-Blot) e estudo epidemiológico no Estado do Ceará. Belo Horizonte: UFMG, p. Tese (Doutorado) Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais. REINA, R., GREGO, E., PROFITI, M., GLARIA, I., ROBINO, P., QUASSO, A., AMORENA, B., ROSATI, S., Development of specific diagnostic test for small ruminant lentivirus genotype E. Vet. Microbiol. 138, SALTARELLI, M., QUERAT, G., KONINGS, D.A., VIGNE, R., CLEMENTS, J.E., Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology 179, SHAH, C., BONI, J., HUDER, J.B., VOGT, H.R., MUHLHERR, J., ZANONI, R.,MISEREZ, R., LUTZ, H., SCHUPBACH, J., Phylogenetic analysis and reclassification of caprine and ovine lentiviruses based on 104 new isolates: evidence

68 68 for regular sheep-to-goat transmission and worldwide propagation through livestock trade. Virology. 319 (1), TIGRE, D. M., CAMPOS, G. S., SILVIA, I. S., Isolamento e identificação do vírus da Artrite encefalite caprina, a partir do cocultivo de células mononucleares do sangue com células de membrana sinovial de cabra. R. Ci. Méd., biol. 5 (2), VALAS S, BENOIT C, BAUDRY C, PERRIN G, MAMOUN RZ., Variability and immunogenicity of caprine arthritis-encephalitis virus surface glycoprotein. J Virol. 74(13),

69 69 CAPÍTULO II Isolamento do Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) realizado por cocultivo de leucócitos de caprinos naturalmente infectados provenientes de estados do Nordeste e Sudeste (CE, PI, BA e MG) do Brasil Isolation of Caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) through by coculture of leukocytes from naturally infected goats from Brazil Periódico: artigo a ser submetido.

70 70 Resumo O Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e Vírus Maedi-visna (MVV) pertencentes ao gênero Lentivírus da família Retroviridae, são considerados geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados. O objetivo desde trabalho foi isolar o vírus da CAE de caprinos positivos, de diferentes raças, idades e sexo, oriundos dos rebanhos de quatro Estados do Brasil (Ceará e Piauí, Bahia e Minas Gerais) que foram positivos pelo teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA). Os resultados positivos para o IDGA foram confirmados por Western Blotting. Para o isolamento viral, leucócitos do sangue periférico foram destinados ao cocultivo em Membrana Sinovial Caprina (MSC). Os leucócitos coletados foram inoculados em monocamadas pré-formadas em garrafas A25. Após o cocultivo, foi realizada a coloração da monocamada com cristal de violeta a 0,1% e a visualização do ECP (Efeito Citopático). Os resultados demonstraram que os vírus isolados foram identificados como sendo pertencente ao gênero lentivírus pela observação de células gigantes multinucleadas (sincícios) em Membrana Sinovial Caprina (MSC), característico para esse tipo de vírus em isolamento viral. Uma Nested-PCR realizada a partir do sobrenadante do cocultivo confirmou a infecção por CAEV por amplificar parte do gene gag. As cepas isoladas mostraram-se fenotipicamente líticas, do tipo rápido/alto. Palavras-chave: Cocultivo. Membrana Sinovial Caprina. CAEV.

71 71 Isolamento do Vírus da Artrite Encefalite Caprina através de cocultivo de macrófagos no Brasil 1 Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa; 2 Maria Fátima da Silva Teixeira; 3 Raymundo Rizaldo Pinheiro; 4 Dalva Alana Aragão de Azevedo; 5 Ronaldo Pereira Dias, 3 Alice Andrioli Pinheiro 1. Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE, 2. Professora Orientadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE; Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq., 3. Pesquisador Embrapa Caprinos e Ovinos, Laboratório de Virologia; 4. Bolsista de Iniciação Científica CNPq/PIBIC e FUNCAP, Universidade Estadual Vale do Acaraú UVA. 5. Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE. * Corresponding author at: Laboratory of Virology, State University of Ceará, Av. Paranjana, 1700, , Fortaleza, CE, Brazil. Phone.: ; Fax:

72 72 Abstract Caprine arthritis encephalitis virus and Visna/Maedi virus belong to Lentivirus genus of Retroviridae family. They are considered genetically distinct but antigenically related. The aim of the present study was to isolate the CAE virus from positive goats of different breeds, ages and sex, which were positive when tested by agarose gel immunodifusion (AGID). Cocultivation techniques of infected peripheral blood leukocytes in goat synovial membrane (GSM) were performed in animals from the herds of the Ceará, Piauí, Bahia and Minas Gerais states, Brazil. The positives results were confirmed by Western Blotting. For virus isolation, peripheral blood leukocytes were isolated for the cocultivation on GSM. The collected monocytes/macrophages were inoculated into preformed monolayers in bottles A25. After cocultivation, the monolayer was stained with crystal violet 0,1% followed by the observation of the CPE (cytopathic effect). The lentivirus was identified as CAEV by observation of multinucleated giant cells (syncytium) in GSM. A nested-pcr performed from the supernatant of the cocultivation confirmed infection by CAEV amplifies a portion of gag gene. The isolated strains were shown to be phenotypically like rapid/high. Key-words: Cocultivation, goat synovial membrane (GSM), CAEV.

73 73 1.Introdução A CAE é uma doença causada pelo Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV), um retrovírus pertencente à família Retroviridae, subfamília Lentivirinae, gênero Lentivírus e acomete caprinos de todas as raças, idades e sexos (CORK et al., 1974). A sintomatologia nervosa, ou seja, a encefalite ocorre em cabritos, o que leva a quadros de ataxia secundária e paresia. A forma articular é a mais comum e se manifesta essencialmente nos adultos (RUSSO, 1984), bem como a forma pulmonar e mamária. A doença acarreta grandes perdas econômicas para os caprinocultores, tais como diminuição da produção láctea e do período de lactação, assim como perda de peso ocasionada pela dificuldade de locomoção, redução do peso ao nascer e da taxa de crescimento e morte (PINHEIRO et al., 2003), sendo recomendado o abate dos animais infectados. O isolamento e a análise filogenética de cepas regionais circulantes aumentam o conhecimento da diversidade genética desses vírus e contribuem para o controle da doença. O objetivo desde trabalho foi isolar o vírus da CAE, de animais positivos pelo teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) e Western Blotting, por meio cocultivo de leucócitos infectados do sangue periférico em Membrana Sinovial Caprina (MSC), oriundos dos rebanhos dos Estados da Bahia, Ceará, Piauí e Minas Gerais. Material e Métodos IDGA e Western Blotting Mil e duzentos caprinos e ovinos de diversas idades, raças e sexo dos estados da Bahia, Ceará, Piauí e Minas Gerais, com suspeitas clínicas para CAE, foram testados

74 74 sorologicamente para a presença de anticorpos contra a proteína Gag do capsídeo (p28) usando o kit IDGA produzido pela Embrapa Caprinos e Ovinos, este sendo previamente testado contra o controle positivo do kit Americano (Caprine Arthritis- Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology, Inc - USA). Os animais positivos no IDGA para a CAE foram confirmados por Western Blotting, segundo a medodologia descrita por Pinheiro (2001). Leucócitos do Sangue Periférico e Cultivo de MSC Foram escolhidos 37 animais positivos por ambos os testes, IDGA e Western blotting. Destes foram coletados 10 ml de sangue por venipuntura da jugular em tubo com anticoagulante (EDTA) para obtenção dos leucócitos do sangue periférico, isolados por centrifugação a 380 g por 10 minutos. Os eritrócitos foram hemolisados com 8 ml de cloreto de amônio (0,84%), por duas vezes. O pellet foi lavado em 10 ml de solução salina fosfato (PBS), centrifugado a 380 g por 5 min e, finalmente, ressuspendido em 1 ml de PBS para uso no cocultivo em células MSC. Explantes das membranas sinoviais caprinas das articulações intercarpais de membros anteriores de cabritos livres de CAEV foram cultivados em Meio Essencial Mínimo (MEM-G), acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), incubadas a 37 o C em atmosfera de 5% de CO 2 (ABREU et al., 1998) em garrafas de cultura celular A25. O meio foi trocado a cada horas até a monocamada obter 90% de confluência.

75 75 Cocultivo de Leucócitos com MSC Leucócitos (200 L) coletados foram inoculados em monocamadas préformadas em garrafas A25 (capacidade 25 cm 2 ) e incubados durante 60 minutos em estufa 37 o C a 5% de CO 2 acrescidos de 1 ml de meio essencial mínimo (MEM) sem soro fetal bovino (SFB) (Sigma ; BDV Free). Após o período de incubação foram adicionados 3,5 ml de MEM com 10% de soro fetal bovino. O meio foi trocado a cada sete dias e a passagem foi realizada a cada 21 dias, com adição de 200 L de células da MSC a cada troca de meio ou passagem. A monocamada foi examinada diariamente em microscópio invertido para verificação de efeito citopático viral (ECP), formação de sincícios, fusão nuclear ou vacuolização. Após 50 dias de cocultivo, foi realizada a coloração da monocamada com cristal de violeta a 0,1% para visualização do ECP. Extração de DNA proviral O sobrenadante de cocultivo coletado a cada sete dias foi utilizado para extração do DNA proviral. Uma proporção de 1:1 de PBS 1X foi utilizada para centrifugar 5 ml de sobrenadante de cocultivo a 250 g por 5 minutos. Após a centrifugação, a fase superior foi descartada e o pellet novamente lavado em PBS nas mesmas condições anteriores. Em seguida, o pellet foi ressuspendido em 2 ml de tampão hipertônico, durante 2 minutos a temperatura ambiente, para lise do citoplasma celular, seguido de centrifugação a 1100 g por 10 minutos. O pellet foi ressuspendido em 2 ml de PBS e submetido a centrifugação a 1100 g por 10 minutos. Por fim, o sedimento foi novamente ressuspendido em 250 L de PCR buffer e homogeneizado. O material foi, então, tratado com proteinase K (0,1 mg/ml), durante 60 minutos, em banho-maria a 56

76 76 o C. A proteinase K foi inativada termicamente em água fervente a 100 o C por 10 minutos e acondicionadas em freezer a -20 o C até a sua utilização. Nested-PCR Dois rounds de PCR (Nested-PCR) foram realizadas para amplificar um fragmento de 187 pb de DNA proviral, correspondente ao gene gag de CAEV. Todos os primers foram desenhados baseados na sequência padrão de CAEV-Cork publicadas por Saltarelli et al., (1990). Tabela 1. Tabela 1 - Sequências de primers utilizados nas reações de Nested-PCR e seus respectivos tamanhos de fragmentos amplificados Gene Primers Sequências Tamanho dos fragmentos (bp) gag 1º. round gag 2º. round gag1 (senso) gag2 (antissenso) gag3 (senso) gag4 (antissenso) 5 -CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3 5 -GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC- 3 As reações de PCR foram realização em um volume final de 50 L. Estas consistiam de 20 pmol para cada primer, 100 M de dntps, 1,5 mm de MgCl 2, 1 X de PCR buffer, 2 U de DNA polimerase Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 5 L ou 1 L de DNA extraído para o primeiro ou segundo round, respectivamente. As condições utilizadas na amplificação pela PCR foram de 94 o C por 5 min, 35 ciclos de 94 o C por 1min, 56 o C por 1 minuto s e 72 oc por 45 segundos, seguidos de

77 77 uma extensão final de 72 o C por 7 min, usando termocliclador BioRad. Para cada round de amplificação, foi utilizado um controle positivo referente ao CAEV-Cork e um controle negativo sem amostra de DNA em paralelo com todas as amostras. Os produtos obtidos foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio e visualizados em transiluminador de luz ultravioleta com densidade óptica de 260 nm. Resultados e Discussão IDGA e Western Blotting Dos animais testados, 37 caprinos foram positivos pelo teste de IDGA e confirmados por Western Blotting. Estes foram escolhidos para o isolamento viral por apresentarem forte reação no IDGA e WB. Nenhum Ovino foi diagnosticado como positivo para ambos os testes. Cocultivo de leucócitos com MSC O cocultivo de leucócitos com MSC apresentou formação de poucos sincícios na monocamada, a partir do 27º dia de cocultivo, seguido por observação em microscópio invertido. As cepas isoladas apresentaram fenotipagem altamente lítica, causando a destruição quase total da monocamada desde os primeiros dias até o final do cocultivo, sendo necessária a adição de mais células nas garrafas A25. A presença do efeito citopático viral na monocamada de MSC foi observada, com presença de células gigantes, multinucleadas, variando de 4 a 8 núcleos por célula, confirmando a presença de vírus em células do sistema monocítico fagocitário (SMF) nos 37 isolados (Figura 1).

78 78 Figura 1. Isolamento a partir de cocultivo de monócitos/macrófagos em MSC apresentando efeito citopático característico do CAEV com presença de células gigantes multinucleadas. Nested-PCR A Nested-PCR realizada a partir do sobrenadante do cocultivo confirmou a infecção por CAEV por amplificar um fragmento de 187 pb do gene gag em todas as coletas de sobrenadante do cocultivo (Tabela 2) em trinta e sete cepas de LVPR isoladas dos Estados do Ceará, Piauí, Bahia e Minas Gerais.

79 Tabela 2. Correlação: dia do experimento, coleta de sobrenadante e resultado de PCR 79 Dia do experimento Coleta de Sobrenadante Resultado Nested-PCR Dia 0 Início do cocultivo - Dia 07 1ª. Troca de Meio Positivo Dia 14 2ª. Troca de Meio Positivo Dia 21 1 a. Passagem Positivo Dia 28 4ª. Troca de Meio Positivo Dia 36 5ª. Troca de Meio Positivo Dia 43 2ª. Passagem Positivo Dia 50 Coloração da monocamada - Os achados desses isolamentos virais foram compatíveis com outros relacionados a amostras líticas de LVPR. A introdução de novas cepas merece atenção especial, pois podem se apresentar mais virulentas que as nativas, além do que, muitos agentes como os vírus de RNA, que não apresentam a função de leitura e correção genética, podem ter altas taxas de mutação, de aproximadamente um milhão de vezes mais que a de animais e plantas. Consequentemente há uma enorme diversidade de populações de vírus de RNA que podem se tornar mais patogênicos e causarem novas doenças quando recém-introduzidos em ambientes (ANDRIOLI, 2001). Somente um pequeno número de LVPRs foi isolado no Brasil. O isolamento de cepas regionais contribui para um melhor conhecimento da diversidade genética desses vírus (FEITOSA et al., 2010). O conhecimento da variabilidade genética pode ajudar a entender melhor os mecanismos de evolução molecular e heterogeneidade epidemiológica da infecção. A variabilidade genotípica e fenotípica das cepas circulantes pode ser útil para melhorar as ferramentas de diagnóstico, importantes para o controle e erradicação da doença.

80 80 É importante que a partir desse estudo seja realizada uma caracterização molecular do genoma desses vírus isolados, mediante análise de seus diferentes genes estruturais, bem como compará-los com outras sequências virais isoladas para identificar a provável origem da infecção dos animais. Conclusão O vírus da Artrite Encefalite Caprina está presente nos Estados do Ceará, Piauí, Bahia e Minas Gerais. As cepas isoladas revelaram-se fenotipicamente líticas, do tipo rápido/alto. O cocultivo de monócitos/macrófagos em monocamadas de membrana sinovial caprina demostrou ser uma técnica eficiente no isolamento de lentivírus de pequenos ruminantes. Apoio: UECE, EMBRAPA Caprinos e Ovinos, FUNCAP, CNPq e Banco do Nordeste pelo apoio financeiro para realização deste projeto.

81 81 Referências Bibliográficas ABREU, S. R. O., CASTRO, R. S., NASCIMENTO, S. A. Produção de antígeno nucleoprotéico dos vírus da artrite encefalite caprina e comparação com os vírus Maedivisna para imunodifusão em ágar-gel. Pesquisa Veterinária Brasileira. v. 18, p ANDRIOLI, A. Vírus da Artrite Encefalite Caprina: PCR e Isolamento Viral em amostras de sêmen, fluido uterino e embriões. Belo Horizonte MG: Escola de Veterinária UFMG. Tese de Doutorado CORK, L. C.; HADLOW, W. J.; CRAWFORD, T. B.; GORHAM, J. R.; PIPER, R. C. Infectious leukoencephalomyelitis of young goats. Journal Infeccio Disease, v. 129, n.2, p , FEITOSA, A.L.V.L., TEIXEIRA, M. F. S., PINHEIRO, R. R., et al. Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses from Northern Brazil. Small Ruminant Research. v. 94, n. 1-3, p KARR BM, CHEBLOUNE Y, LEUNG K, NARAYAN O. Genetic characterization of two phenotipically distinct North American ovine lentiviruses and their possible origin from caprine arthritisencephalitis virus. Virology. v. 225, n. 1, p PINHEIRO, R. R.; CHAGAS, A. C. S.; ANDRIOLI, A.; ALVES, F. S. F. Viroses de pequenos ruminantes. Sobral, CE: Embrapa Caprinos. 30 p. (Série Documentos, 46)

82 82 PINHEIRO, R.R., Vírus da artrite encefalite caprina: Desenvolvimento e padronização de ensaios imunoenzimáticos (ELISA e Dot-Blot) e estudo epidemiológico no Estado do Ceará. Belo Horizonte: UFM. 115p. Tese de Doutorado Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais REINA, R., GREGO, E., PROFITI, M., GLARIA, I., ROBINO, P., QUASSO, A., AMORENA, B., ROSATI, S. Development of specific diagnostic test for small ruminant lentivirus genotype E. Veterinary Microbiology. v.138, p RUSSO, P. Virus de l arthrite-encéphalite caprine (CAEV). Bréve Revue. Annales de Recherches Vétérinaires, Paris, v. 15, n. 1, p. 3 6, SALTARELLI, M., QUERAT, G., KONINGS, D.A., VIGNE, R., CLEMENTS, J.E. Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology. v. 179, p SHAH, C., BONI, J., HUDER, J.B., VOGT, H.R., MUHLHERR, J., ZANONI, R.,MISEREZ, R., LUTZ, H., SCHUPBACH, J. Phylogenetic analysis and reclassification of caprine and ovine lentiviruses based on 104 new isolates: evidence for regular sheep-to-goat transmission and worldwide propagation through livestock trade. Virology. v. 319, n. 1, p VALAS S, BENOIT C, BAUDRY C, PERRIN G, MAMOUN RZ.. Variability and immunogenicity of caprine arthritis-encephalitis virus surface glycoprotein. The Journal of Virology. v. 74, n. 1), p

83 83 CAPÍTULO III Análise Filogenética de Lentivírus de Pequenos Ruminantes no Nordeste do Brasil Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses from Northern Brazil Periódico: Small Ruminant Research. 94: , 2010

84 84 Resumo O Vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) e o Vírus Maedi-visna (MVV) são considerados geneticamente distintos, mas antigenicamente relacionados. Neste estudo, um rebanho de 250 cabras foi testado para o IDGA, sendo observada uma soroprevalência de 4.4% (11 animais soropositivos). Quatro caprinos positivos para o IDGA foram testados para a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que amplifica parte do gene gag. Todos os animais foram positivos para o teste biomolecular. As sequências nucleotídicas do gene gag foram determinadas a partir de quatro lentivírus BR/CNPC isolados de caprinos naturalmente infectados. As quatro sequências do gene gag BR/CNPC de LVPRs foram comparadas com sequências do GenBank e os resultados demonstraram que estas estão mais relacionadas com linhagens caprinas que ovinas. A análise filogenética de parte do gene gag mostrou que estes isolados pertencem ao subtipo B1 do grupo de CAEV. A análise também indicou que estes vírus são geneticamente estáveis.

85 85 Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses from Northern Brazil Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa a,*, Maria Fátima da Silva Teixeira a, Raymundo Rizaldo Pinheiro b,**, Rodrigo Maranguape Silva da Cunha c, João Paulo Matos Santos Lima d, Alice Andrioli b, Tânia Valeska Medeiros Dantas a, Valeska Shelda Pessoa de Melo a, Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro a a Laboratory of Virology and Immunology Veterinary Faculty UECE State University of Ceará, Fortaleza, Brazil b National Goat Research Center, Embrapa-CNPC, Brazil c Center of Biotechnology of Sobral, NUBIS, Brazil d Laboratory of Bioinformatics Universidade Federal do Ceará UFC, Brazil * Corresponding author at: Laboratory of Virology, State University of Ceará, Av. Paranjana, 1700, , Fortaleza, CE, Brazil. Tel.: ; fax: ** Corresponding author at: Embrapa Goats, Fazenda Três Lagoas, Estrada Sobral-Groaíras Km 4, P.O. Box 145, , Sobral, CE, Brazil. Tel.: ; fax: addresses: aryanalima@yahoo.com.br (A.L.V.L. Feitosa), rizaldo@cnpc.embrapa.br (R.R. Pinheiro) /$ see front matter 2010 Elsevier B.V. All rights reserved. doi: /j.smallrumres

86 86 Abstract Caprine Arthritis Encephalitis virus (CAEV) and Visna/maedi virus (VISNA), are considered to be genetically distinct but antigenically related pathogens of goats and sheep. In this study, one flock of 250 goats was screened using Agar-gel Immunodiffusion (AGID), and the level of seroprevalence observed was 11 animals (4.4%) of positive tested serum. Four goats positive to AGID were analyzed using a Polymerase Chain Reaction (PCR), which amplifies part of the gag gene. All the animals were found to be positive. The nucleotide sequences of gag gene were determined from four BR/CNPC lentivirus isolates from naturally infected goats. The four gag gene sequences BR/CNPC small ruminant lentivirus (SRLV) were compared to GenBank, and the results demonstrated that these sequences were more related to the caprine rather than the ovine strains. Further phylogenetic analysis of the proviral gag sequences showed that they constituted subtype B1 of the CAEV group. The analyses of the sequences also showed that the viruses were genetically stable. Keywords: Small ruminant lentiviruses, CAEV, VISNA, Phylogeny, Gag

87 87 1. Introduction Small ruminant lentivirus (SRLVs) is distributed worldwide among sheep and goats. Different clinical forms of the disease have been described in Brazil among SRLV-infected small ruminants. CAEV and VISNA are considered to be genetically distinct, but antigenically related pathogens of goats and sheep. According to a recently proposed nomenclature based on the 1.8 kb gag pol and 1.2 kb pol gene sequences, the SRLV are classified into four equidistantly related groups, A D (Shah et al., 2004). An SRLV belonging to the highly divergent genotype E has recently been identified in an Italian goat breed (Reina et al., 2009). The high level of heterogeneity of nucleotide and amino acid sequences in lentiviruses may determine their antigenicity, virulence and growth, as well as their persistence and escape from immunesystem. Despite differences in the target organs, cell tropism and pathogenicity commonly found between the CAEV and the ovine VISNA, both viruses have recently been assigned to small ruminant lentiviruses (SRLV). A genetic analysis of these SRLVs may provide additional insights into the genetic, protein and antigenic makeup of these viruses, their pathogenesis, epidemiology, and phylogenetic relationships, and thus, their position in the recently established SRLV groups (Shah et al., 2004). Genetic studies mayalso be relevant for the development of sensitive and local-breed diagnostic tests. The main aim of this work was to establish an SRLV phylogeny as a basis for future studies of the molecular epidemiology of lentiviral infections in Northeast Brazil dairy goat herds, with particular interest in monitoring the effects of ongoing and future eradication programs on the distribution of SRLV strains.

88 88 2. Materials and methods 2.1. Animals and AGID Two hundred and fifty naturally infected goats of the Saanen and Anglo-nubiana breeds were selected from a dairy flock belonging the National Goat Research Center (CNPC), where, according to a previous serological survey, there was a known chronic infection of goats with CAEV. The flock was located in Northeast Brazil. The seroprevalence was determined using directed antibodies against the major Gag capsid protein of both VISNA and CAEV using the AGID detection Kit (Caprine Arthritis- Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody Test Kit, Veterinary Diagnostic Technology, Inc., USA). Sensitivity was 65.6% and specificity was 94.1% Isolation of peripheral blood leukocytes Peripheral blood leukocytes (PBL) were isolated from the blood by centrifugation at 1500 rpm for 10 min. The erythrocytes were hemolyzed by osmotic shock, the cell pellets were used for co-culture with goat sinovial membrane (GSM) cells Co-culture Cells derived from the GSM were used to propagate monolayer cultures of cells in six-well microtiter plates. The medium was changed until there was a monolayer of 90% semiconfluent cells. The leukocytes were isolated from each AGID-positive animal and were placed in each well, added with 500 l of MEM without fetal bovine serum

89 89 (FBS) (Sigma, BDV Free). The culture plate remained in the CO 2 incubator for 1 h, added by 1 ml of MEM with 5% FBS was then changed to the wells and the cells were incubated until there were cytopathic effects (CPE) characteristic of viruses DNA preparation The culture plate containing the virus-infected cell culture was frozen at -80 o C and thawed at room temperature three times. The purified DNA stocks were stored at - 20 o C until use Nested-PCR and DNA quantification Two rounds of PCR amplification (nested-pcr) were used to detect the 187 bp proviral DNA fragment, corresponding to the leader gag sequence of the CAEV genome. All of the primers were selected on the basis of the published sequence of the CAEV-Co strain (Saltarelli et al., 1990). The primers GEX5 (5 - CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3 ) and GEX3 (5 - TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3 ) were used for the first amplification, corresponding to bases and the complement of , respectively. Primers GIN5 (5 -GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3 ) and GIN3 (5 - ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC-3 -) were used for the second amplification, corresponding to bases and the complementof , respectively. For each amplification, a positive control of CAEV-Co DNA and a notemplate negative control were run in parallel with all of the specimens.

90 DNA sequencing and sequence analysis The products of the PCR amplification from the first round were sequenced using Mega Base 7.0. The sequencing was performed using the external primers GEX5 (5 -CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3 ) and GEX3 (5 - TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3 ). The bases were called using Phred version (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998) and subsequently, the sequence reads were aligned and a single consensus sequence was assembled with Phrap version (Phil Green, University of Washington). All of the positions with ambiguous codes or alignment gaps were excluded from the analyses. The editor program Consed version 16.0 (Gordon et al., 1998) was used to prepare the final version of the consensus sequences. The pairwise genetic distances were calculated by using MEGA version 4.0 (Tamura et al., 2007) with the Tamura Nei (NJ) substitution model. The phylogenetic tree was determined using the neighbor joining (NJ) method (Saitou and Nei, 1987) implemented in MEGA, with the Tamura Nei gamma distance (Tamura and Nei, 1993). The SRLV strains were compared to the K1514-VMV (Sonigo et al., 1985), EV-1 VMV (Sargan et al., 1991), SAOVMV (Querat et al., 1990), P1OLV (Barros et al., 2004), CAEV (Saltarelli et al., 1990), BR/MG (Drumond and Resende, 2001) and BR/UFRGS (Ravazzolo et al., 2001) strains (GenBank accession numbers: M60609, S51392, M31646, AF479638, M33677, AF and AJ305040, respectively).

91 91 3. Results 3.1. Serology The results of the AGID test showed that 11 (4.4%) of the 250 goats were AGID-positive for SRLV. All these animals AGID-positive were descending of animals of the French flock Co-culture Between 14 and 21 days after infection, the characteristic CPE, syncytium was formed, confirming the presence of SRLV Nested-PCR The presence of SRLV in the goat synovial membrane cells was confirmed by the detection of a gag fragment by nested-pcr. Four to 11 samples were amplified of the naturally infected animals. A 187-nucleotide region of the gag SRLV gene ( ) was detected by an electrophoretic analysis of nested-pcr products. The amplification products were sequenced and denoted as BR/CNPC-G1, BR/CNPC-G2, BR/CNPC-G3, BR/CNPC-G4 (BR, Brazil; CNPC, National Goat Research Center; G, goat).

92 DNA sequencing and phylogenetic analysis The phylogenetic analysis revealed that the BR/CNPC viruses formed a cluster of identical or highly related sequences within the genetically heterogeneous CAEV-Co group. A phylogenetic tree (Fig. 1) was obtained using the NJ method with the gag nucleotide sequences, and this tree showed the relationship between BR/CNPC and the other known SRLV strains. The bootstrap values derived from the 100 bootstrap replicates indicating the confidence of the branching pattern are shown above the respective branches. All of the analysis parameters were standard. The analyses also showed a close relationship between the prototype CAEV-Co strain and the two Brazilian strains, CAEVBrUFRGS and the CAEVBR-MG. All of the BR/CNPC SRLV strains had a similar TTG trinucleotide at positions of the gag gene, which would result in a leucine in the gag protein from the SRLV BR/CNPC stains, compared to a leucine in the same position in the CAEV-Co protein (Fig. 2). This nucleotide change would result in the translation of a different amino acid, isoleucine in CAEVCo and leucine in the four BR/CNPC SRLV strains (Fig. 2). The pairwise distance calculations were obtained by comparing the nucleotide and amino acids sequences among the four BR/CNPC strains and known SRLV strains. The values closest to zero represent the strains that are the most similar.

93 93 Fig. 1. In the phylogenetic tree a group identified by the prototype VISNA was clearly distinguished from the CAEVs with a high bootstrap value of Nucleotide sequence accession number All of the new sequences were entered in the GenBank database and are available under check numbers EU300976, EU300977, EU and EU

94 94 Fig. 2. Alignment of nucleotide sequences from the gag region of SRLV strains. Asterisks indicate identity among the strains.

95 95 Fig. 3. Alignment of deduced amino acid sequences from the capsid protein of SRLV strains. Asterisks indicate identity between the strains. 4. Discussion The four gag gene sequences from the BR/CNPC SRLV strains were compared to available GenBank strains, and the results of this comparison demonstrated that these sequences were more related to the caprine strains than to the ovine strains. Further phylogenetic analyses of the proviral gag sequences confirmed the initial classification and showed that these sequences were of the B1 subtype of the CAEV group. The analyses of the sequences also showed viruses were genetically stable, which was previously observed by Laamanen et al. (2007). Although some authors indicate that future studies should concentrate on the env regions, which are sufficiently divergent, rather than the gag region, because the gag region is highly conserved and retains less phylogenetic signal (Rolland et al., 2002), but this study cannot infer the results only with the sequence gag, being necessary more comparative studies with other sequences of viruses.

96 96 All of the four SRLV BR/CNPC strains had the same TTG trinucleotide at positions of the capsid peptide, which was different from the sequence in CAEV- Co. This nucleotide change would result in the translation of a different amino acid, isoleucine in CAEV-Co and leucine in the four BR/CNPC SRLV strains (Figs. 2 and 3). There was an absence of transversions, but transitions were observed. The high level of similarity among the four sequences from Northeast Brazil and the CAEV-Co strain maybe explained by vertical transmission through infected females over the generations. The negative results from these tests suggest that the animals were already infected prior to the tests and had not produced antibodies that could be detected in the test that was used (data unpublished). This gag region of the genome may be used to differentiate the viral strains present in infected animals and to develop more specific diagnostic tests for local breeds. It may also be informative for the establishment of eradication programs according to the distribution of different lineages of SRLV and the development of diagnostic reagents with greater specificity and sensitivity in local flocks (Germain and Valas, 2006), different of the sequences gag gene CAEV-Cork researched by Saltarelli et al. (1990). The results indicate that more studies should be conducted on viral genomic area obtained from animals of Northeast Brazil. 5. Conclusion Eleven animals were AGID-Positive. Four goats positive to AGID were analyzed using a PCR, which amplifies part of the gag gene. The nucleotide sequences of gag gene were determined from four BR/CNPC lentivirus isolates from naturally

97 97 infected goats. The four gag gene sequences BR/CNPC small ruminant lentivirus (SRLV) were compared to GenBank, and the results demonstrated that these sequences were more related to the caprine rather than the ovine strains. Further phylogenetic analysis of the proviral gag sequences showed that they constituted subtype B1 of the CAEV group. The alignment of deduced amino acid sequences from the capsid protein of SRLV strains, indicates a divergence between the strains in this study and the strain CAEV-Co. This divergence is important for a better understanding of the local sequences previously described. Acknowledgements Laboratory of Virology and Laboratory of Immunology Veterinary Faculty UECE State University of Ceará; Laboratory of Bioinformatics Federal University of Ceará (UFC), Fortaleza, Brazil; National Goat Research Center (CNPCEmbrapa); Center of Biotechnology of Sobral (NUBIS); CAPES, FUNCAP and Banco do Nordeste. References Barros, S.C., Ramos, F., Duarte, M., Fagulha, T., Cruz, B., Fevereiro, M., Genomic characterization of a slow/low Maedi visna virus. Virus Genes (29), Drumond, B.P., Resende, M., Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses in naturally infected goats, based on sequence of capsid protein gene. In: 4.

98 98 Encontro de Virologia do Mercosul e XII Encontro Nacional de Virologia. Caldas Novas GO. Virus Rev. Res. 6, 172. Ewing, B., Green, P., Base calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. (8), Ewing, B., Hiller, L., Wendl, M.C., e Green, P., Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res. (8), Gordon, D., Abajian, C., Green, P., Consed: a graphical tool for sequence finishing. Genome Res. (8), Germain, K., Valas, S., Distribution and heterogeneity of small ruminant lentivirus envelope subtypes in naturally infected French sheep. Virus Res. (120), Laamanen, I., Jakava-Viljanen, M., Sihvonen, L., Genetic characterization of maedi-visna virus (VMV) detected in Finland. Vet. Microbiol. (122), Querat, G., Audoly, G., Sonigo, P., Vigne, R., Nucleotide sequence analysis of SA-OVMV, a visna-related ovine lentivirus: phylogenetic history of lentiviruses. Virology (175), Ravazzolo, A.P., Reischak, D., Peterhans, E., Zanoni, R., Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses from Southern Brazil. Virus Res. (79),

99 99 Reina, R., Grego, E., Profiti, M., Glaria, I., Robino, P., Quasso, A., Amorena, B., Rosati, S., Development of specific diagnostic test for small ruminant lentivirus genotype E. Vet. Microbiol. 138, Rolland, M., Mooney, J., Valas, S., Perrin, G., Mamoun, R.Z., Characterisation of an Irish caprine lentivirus strain-srlv phylogeny revisited. Virus Res. (85), Sargan, D.R., Bennet, I.D., Cousens, C., Roy, D.J., Blackaws, B.A., Dalziel, R.G., Watt, N.J., Mcconnell, I., Nucleotide sequence of EV1, a British isolate of Maedi-visna virus. J. Gen. Virol. 72, Saitou, N., Nei, M., The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, Saltarelli, M., Querat, G., Konings, D.A., Vigne, R., Clements, J.E., Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology 179, Shah, C., Boni, J., Huder, J.B., Vogt, H.R., Muhlherr, J., Zanoni, R., Miserez, R., Lutz, H., Schupbach, J., Phylogenetic analysis and reclassification of caprine and ovine lentiviruses based on 104 new isolates: evidence for regular sheep-to-goat transmission and worldwide propagation through livestock trade. Virology (319),

100 100 Sonigo, P., Alizon, M., Staskus, K., Klatzmann, D., Cole, S., Danos, O., Retzel, E., Tiollais, P., Haase, A., Wain-Hobson, S., Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to the AIDS virus. Cell (42), Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S., MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, , Tamura, K., Nei, M., Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. (10),

101 101 CAPÍTULO IV Caracterização Molecular de Lentivírus de Pequenos Ruminantes Isolados de Caprinos no Brasil baseados na análise das sequências dos genes gag e pol Molecular characterization of Small Ruminant Lentiviruses isoleted from Brazil goats based on gag and pol gene sequence analysis Periódico: artigo a ser submetido

102 102 Resumo A CAE é uma doença causada pelo Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV), um retrovírus pertencente à família Retroviridae, subfamília Lentivirinae, gênero Lentivírus e acometem caprinos, de todas as raças, idades e sexos. A sintomatologia nervosa, ou seja, a encefalite ocorre em cabritos, o que leva a quadros de ataxia secundária e paresia. A sintomatologia articular é a mais comum e se manifesta essencialmente nos adultos, bem como a forma pulmonar e mamária. O objetivo desde trabalho foi isolar e sequenciar cepas circulantes do vírus da CAE. Trinta e oito isolados de lentivírus caprino foram selecionados para o isolamento viral através de cocultivo de leucócitos. Destes, foram sequenciadas amostras nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte e Minas Gerais. Estas foram comparadas com outras já conhecidas depositadas no Genbank. As amostras circulantes apresentam elevada conservação nucleotídica, sendo 99,3% para o gene gag quando comparado com a cepa padrão CAEV-Cork e relativamente conservado, 70,1% para o gene pol, apresentando, portanto uma diversidade intragenotípica. Pela genealogia proposta com base nas sequências nucleotídicas dos genes gag e pol, a sua topologia mostrou-se compatível com os genótipos do subtipo B de CAEV. O alinhamento das sequências de aminoácidos da região gag, que correspondem à proteína p28 do capsídeo, indicou divergências entre as linhagens deste estudo com a cepa padrão CAEV-Cork. Palavras-chave: Filogenia, CAEV.

103 103 Caracterização Molecular de Lentivírus de Pequenos Ruminantes Isolados de Caprinos no Brasil baseados na análise das sequências dos genes gag e pol 1 Aryana Lushese Vasconcelos Lima Feitosa; 2 Maria Fátima da Silva Teixeira; 3 Raymundo Rizaldo Pinheiro; 3 Alice Andrioli Pinheiro, 4 Dalva Alana Aragão de Azevedo; 5 Paulo Eduardo Brandão, 5 Fábio Gregori, 5 Alessandra Marnie Martins Gomes de Castro, 5 Sheila Oliveira de Souza Silva 1 Autor correspondente: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE, Av. Paranjana 1700, , Fortaleza, CE, Brasil, Tel.: ; Fax: aryanalima@yahoo.com.br 2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Laboratório de Virologia, Universidade Estadual do Ceará UECE, Pesquisador de Produtividade em Pesquisa CNPq, 3 Embrapa Caprinos e Ovinos, Laboratório de Virologia; 4 Iniciação Científica CNPq/PIBIC e FUNCAP, Universidade Estadual Vale do Acaraú UVA. 5 Laboratório Aplicado à Biologia Molecular e Sorologia LABMAS, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ-VPS, Universidade de São Paulo - USP

104 104 Abstract CAE is a disease caused by caprine arthritis encephalitis virus (CAEV), a retrovirus belonging to the family Retroviridae, subfamily Lentivirinae, and gender Lentivirus. It affects lentiviruses and goats of all breeds, ages and sex. The neurological symptoms, ie, encephalitis occurs in young goats, which leads to secondary ataxia and paresis. The articular symptomatology is the most common and it affects adults mainly, as well as pulmonary and mammary forms. The disease causes huge economic losses, such as decreased milk production and lactation, weight loss caused by limited mobility, reduced birth weight, growth rate and death, leading to the slaughter of infected animals. The aim of the present study was to isolate and sequence circulating strains of CAEV. Thirty-eight isolates of goat lentivirus were selected for virus isolation by cocultivation of leukocytes. These samples were sequenced in the states of Ceara, Rio Grande do Norte and Minas Gerais. These were compared with other known sequences deposited in Genbank. The samples show high circulating nucleotide conservation of 99.3% for the gag gene as compared to the standard strain CAEV-Cork and is relatively conservative, 70.1%, for the pol gene, showing an intragenotype diversity. Through the proposed genealogy based on the nucleotide sequences of gag and pol genes, their topology was compatible with the genotypes of subtype B of CAEV. Alignment of the amino acid sequences of the gag region, corresponding to the p28 capsid protein, indicated differences between strains of this study with the standard strain CAEV-Cork. This divergence of amino acids was even more pronounced when compared to the amino acid sequences of the pol gene, which codifies for dutpase and integrase proteins. These differences are important for a better understanding of the condition and diversity of these described sequences. Key-words: Phylogeny, CAEV, gene pol, gene gag

105 Introdução O virus da artrite encefalite caprina (CAEV) e o virus Maedi-visna (MVV) são membros do grupo de Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPRs), pertencem à família Retroviridae, infectando caprinos e ovinos mundialmente (Pasick, J. 1998; Pepin et al., 1998). Os Lentivírus de espécies de animais diferentes têm em comum sua organização genética, a indução de doenças de forma progressiva e lenta e um amplo espectro de órgãos-alvo, sinais, sintomas e a capacidade de persistir em seus hospedeiros apesar da forte resposta imunológica. A transmissão dos LVPRs ocorre principalmente pela ingestão de leite ou colostro infectado, mas, pelo menos em ovinos, a transmissão horizontal pode ter um papel importante (Rowe J. e East N., 1997; Narayan O. et al., 1985). Os sinais clínicos causados pela infecção por LVPRs incluem desordens neurológicas, dispnéia, emaciação, mastite e artrite (Pepin M. et al., 1998; Narayan O. et al., 1989; Alvarez V. et al., 2006). A organização genômica de LVPRs é típica de lentivírus: dímeros de RNA de senso positivo com aproximadamente 9 kb de tamanho que consiste de duas LTRs (sequências longas repetidas) nas extremidades e flanqueando genes gag, que codificam as proteínas estruturais e são responsáveis por um grupo de antígenos específicos (Pépin et al., 1998): pol (polimerase) que codifica as proteínas de atividade enzimática; env (envelope), que codifica as glicoproteínas de superfície (SU) e proteínas estruturais transmembranárias (TM) do envelope viral, além de pequenos ORFs, que codificam proteínas que regulam a expressão gênica (Clements e Payne 1994). Os genes gag e pol são relativamente bem conservados entre os LVPRs e por isso estes genes são alvos ideais para desenhos de primers para PCRs (Pépin M., el al., 1998).

106 106 Originalmente, CAEV e MVV são linhagens protótipas e foram vistas como espécies virais distintas restritas aos seus respectivos hospedeiros, ou seja, vírus isolados de ovinos estão relacionados ao MVV e vírus isolados de caprinos relacionados com CAEV. Porém nas últimas duas décadas, com mais sequências disponíveis em bancos de dados genéticos, tornou-se evidente que os lentivírus de pequenos ruminantes podem atravessar a barreira entre espécies com vírus caprino infectando ovino e viceversa, uma vez que algumas cepas de caprino e ovino compartilham o mesmo cluster nas árvores filogenéticas. Apesar do fato dos lentivírus circularem e causarem doenças em caprinos e ovinos no Brasil há mais de quatro décadas, poucas sequências para caracterização molecular das linhagens de vírus circulantes no país foram obtidas. O objetivo deste estudo foi caracterizar molecularmente sequências parcias do gene gag e pol isolados de caprinos naturalmente infectados em três estados brasileiros. Material e Métodos Animais e IDGA Caprinos infectados naturalmente, de diferentes raças, idades e sexo, dos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Norte e Ceará, Brasil, foram testados pelo IDGA para o vírus da artrite encefalite caprina utilizando o kit de detecção de anticorpos contra a proteína Gag do capsídeo (Caprine Arthritis-Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology,Inc - USA). A sensibilidade do teste foi de 65.6% e a especificidade foi de 94.1%. Os animais positivos no IDGA para CAEV foram confirmados por Western Blotting (WB), segundo a metodologia de Pinheiro (2001).

107 107 Isolamento de leucócitos do Sangue Periférico Foram escolhidos 38 animais positivos para ambos os testes, IDGA e WB. Leucócitos do sangue periférico (LSP) foram isolados do sangue por centrifugação a 1500 rpm por 10 min. Os eritrócitos foram hemolizados por choque osmótico e o pellet, contendo as células, foram usados no cocultivo de células da membrana sinovial caprina (MSC). Cocultivo Explantes das membranas sinoviais caprinas das articulações intercarpais de membros anteriores de cabritos livres de CAEV foram cultivados em Meio Essencial Mínimo (MEM-G), acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), incubadas a 37 o C em atmosfera de 5% de CO 2 (Abreu et al., 1998) em garrafas de cultura celular A25. O meio foi trocado a cada horas até a monocamada obter 90% de confluência. Monócitos/Macrófagos (200 ml) coletados foram inoculados em monocamadas préformadas em garrafas A25 (capacidade 25 cm 2 ) e incubados durante 60 minutos em estufa 37 o C a 5% de CO 2 acrescidos de 1 ml de meio essencial mínimo (MEM) sem soro fetal bovino (SFB) (Sigma ; BDV Free). Após o período de incubação foram adicionados 3,5 ml de MEM com 10% de soro fetal bovino. O meio foi trocado a cada sete dias e a passagem foi realizada a cada 21 dias, com adição de 200 L de células da MSC a cada troca de meio ou passagem. A monocamada foi examinada diariamente em microscópio invertido para verificação de efeito citopático viral (ECP), formação de sincícios, fusão nuclear ou vacuolização. Após 50 dias de cocultivo, foi realizada a coloração da monocamada com cristal de

108 108 violeta a 0,1% para visualização do ECP. As garrafas de cultura contendo as células infectadas pelo vírus foram congeladas a -80 o C. Extração de DNA A extração de DNA foi realizada a partir de sobrenadante de cocultivo de macrófagos/monócitos em MSC (200 L) utilizando 600 ul de tiocianato de guanidina acrescido de fenol ph 7,5. A suspensão foi homogeneizada em vórtex por 15 segundos e adicionado 100 L de clorofórmio, seguido de homogeneização em vórtex e centrifugação a g por 5 minutos a 4 o C. O sobrenadante (400 L) foi transferido para um outro tudo eppendorf contendo 600 L de propanol, novamente homogeneizado em vórtex por 15 segundos e acondicionada em freezer a -20 o C por duas horas. Após essa etapa, a suspensão foi centrifugada a g por minutos a 4 o C e descartado o sobrenadante. Ao pellet foi adicionado 500 L de etanol a 70% e homogeneizado em vórtex por 15 segundos e centrifugação sob as mesmas condições supracitadas. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi seco por 15 minutos em termobloco. Este último foi ressuspendido em 30 L de TE (Tris 10 mm/ EDTA 1 mm ph 8,0), incubado a 56 o C por 15 minutos, seguidos de homogeneização e spin (Adaptado de Chomczynski, 1993).

109 109 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A reação de amplificação (PCR) foi realizada para detectar um fragmento de 620 pb do DNA proviral, correspondente ao fragmento parcial do gene gag, e de aproximadamente 472 pb do gene pol do genoma de CAEV. Os primers utilizados na PCR para ambos os genes estão expostos na Tabela 1. Tabela 1 - Sequências de primers utilizados nas reações de PCR e seus respectivos tamanhos de fragmentos amplificados Gene Primers Sequências Tamanhos dos fragmentos (bp) gag Tvet-1 (senso) Tvet-2 (antissenso) pol Pol 1 (senso) Pol 2 (antissenso) 5 AGC TGG AAA GCA GTA GAT TC 3 5 GAA CCC TTC TGA TCC CAC ATC 3 5 ACA GAA GAG AAA TTA AAAGG-3 5 CAT CCA TAT ATA TGC CAA ATT G Referências Dantas et al., (2009) 472 Leroux et al., (1997) As reações de PCR foram realização em um volume final de 50 L. Estas consistiram de 20 pmol para cada primer, 100 M de dntps, 1,5 mm de MgCl 2, 1X de PCR buffer, 2 U de DNA polimerase Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 10 L de DNA extraído. As condições utilizadas na amplificação pela PCR foram de 94 o C por 5 min, 40 ciclos de 94 o C por 1min, 53 o C por 45 s e 72 oc por 1min, seguidos de uma extensão final de 72 o C por 8 min.

110 110 Detecção do amplicon Os fragmentos amplificados pela PCR foram analisados em eletroforese em cuba horizontal. Uma alíquota de 10 L de cada amostra foi disposta em gel de agarose a 1,5% previamente imerso em tampão TBE (0,045 M Tris-Borato; 1 mm EDTA). Após a corrida eletroforética, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (0,5 g/ ml) por 20 minutos. As bandas foram visualizadas em transiluminador com luz ultravioleta de 260 nm. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram comparados ao padrão de peso molecular de 100 pb (ladder). Purificação e Quantificação do amplicon As bandas de interesse foram cortadas e purificadas utilizando o kit GFX TM (Amersham Biosciences) de acordo com as indicações do fabricante. No caso de bandas únicas, foi utilizado o reagente de purificação Exo SAP-IT TM (GE Healthcare Life Sciences) também de acordo com as instruções do fabricante. A concentração do DNA amplificado presente nas amostras purificadas foi determinada por densidade óptica em espectrofotômetro (Thermo Scientific Nanodrop 2000) utilizando 2 L do purificado. Reação de Sequenciamento Para a reação de sequenciamento empregou-se o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer). As quantidades de reagentes foram determinadas a partir da concentração de DNA purificado. Para uma reação de 10 L de

111 111 volume final, foram utilizados 2 L de BigDye TM v (Applied Biosystems), 2 L de tampão Save Money 5X (200 mm Tris-HCl; 5 mm MgCl 2 ; ph 9,0), 10 pmoles de primer (senso ou antissenso) e 28 ng de DNA purificado. Em amostras com concentração abaixo de 12 ng/ L, o volume final da reação foi dobrado, assim como as concentrações dos reagentes, exceto a do BigDye e do primer utilizado. Precipitação do produto amplificado Após a reação de sequenciamento, os produtos foram purificados por precipitação em álcool. A cada amostra foi utilizado 32,5 L ou 65 L do mix (Etanol 100%; EDTA 125 mm) para as reações de volumes finais de 10 L e 20 L, respectivamente. Após homogeneização, as amostras foram mantidas ao abrigo da luz por 30 min, e em seguida, centrifugadas a g por 30 min a 4 o C. Descartou-se o sobrenadante por inversão de tubos e o sedimento foi lavado com 30 L ou 60 L de etanol a 70%. Procedeu-se nova centrifugação a g por 20 min. O excesso de etanol foi desprezado por inversão total dos tubos, sendo sua total remoção conduzida em termobloco a 95 o C por 10 min. As amostras foram mantidas a -20 o C até sua utilização no sequenciamento. Sequenciamento As amostras foram homogeneizadas em 3,4 L de formamida e Blue Dextran- EDTA (Applied Biosystems, USA) na porção de 5:1, desnaturadas a 95 o C por 3 min e colocadas no gelo por 2 minutos. Posteriormente, foram submetidas à eletroforese em sequenciador automático modelo ABI Prism TM 377 DNA Sequencers (Applied

112 112 Biosystems, USA). As condições da reação de sequenciamento consistiram de desnaturação inicial a 96 o C por 1 min e 40 ciclos de 96 o C por 15 s, 50 o C por 15 s e 60 o C por 4 min. Edição e Análise das sequências As sequências de nucleotídeos foram analisadas e editadas com o auxílio do programa Phred online ( O programa BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999) foi usado para preparar a versão final das sequências consensos. Todas as posições com códigos ambíguos ou gaps nos alinhamentos foram excluídas nas análises. O pareamento das distâncias genéticas foi calculado pelo programa MEGA 5.03 (Tamura et al., 2011) com o modelo de substituição Tamura-Nei (NJ). Filogenia A árvore filogenética foi determinada usando o método de Neighbor Joining (NJ) (Saitou e Nei, 1987) implementado no programa MEGA 5.03 com análise das distâncias Tamura-Nei (Tamura-Nei, 1993). As sequências resultantes foram comparadas com sequências homólogas disponíveis no GenBank (Tabela 2). Tabela 2 - Sequências de nucleotídeos analisados neste estudo. Linhagem do vírus Número de acesso no Referência Genbank CAEV-Cork M33677 Saltarelli et al., 1990 FESC-752 HM Ramirez et al., não publicado Volterra JF Bertolotti et al., 2011 Fonni JF Bertolotti et al., 2011 Seui GQ Reina et al., 2010 MVV - K1514 M60609 Sonigo et al., 1985

113 113 MVVEV-1 S51392 Sargan et al., 1991 SA-OMVV M31646 Querat et al., 1990 P1OLV AF Barros et al., 2004 Demais amostras - Deste estudo Resultados Trinta e oito animais de três estados brasileiros, de diferentes rebanhos, positivos para os testes de IDGA e WB foram escolhidos para o isolamento viral através de cocultivo em MSC, até o aparecimento do efeito citopático (ECP). Um fragmento de aproximadamente 620 e 472 nucleotídeos foi amplificado para o gene gag e pol, respectivamente. Amplificação dos genes gag e pol através da PCR Das 38 amostras de LVPRs isoladas pelo cocultivo, foi possível amplificar o fragmento parcial de 620 nt para o gene gag em 18 delas (18/38 ou 47,4%) e para o gene pol foi possível detectar um fragmento de 472 nt em 17 das 38 amostras, correspondendo a 44,7%. Reação de sequenciamento nucleotídico para os genes gag e pol A partir das 18 amostras amplificadas do gene gag, submetidas à reação de sequenciamento de nucleotídeos, foi possível definir a sequência parcial de 10 amplificados para o gene gag (69LVCE, 137CE, 229CE, 2361CE, 3596CE, 6900CE, Animal02CE, Pan5CE, Pan7CE, Pan12CE) (anexo 1). Das 17 amostras amplificadas do

114 114 gene pol, foi possível determinar a sequência parcial de nucleotídeos através de sequenciamento de 16 amplificados, (69LVCE, 137CE, 229CE, 2361CE, 3596CE, 237CE, 6900CE, Animal02CE, Pan5CE, Pan7CE, 1604MG, 1625MG, 2239CE, SQSBCE, 31RN, 32CE) (anexo 2). A identificação das amostras e tamanho do fragmento sequenciado encontra-se na Tabela 3. Tabela 3 Relação da origem das amostras e tamanho do fragmento dos respectivos genes sequenciados. Amostra Origem Fragmento Sequenciado Gene gag Fragmento Sequenciado Gene pol 69LVCE Ceará 620 nt 472 nt 137CE Ceará 620 nt 472 nt 229CE Ceará 620 nt 472 nt 2361CE Ceará 620 nt 472 nt 3596CE Ceará 620 nt 472 nt 237CE Ceará nt 6900CE Ceará 620 nt 472 nt Animal02CE Ceará 620 nt 472 nt Pan5CE Ceará 620 nt 472 nt Pan7CE Ceará 620 nt 472 nt Pan12CE Ceará 620 nt MG Minas Gerais nt 1625MG Minas Gerais nt 2239CE Ceará nt SQSBCE Ceará nt 31RN Rio Grande do Norte nt 32CE Ceará nt Gene gag Alinhamento das sequências geradas Todas as linhagens deste estudo apresentaram transição de uma guanina por uma adenina na posição 328, de uma citosina para uma timina na posição 401 e 410 e uma transversão de uma timina para uma adenina na posição 420, resultando na mudança de aminoácidos: valina (apolar) para isoleucina (apolar); treonina (polar neutro) para

115 115 metionina (apolar); prolina (apolar) para serina (polar neutro); ácido aspártico (polar ácido) para ácido glutâmico (polar ácido), respectivamente. Além dessas mudanças, na cepa 229CE ocorreu a troca de alanina (apolar) para um ácido aspártico (polar ácido) na posição 164. E na cepa Pan12CE houve mudança de uma prolina (apolar) para uma histidina (polar básico) na posição 157 e de uma glicina (apolar) para uma arginina (polar básico) na posição 180, tomando como referência a cepa padrão CAEV-Cork (Figuras 2 e 3). A matriz de identidade (Tabela 4), com os cálulos das distâncias dos pareamentos, foi obtida comparando as sequências de nucleotídeos das cepas deste estudo com outras já conhecidas. Os valores próximos a zero revelam maior similaridade entre as sequências.

116 116 Figura 2. Alinhamento do fragmento parcial de 620 nucleotídeos do gene codificador da proteína p28 do capsídeo gerados no presente estudo comparadas com sequências padrões depositadas no Genbank.

117 117 Figura 3. Alinhamento das sequências de aminoácidos do gene gag correspondente à proteína p28 do capsídeo. Tabela 4. Matriz de identidade com os valores de similaridade nucleotídica do fragmento parcial do gene gag comparadas com as demais cepas depositadas do Genbank.

118 118 Inferêcia filogenética a partir das sequências nucleotídicas Gene gag A análise filogenética revelou que as cepas deste estudo formaram um grupo altamente relacionado com o grupo de CAEV-Cork. A árvore filogenética (Figura 4) foi obtida usando o método de NJ com sequências nucleotídicas do gene gag e mostrou a relação das cepas deste estudo com outras já conhecidas. Os valores de bootstrap derivados de 100 repetições indicam confiança no padrão de ramificação dos respectivos ramos da árvore. Todos os parâmetros das análises foram padrões. MVV está claramente separado do grupo de CAEV. Figura 4. Árvore filogenética do gene gag diferenciando os grupos de CAEV e MVV.

119 119 Gene pol Alinhamento das sequências de aminoácidos Gene pol Todas as linhagens deste estudo apresentaram transição e/ou tranversão em diferentes posições das sequências, resultando na mudança de aminoácidos para outros de grupos diferentes, tomando como referência a cepa padrão CAEV-Cork (Figura 5 e 6). A matriz de identidade (Tabela 5), com os cálculos das distâncias dos pareamentos, foi obtida comparando as sequências de nucleotídeos das cepas deste estudo com outras já conhecidas. Os valores próximos a um revelam maior similaridade entre as sequências.

120 120

121 Figura 5 - Alinhamento do fragmento parcial de 472 nucleotídeos do gene pol gerados no presente estudo comparadas com sequências padrões depositadas no Genbank. 121

122 122 Figura 6. Alinhamento das sequências de aminoácidos do gene pol correspondente a 160 aminoácidos referente à região intergênica de dutpase e integrase. Tabela 5. Matriz de identidade com os valores de similaridade nucleotídica do fragmento parcial do gene pol comparadas com as demais cepas depositadas do Genbank.

123 123 Inferêcia filogenética a partir das sequências nucleotídicas Gene pol A análise filogenética revelou que as cepas deste estudo formaram um grupo estreitamente relacionado com o grupo de CAEV-Cork. A árvore filogenética (Figura 7) foi obtida usando o método de NJ com sequências nucleotídicas do gene pol e mostrou a relação das cepas deste estudo com outras já conhecidas. Os valotes de bootstrap derivados de 100 repetições indicam confiança no padrão de ramificação dos respectivos ramos da árvore. Todos os parâmetros das análises foram padrões. Observase que as cepas de MVV estam claramente separados das demais de CAEV. Porém as cepas 31RN e 32CE apresentaram ramificações distintas divergindo para um cluster separado das demais amostras deste estudo.

124 Figura 7. Árvore filogenética do gene pol diferenciando os grupos de CAEV e MVV. 124

125 125 Discussão Trinta e oito animais infectados, de diferentes estados brasileiros, foram escolhidos para o isolamento viral por cocultivo de leucócitos. Destes, apenas 18 amostras amplificaram para o gene gag e 17 para o gene pol. Deve-se considerar que as amostras possuem diferentes concentrações virais e que a reação de PCR não contempla uma etapa de reamplificação ( nested PCR). Estes fatos em conjunto podem ter conferido um maior limiar de detecção, levando a uma perda de sensibilidade diagnóstica. Finalmente, devido aos mecanismos de variabilidade genética dos lentivírus (shifts, drifts, rearranjos e recombinações) é possível que tenha havido falhas de hibridização dos primers. Nesse sentido, julga-se necessário o desenho de novos primers que contemplem a diversidade genética dos lentivírus. As amplificações foram submetidas ao sequenciamento de nucleotídeos. Foram obtidas 10 sequências viáveis para o gene gag e 16 sequências para o gene pol. Atribuise esta perda a fatores relacionados principalmente à quantidade de DNA presente na amostra e à purificação insatisfatória dos produtos submetidos à reação de sequenciamento. Outra hipótese para a perda de sequências seria a condição isotérmica na reação de sequenciamento, não favorendo o anelamento dos primers. Ao analizar o gene gag, foi observado, por eletroferograma, a presença de polimorfismo nas amostras 229CE e Pan12CE, pela visualização da sobreposição de bases (adenina e citosina) tanto na sequência senso quanto na antissenso. Da mesma forma, nas sequências do gene pol, foi observado a presença de polimorfismo na amostra Pan7CE, pela da visualização da sobreposição de bases (adenina e guanina) tanto na sequência senso quanto na antissenso, sugerindo que um mesmo animal pode

126 126 ter sido infectado por um vírus que sofreu mutações dentro do hospedeiro, corroborando com os achados de Ellis e colaboradores (1987) em que afirma que ambas as viroses têm a capacidade de apresentar variação antigênica significativa e que dentro do mesmo animal infectado pode existir mais de uma cepa viral ao mesmo tempo. Uma alternativa para este problema seria clonar e sequenciar novamente estas cepas para garantir a presença desse achado. Além disso, para o gene gag, foi observada em todas as cepas isoladas a presença de mutações pontuais de nucleotídeos, com a substituição de purina por outra purina e de purina por pirimidina e vice-versa, o que provocou a mudança de aminoácidos por outro do mesmo grupo ou por aminoácidos de grupos diferentes. O fragmento sequenciado corresponde à proteína do capsídeo p28 que tem influência na antigenicidade, podendo este fato, estar diretamente relacionado com a resposta imune do hospedeiro, embora esta seja ineficaz para prevenir a infecção viral, seu papel é de enorme importância no controle da intensidade da infecção até que o organismo comece a produzir elementos específicos de defesa, o que demanda entre cinco e sete dias. Os principais mecanismos da resposta imune natural consistem no bloqueio à infecção de novas células, inibição da replicação do vírus dentro das células e eliminação de células infectadas (MADRUGA et al., 2001). Sendo assim, essa proteína apresenta características que são importantes tanto para antigenicidade quanto para a patogenicidade desdes lentivírus (SHAH et al., 2004a), podendo ainda afetar sua persistência e o seu mecanismo de evasão. A heterogeneidade das sequências de nucleotídeos e aminoácidos da proteína p28 de lentivírus pode auxiliar no desenvolvimento de vacinas no combate ao agente. Além disso, poderá ajudar a compreender sua epidemiologia e relações filogenéticas. Para o gene pol foi também foi observado em todas as cepas isoladas a presença de mutações pontuais de nucleotídeos, com a presença de trasições e/ou transversões,

127 127 resultando mudança de aminoácidos por outro do mesmo grupo ou por aminoácidos de grupos diferentes. O fragmento sequenciado do gene pol corresponde às proteínas de atividade enzimática, e abrange uma região intergênica de dutpase e integrase. Estudos recentes relataram que deleções de nucleotídeos na porção que codifica para a dutpase afetam na fidelidade da transcriptase reversa em células em não-divisão (REINA et al., 2010). Portando, mutações na região que codificam para essas proteínas podem exercer um papel fundamental na regulação da replicação e transcrição viral. Entre as sequências geradas neste estudo frente às demais selecionadas no Genbank, mediante visualização do alinhamento nucleotídico da matriz de identidade, constatou-se que as amostras 69LV, 137CE, 2361CE, 3596CE, 6900CE, Animal02-5CE, Pan5CE e Pàn7CE tiveram 99,3% de semelhança com o CAEV enquanto a maior diferença observada foi de 70,1% entre as amostras Pan12CE e GQ para o gene gag. E que as amostras 69LV, 137CE, 229CE, 2239CE, 3596CE, 6900CE tiveram 99,7% de semelhança com CAEV-Cork enquanto a maior diferença observada foi de 77,4 entre as amostras Animal02-5CE e P1OLV para o gene pol. A árvore filogenética foi construída para cada gene separadamente. De forma geral, as árvores propostas guardaram correspondência com suas respectivas matriz de identidade e com as cepas de CAEV já publicadas. Observou-se que as amostras do gene gag agruparam-se no clado correspondente ao de CAEV, amparado com elevado valor de bootstrap (Figura 4). A árvore construída a partir de sequências pol mostrou que as amostras desse gene agruparam no mesmo clado de CAEV, porém as amostras 31RN e 32CE segreraram para um cluster isolado (Figura 7). Sendo assim, conclui-se que tanto pela topologia quanto pelos valores de identidade nucleotídica, as amostras geradas neste estudo pertencem ao subtipo B do grupo de CAEV. Através do estudo proteômico dos lentivírus, os testes de diagnóstico podem

128 128 tornar-se específicos para cada região. Devido à ampla distribuição destes vírus em certas regiões e às perdas econômicas resultantes, vários países têm adotado programas de erradicação com base na segregação dos vírus de caprinos e ovinos (GREENWOOD et al., 1995; HOUWERS et al., 1987; PERETZ et al., 1994; ROWE E EAST, 1997; SCHEER- CZECHOWSKI et al., 2000). Estudos na Finlândia, comparando o protótipo de CAEV com MVV, demonstraram uma inserção de sete aminoácidos ( ) na linhagem K1514 de MVV na região C-terminal da MA e uma deleção de dois aminoácidos (entre 283 e 284) na região N-terminal do CA. Uma comparação das sequências de lentivírus com algumas sequências encontradas em banco de dados genéticos revelou que em contraste com o CAEV, todos os protótipos de MVV contêm uma deleção de seis nucleotídeos na região do gene gag resultando na deleção de dois resíduos de aminoácidos na região central do capsídeo. Esta deleção pode ser utilizada como marcador na análise de LVPRs, especialmente quando se considerar uma possível transmissão de lentivírus entre caprinos e ovinos. Os autores verificaram que a similaridade entre as sequências de lentivírus caprino e ovino é maior na região N-terminal que na região C-terminal das proteínas analisadas do capsídeo. É interessante observar que a maior região de homologia é menos conservada que a região N-terminal do capsídeo, demonstrando diferenças entre LVPRs de ovinos e caprinos (RAVAZZOLO et al., 2001). Embora o domínio C-terminal das proteínas do capsídeo de lentivírus tenha sido crucial para a montagem dos vírus (FREED, 1998), dados indicam que a região N-terminal também pode ser importante para a montagem e liberação dos vírus (LI et al., 1997; WANG et al., 1998). O modelo baseado na estrutura de cristalografia da p26 (capsídeo) de lentivírus equino propõe que o domínio N-terminal inicia um papel essencial na maturação do

129 129 core (JIN et al., 1999). Um peptídeo de cinco aminoácidos LYPNL (Motif III), encontrado em todas as estirpes de MVV isoladas na Polônia, mas não nas estirpes padrão, pode ser utilizado como um marcador para distinguir estirpes de vírus (PISONI et al., 2006). Um segundo peptídeo KNLTPEESNKQDFMSL (Motif II), foi especificamente relacionado com a estirpe de CAEV. Em contraste, 6/16 mudanças de aminoácidos (Q TS - RE - A - -) foram específicas para todas as estirpes de MVV (KUZMAK et al., 2007). As mudanças similares de aminoácidos foram observadas em dois isolados italianos de ovinos, geograficamente distantes, anteriormente classificados no grupo de ovinos e genotipicamente como CAEV (GREGO et al., 2005). Esses peptídeos foram considerados como uma das principais regiões imunodominantes da matriz. Assim, ambos os peptídeos (Motif II e III), podem ser utilizados em testes de diagnóstico para distinguir infecção com os vírus MVV e CAEV. Isto seria importante para análise de lentivírus de ovinos e caprinos que vivem em rebanhos mistos e aqueles em contato direto, o que pode elucidar os acontecimentos da transmissão cruzada destes vírus após o salto da barreira entre espécies (KUZMAK, 2007). Em relação ao gene pol, A Uracila no DNA aparece como resultado da incorporação defeituosa ou desaminação da citosina (HARRIS et al., 2003). A enzima dutpase age diretamente sobre o conjunto de nucleotídeos prevenindo a incorporação defeituosa de resíduos de uracila no DNA viral após o processo de retrotranscrição, mantendo uma relação baixa de dutp: sttp (PRIET et al., 2003). A dutpase é codificada pelo gene pol e é uma proteína associada ao vírion presente em lentivírus de não-primatas como (EIAV e CAEV) (CHEN et al., 2002), não sendo encontrado em nenhum dos lentivírus de primatas (HIV, SIV). A expressão de dutpase celular é rica em células indiferenciadas em divisão e pobre em células diferenciadas em não-divisão

130 130 (MILLER et al., 2000). Além disso, a replicação de dutpase-negativas de CAEV em células em não-divisão (p.e. macrófagos) leva a uma redução da carga viral 10 a 100 vezes mais em comparação com o vírus do tipo selvagem. Experimentos in vivo mostraram que cepas dutpase-negativas produzem lesões menos graves (TURELLI et al., 1997). A deleção artificial dos genes dutpase em CAEV-Co resultou na replicação viral tardia, acumulação de mutações pontuais de G por A e decréscimo da carga viral (HARMACHE et al., 1996; TURELLI et al., 1997). Conclusão Trinta e oito animais de amostras circulantes de lentivírus caprino foram selecionados para o isolamento viral por cocultivo de leucócitos. Destas, 18 amostras amplificaram para o gene gag e 17 para o gene pol. A partir das 18 amostras amplificadas do gene gag, submetidas à reação de sequenciamento de nucleotídeos, foi possível definir a sequência parcial de 10 amplificados. Das 17 amostras amplificadas do gene pol, foi possível determinar a sequência parcial de nucleotídeos através de sequenciamento de 16 amplificados. Foram sequenciadas amostras nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte e Minas Gerais. Estas foram comparadas com outras já conhecidas depositadas no Genbank. As amostras circulantes apresentam elevada conservação nucleotídica sendo 99,3% para o gene gag quando comprado com a cepa padrão CAEV-Cork e relativamente conservado, 70,1% para o gene pol, apresentando, portanto uma diversidade intragenotípica. Pela genealogia proposta com base nas sequências nucleotídicas dos genes gag e pol, a sua topologia mostrou-se compatível com os genótipos do subtipo B de CAEV.

131 131 Agradecimentos UECE, EMBRAPA Caprinos e Ovinos, FUNCAP, CNPq e Banco do Nordeste pelo apoio financeiro para realização deste projeto.

132 132 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Almeida, M. G. A. R.; Anunciação, A. V. M.; Figueredo, A.; Martinez, T. C. N.; Laborda, S. S. Dados sorológicos sobre a presença e distribuição da Artrite - Encefalite Caprina (CAE) no estado da Bahia, Brasil. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 1, n. 3, p , Alvarez, V., Daltabuit-Test, M., Arranz, J., Leginagoikoa, I., Juste, R.A., Amorena, B., De Andres, D., Lujan, L.L., Badiola, J.J., Barriatua, E. PCR detection of colostrum-associated Maedi Visna virus (MVV) infection and relationship with ELISA-antibody status in lambs. Research in Veterinary Science. v. 80, p , Alves, F.S.F. & Pinheiro, R.R.. Presença de artrite-encefalite caprina a vírus (CAEV) no Estado do Maranhão. In: XXV Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, Gramado, p.278. (Resumo) Assis, A. P. M. V.; Gouveia, A. M. G. Evidência sorológica de Lentivírus (Maedi Visna/Atrite-encefalite caprina) em rebanhos nos Estados de MG, RJ, BA e CE. In: 94 Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, XXIII, 1994, Recife. Anais. SPMV. p Bandeira, D. A., De Castro, R. S., Azevedo, E. O., De Souza Seixas Melo, L. & De Melo, C. B. Seroprevalence of caprine arthritis-encephalitis virus in goats in the Cariri region, Paraiba state, Brazil. Veterinary Journal v. 180, p Barquero, N., Arjona, a, Domenech, a, Toural, C., de las Heras, a, Fernández- Garayzabal, J. F., Ruiz-Santa Quiteria, J. a, et al. Diagnostic performance of PCR and ELISA on blood and milk samples and serological survey for small ruminant lentiviruses in central Spain. The Veterinary record, 168(1), 20. doi: /vr.c Barros, S.C., Ramos, F., Duarte, M., Fagulha, T., Cruz, B., Fevereiro. Genomic characterization of a slow/low Maedi visna virus. Vírus Genes 29, Batista, M. C. S.; De Castro, R. S.; Carvalho, F. A. A.; Cruz, M. S. P.; Silva, S. M. M. S.; Rego, E. W.; Lopes, J. B. Anticorpos anti-lentivírus de pequenos ruminantes em caprinos integrantes de nove municípios Piauienses. Ciência Veterinária nos Trópicos, v.7, n 2 e 3, p , Batista, M. C. S.; De Castro, R. S.; Carvalho, F. A. A.; Cruz, M. S. P.; Silva, S. M. M. S.; Rego, E. W.; Lopes, J. B. Anticorpos anti-lentivírus de pequenos ruminantes em caprinos integrantes de nove municípios Piauienses. Ciência Brasileira de Medicina Veterinária, v. 17, n. 2, p , Bertolotti L, Mazzei M, Puggioni G, Carrozza M. L, Dei Giudici S, Muz D, Juganaru M, Patta C, Tolari F, Rosati S. Characterization of new small ruminant lentivirus subtype B3 suggests animal trade within the Mediterranean Basin. Journal of General Virology. v. 92, n. 8, p

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138 138 CONCLUSÕES GERAIS Foram isoladas cepas virais circulantes de animais naturalmente infectados nos estados do Rio Grande do Norte, Ceará, Piauí, Bahia e Minas Gerais. A cepa isolada, denominada BrRN-CNPC.G1 foi considerada o primeiro isolamento do CAEV no Estado do Rio Grande do Norte. Todas as cepas isoladas mostraram-se ser fenotipicamente líticas, do tipo rápido/alto. Foram amplificadas e sequenciadas cepas virais isoladas do Ceará e Minas Gerais e Rio Grande do Norte, tanto para o gene gag quanto para o gene pol. Não foi possível obter amplificação por PCR dos isolados do Piauí e Bahia com a finalidade de sequenciar. Os alinhamentos das sequências Capítulo III (EU300976, EU300977, EU e EU300979) com outras já disponíveis em bancos de dados genéticos revelaram que estas linhagens estão mais relacionadas com CAEV que MVV. A classificação mostrou que estas pertecem ao subtipo B1 do grupo de CAEV. As demais amostras circulantes (Capítulo IV) apresentaram elevada conservação nucleotídica sendo 99,3% para o gene gag quando comprado com a cepa padrão CAEV-Cork e relativamente conservado, 70,1% para o gene pol, apresentando, portanto uma diversidade intragenotípica. Pela genealogia proposta com base nas sequências nucleotídicas dos genes gag e pol, a sua topologia mostrou-se compatível com os genótipos do subtipo B de CAEV. O alinhamento das sequências de aminoácidos da região gag indicaram

139 139 divergências entre as linhagens deste estudo com a cepa padrão CAEV-Cork. Essa divergência de aminoácidos foi ainda mais acentuada quando comparas sequências de aminoácidos do gene pol. Não foram obtidas sequências viavéis em nenhuma das amostras isoladas para o gene env.

140 140 PERSPECTIVAS DA TESE Estabelecer programas de erradicação de acordo com a distribuição das linhagens de LVPR poderá fundamentar o desenvolvimento de reagentes para diagnóstico de maior especificidade e sensibilidade do que os atualmente disponíveis no mercado em rebanhos locais. A aplicação da análise filogenética para sequências de CAEV e MVV é de imensa importância para este tipo de análise epidemiológica de infecções por lentivírus de pequenos ruminantes e também para estudar as potenciais diferenças de virulência entre linhagens de LVPR circulantes, ajudando a entender as propriedades genéticas, protéicas e antigênicas desses vírus, sua patogênese, epidemiologia e relacionamento filogenético e poderão ainda ser estudados possíveis antígenos vacinais.

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160 160 TORRES-ACOSTA, J.F.J., GUTIERREZ-RUIZ, E.J., BUTLER, V., SCHMIDT, A., EVANS, J., BABINGTON, J., BEARMAN, K., FORDHAM, T., BROWNLIE, T., SCHROER, S., CÁMARA, G.E., BUTLER, V. Serological survey of caprine arthritisencephalitis virus in 83 goat herds of Yucatan, Mexico. Small Ruminant Research. v. 49, p TORSTEINSDOTTIR, S., MATTHIASDOTTIR, S., VIDARSDOTTIR, N., SUASSON, V., PÉTURSSON, S. Intratracheal inoculation as na efficient croute of experimental infection with Maedi visna virus. Research Veterinary Science. v.75, p , TURELLI, P., GUIGUEN, F., MORNEX, J.F., VIGNE, R., QUERAT, G. dutpaseminus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. Journal of virology. v. 71, n. 6, p VALAS, S., GERMAIN, K. Distribution and heterogeneity of small ruminant lentivirus envelope subtypes in naturally infected French sheep. Virus Research. v. 120, p , VALAS, S., BENOIT, C., BAUDRY, C., PERRIN, G., MAMOUN, R.Z. Variability and immunogenicity of caprine arthritis-encephalitis virus surface glycoprotein. Journal of virology. v. 74, p , VALAS, S., BENOIT, C., GUIONAUD, C., PERRIN, G., MAMOUN, R.Z. North American and French caprine arthritis-encephalitis viruses emerge from ovine Maedivisna viruses. Virology. v. 237, p , VAREA, R.; MONLEON, E.; PACHECO, C.; LUJAN, L.; BOLEA, R.; VARGAS, M. A.; VAN EYNDE, G.; SAMAN, E.; DICKSON, L.; HARKISS, G.; AMORENA, B.; BADIOLA, J. J. Early detection of maedi-visna (ovine progressive pneumonia) virus seroconversion in field sheep samples. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 13, n.4, p , VERWOERD, D. W.; PAYNE, A. L.; YORK D. F.; MYER, M. S. Isolation and preliminary characterization of the Jaagsiekte retrovirus (JSRV). Onderstepoort Journal Veterinary Research, v.50, p , VITU, C.; RUSSO, P.; VIGNE, R.; QUERAT, G.; GIAUFFRET, A. An ELISA Test For Detection Of Maedi- Visna antibodies. Comparative study with Gel Immunodiffusion na complement fixation test. Comparative Immunology and Microbiology Infectious Disease. v.4, n.5, p , WAGTER, L.H.A., JANSEN, A., BLEUMINK-PLUYM, J.A., LENSTRA, J.A., HOUWERS, D.J. PCR detection of lentiviral gag segment DNA in the white blood cells of sheep and goats. Veterinary Research Communications., v.22, p , WANG, C., LAI, H., LI, J. Analysis of minimal human immunodeficiency virus type 1 gag coding sequences capable of virus-like particle assembly and release. Journal of virology. v. 72, p , 1998.

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162 162 ANEXOS Capítulo I

163 163 Capítulo III Anexo 2. Primeira página do artigo publicado Capítulo III

164 164 Capítulo IV Anexo 3. As sequências nucleotídicas parciais do gene gag de LVPRs geradas no presente estudo encontram-se relacionadas abaixo: >69LVCE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >137CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT

165 165 ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >229CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGATAACACTATCTTATACAA ATGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGA GTACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGG ATCAGAAGGGT >2361CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT

166 166 >3596CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >6900CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >Animal02CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA

167 167 AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >Pan5CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >Pan7CE GATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC

168 168 AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAAA TGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGT ACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGAT CAGAAGGGT >Pan12CE GATTGTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC GTGTCTGAGGACTTTGAAAGGCAGTTGGCATATTATGCTACTACCTGGACAA GTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAA AGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGG AATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATG GGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGC AAGGCAAATATGCCTGCAATGGATAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACA TATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAATGAATG AGTCATATGAAGAATTTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGC CAGTTACACAGCATATAAAAGATTATCTAAAGCTAACACTATCTTATACAA ATGCATCAGCAGATTGTCAGAAGCAAATCGATAGAACACTAGGACAAAGA GTACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGG ATCAGAAGGGT

169 169 Anexo 4. As sequências nucleotídicas parciais do gene pol de LVPRs geradas no presente estudo encontram-se relacionadas abaixo: >31RN AAATTAAAAGGACTGACAGAAATAATAGATAAATTAGTGGAAGAAGGAAA ACTAGGAAAAGCACCTCCACATTGGACATGTAATACTCCAATATTTTGCATA AAAAAGAAGTCAGGAAAGTGGAGGATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAAT AAACAAACAGAGGATTTAACAGAGGCACAGTTAGGACTTCCACATCCTGGG GGCCTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATAT TTCACTATACCCTTGTATGAACCCTATAGAGAGTACACATGTTTTACTCTATT AAGTCCTAATAATTTGGGACCATGTAAAAGATATTATTGGAAAGTGCTGCC ACAAGGGTGGAAGCTGAGTCCTTCTGTATATCAATTTACTATGCAAGAAATT TTAGAGGATTGGATACAGCAACATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATATG GATG >32CE AAATTAAAAGGACTGACAGAAATAATAGATAAATTAGTGGAAGAAGGAAA ACTAGGAAAAGCACCTCCACATTGGACATGTAATACTCCAATATTTTGCATA AAAAAGAAGTCAGGAAAGTGGAGGATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAAT AAACAAACAGAGGATTTAACAGAGGCACAGTTAGGACTTCCACATCCTGGG GGCCTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTAGACATAGGAGATGCATAT TTCACTATACCCTTGTATGAACCCTATAGAGAGTACACATGTTTTACTCTATT AAGTCCTAATAATTTGGGACCATGTAAAAGATATTATTGGAAAGTGCTGCC ACAAGGGTGGAAGCTGAGTCCTTCTGTATATCAATTTACTATGCAAGAAATT TTAGAGGATTGGATACAGCAACATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATATG GATG >69LVCE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA

170 170 TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >137CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >229CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG

171 171 >237CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAATTACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >1604MG AAATTAAAAGGCCTAACAGAAATAATAGATAAATTAGTAGAAGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCTCCGCATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AGAAAGAAATCAGGGAAATGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCAAATAACTTGGGACCATGTAAAAGATACTTTTGGAAAGTTTTGCC TCAGGGTTGGAAACTGAGTCCATCTGTATATCAATTCACCATGCAGGAAATT TTGGAAGATTGGATAAAACAACATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATATG GATG >1625MG AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT

172 172 CGTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >2239CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >2361CE GAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA TACAAAGAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAAT AAACAAACAGAGGATTTAACAGAGGCACAGTTAGGACTTCCACATCCTGGG GGCCTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATAT TTCACTATACCCTTGTATGAACCCTATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTATT AAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGCC ACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGATC TTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATATG GATG >3596CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT

173 173 TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >6900CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >Animal02CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAGGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATAGAACATAGGAGATGCAT ATTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCT ATTAAGGCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAATGCT GCCACAAGGCTGGAAAGTGAGTCCATCGGCATATCAATTTACTATGCAGGA GATCTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATA TATGGATG >Pan5CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAGGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG

174 174 AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGAACATAGGAGATGCAT ATTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCT ATTAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGAT GCCACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAG ATCTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATAT ATGGATG >Pan7CE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAGGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG >SQSBCE AAATTAAAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAGGAAGGAAA ACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATA AAAAAGAAATCAGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAA CAAACAGACAGAAGATTTAACAGAGGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGG AGGACTACAAAAGAAAAAACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATA TTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTAT TAAGTCCTAATAATCTAGGACCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGC CACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGAT CTTAGAGGATTGGATACAGCAGCATCCAGAAATTCAATTTGGCATATATAT GGATG

175 Anexo 5.Certificado de Bioética referente ao Capítulo I 175