AVALIAÇÃO DO EFEITO DO LÍQUIDO OBTIDO DA CASTANHA DE CAJU (Anacardium occidentale L.) (LCC) SOBRE Leishmania amazonenses E CÉLULAS DE MAMÍFEROS.

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1 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO LÍQUIDO OBTIDO DA CASTANHA DE CAJU (Anacardium occidentale L.) (LCC) SOBRE Leishmania amazonenses E CÉLULAS DE MAMÍFEROS. Mororó, Gabriele Taumaturgo; graduanda em Medicina, na Universidade Federal do Piauí UFPI; gabrieletaumaturgo@gmail.com. Carvalho, Fernando Aécio de Amorim; Médico Veterinário, doutor em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, professor orientador na Universidade Federal do Piauí UFPI; famorim@ufpi.edu.br. Núcleo de Pesquisa de Plantas Medicinais NPPM. Campus Petrônio Portela Teresina-PI. Universidade Federal do Piauí - UFPI INTRODUÇÃO A leishmaniose é uma das cinco doenças mais negligenciadas no mundo, os países mais pobres e os países em desenvolvimento são os mais afetados. Infelizmente, os programas de controle ainda são bastante precários e a mortalidade e a morbidade por leishmaniose em todo mundo são comuns. Relacionado a isso, observa-se que a eficácia do tratamento está intimamente associada a vários fatores, como a resposta imune e clínica do hospedeiro, a suscetibilidade ao agente da leishmaniose e os tratamentos utilizados são avaliados com base na eficácia, tolerância e viabilidade da administração, além de custos do tratamento (ZAULI-NASCIMETO, 2010). A procura de novos fármacos tem levado ao desenvolvimento de novos medicamentos que sejam eficientes, porém, concomitantemente, sem toxicidade. Observa-se um especial interesse na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos (MELO et al. 2006). Esse interesse, entretanto, provém desde as primeiras civilizações, as quais perceberam empiricamente a ação de princípios ativos com poder curativo no combate contra doenças (BADKE et al. 2011). A Anacardium occidentale L., planta xerófila, rústica e de porte médio, popularmente conhecida como cajueiro, é típica de clima tropical. Originária do litoral

2 do nordeste brasileiro, esta árvore se espalhou para diversos países da África e para a Índia (PARENTE et al., 1991). A castanha e o caju gerados por essa planta apresentam particular interesse nutricional e econômico, tanto pela qualidade de sua castanha, quanto pela riqueza em vitamina C de seu pseudofruto (GARRUTI, 2001). O LCC natural, que é popularmente conhecido como líquido da castanha do caju (LCC), é constituído, geralmente, por 70% de ácido anacárdico, 20% de cardol, 5% de cardanol e 5% de material polimérico. O ácido anacárdico está relacionado com o ácido salicílico e apresentou várias atividades, tais como ação antibactericida resistente à meticilina contra Staphylococcus aureus (MUROI E KUBO, 1996), anticancerígeno, antiinflamatório e radiossensibilizante (SUNG et al., 2008). O cardanol é o principal constituinte do LCC produzido pelas indústrias de processamento de castanha de caju na produção de outros produtos industriais, tais como cimento, tintas e vernizes (MENON et al., 1985) Porém, sua principal aplicação é como um polímero (PARAMASHIVAPPA et al., 2001). Devido à sua estrutura, similar aos de tocofenóis, o cardol é um derivado do tipo resorcinol e apresenta grande interesse em muitos ramos de pesquisa, como biotecnologia, biofarmacologia e biomedicina, como agente antimicrobiano e antitumoral, pesticida contra moluscos e inibidores da enzima prostaglandina sintetase (TOCCO et al., 2009). Ácido anacárdico, cardol e cardanol mostraram atividade contra os insetos e contra os microorganismos e enzimas antioxidantes (TREVISAN et al., 2006; LOMONACO et al, 2009). Componentes do LCC podem também controlar a proliferação do inseto Aedes aegypti através da inibição da enzima acetilcolinesterase, a qual é o mecanismo de ação de muitos inseticidas (FINKELSTEIN et al., 2002). Com base nesse contexto, a busca por princípios ativos em plantas que tenham ação terapêutica tornou-se objeto deste estudo, que está relacionado, principalmente, a avaliar a atividade antileishmania e citotóxica do líquido obtido da castanha de caju (Anacardium occidentale L.) (LCC), preparado no Laboratório de Produtos Naturais, do Centro de Ciências da Natureza, da Universidade Federal do Piauí (LPN/CCN/UFPI). OBJETIVOS Nesse ínterim, objetivou-se avaliar, na presença do líquido da castanha de caju (LCC), a atividade antileishmania sobre formas promastigotas de Leishmania

3 amazonenses; a síntese de óxido nítrico por macrófagos murinos; a atividade citotóxica sobre macrófagos murinos; e, por fim, a citotoxidade em eritrócitos humanos. MATERIAL E MÉTODOS As células utilizadas foram macrófagos de camundongos BALB/c e eritrócitos humanos obtidos de doador voluntário. Os macrófagos foram isolados do peritônio de camundongos BALB/c, de sexo masculino ou feminino, entre 5 a 6 semanas de vida (20,0 a 25,0 g), provenientes do biotério do Núcleo de Pesquisa em Plantas Medicinais (NPPM/CCS/UFPI). Utilizou-se também eritrócitos humanos com tipagem sanguínea O + obtidos de amostra sanguínea de doador voluntário. A amostra do LCC foi diluída em dimetilsufóxido (DMSO) para uma concentração final de µg/ml. A fim de ser realizada a avaliação do potencial antileishmania sobre as formas promastigotas de L. amazonensis. Assim, para avaliação da atividade antileishmania do LCC e obtenção do IC50, utilizou-se a forma promastigota de Leishmania amazonensis em fase logarítima de crescimento. 1x10 6 promastigotas foram plaqueadas em placa de 96 poços juntamente com o LCC em concentrações seriadas (800 µg/ml até 6,25 µg/ml). Após 48h, avaliouse a viabilidade das promastigotas através de coloração com resazurina (20µl por poço). Foi observado o comprimento de onda em leitor de ELISA a 550nm. Para avaliar a citotoxidade para obter a CC50, foram utilizados macrófagos murinos e eritrócitos humanos de sangue O + de doador voluntário. 2x10 5 macrófagos foram plaqueados em placas de 96 poços juntamente com as concentrações seriadas de LCC descritas anteriormente. Após 48h, foi acrescentado aos poços soluções de MTT diluído em DMSO (proporção de 10% de MTT) para observação de células viáveis. Avaliou-se também a toxidade de LCC sobre eritrócitos humanos, para observar a indução de hemólise e seu mecanismo de ação através da ativação de macrófagos pela síntese de óxido nítrico (NO). RESULTADOS E DISCUSSÃO O LCC foi capaz de inibir cerca de 100 % do crescimento das promastigotas na concentração de 800 µg/ml em 48 h, apresentando atividade antileishmania em torno de 80 % e se mantendo aproximadamente constante nas concentrações de 400 µg/ml a

4 50 µg/ml em 48 h. Havendo uma queda gradativa e considerável a partir da concentração de 50 µg/ml até 6,25 µg/ml em 48 h. O valor de IC50 em 48 h foi de 18,821 µg/ml. O LCC não foi capaz de induzir a síntese de NO por macrófagos peritoneas de camundongos BALB/c. Contudo, o LCC apresentou efeito tóxico sobre essas mesmas células, pois alterou de maneira significativa sua viabilidade a partir da concentração de 800 a 50 μg/ml. A concentração citotóxica média (CC50) foi de 31,36 μg/ml, com intervalo de confiança de 13,233 para mais ou para menos. Esse valor revela certo potencial tóxico do LCC para a célula. Isso é confirmado pelo índice de seletividade que, ao relacionar a CC50 com a IC50, obteve-se tal índice no valor de 1,66, o qual é relativamente baixo. A citotoxicidade do LCC também foi avaliada in vitro, em eritrócitos humanos do tipo sanguíneo O +. O LCC obteve concentração de hemólise de 50% no valor de concentração foi de 332,561 μg/ml. Essa ação hemolítica manteve-se de forma considerável até concentrações inferiores à 50 μg/ml. Essa indução à lise de hemácias, revelou um potencial tóxico contra eritrócitos humanos. CONCLUSÃO Os resultados obtidos pelas concentrações do LCC indicam uma atividade antileishmania satisfatória sobre as formas promastigotas das L. Amazonensis. Devido à baixa síntese de NO, supõe-se que o mecanismo utilizado não é pela via do óxido nítrico. Ao associar com os valores de citotoxicidade em macrófagos murinos e em eritrócitos humanos, entretanto, observou-se um elevado potencial tóxico, o que afeta a ação terapêutica do LCC. Essa possibilidade de agressão ao organismo é confirmada pelo índice de seletividade, que se apresentou bastante baixo para compensar o efeito terapêutico diante do efeito tóxico. Logo, os resultados obtidos com o LCC indicam uma potente atividade antileishmania sobre as L. Amazonensis, porém, sem indução da síntese de NO pelos macrófagos e com relativa toxicidade para essas células. Palavras-chave: Leishmaniose; Anacardium occidentale L.; Fitoterápico. REFERÊNCIAS

5 BADKE M. R. et al. Plantas medicinais: o saber sustentado na prática do cotidiano popular. Esc Anna Nery, < consultado em 29/01/2015. FINKELSTEIN, B. L., BENNER, E. A., HENDRIXSON, M. C., KRANIS, K. T., RAUH, J. J., SETHURA-MAN, M. R., MCCAIN, S. F. Tricyclic cyanoguanidinas: synthesis, site of action and insecticidal activity of coumarins derivatives as dual inhibitors of acetylcholinesterase and monoamine oxidase a novel class of reversible acetylcholinesterase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 10, , GARRUTI, Deborah dos S. Composição de voláteis e qualidade de aroma do vinho de caju. Campinas, p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas. LOMONACO, D., SANTIAGO, G. M. P., FERREIRA, Y. S., ARRIAGA, A. M. C., MAZZETTO, S. E., MELE, G., VASAPOLLO, G. Study of technical CNSL and its main components as new green larvicides. Green Chem. 11, 31 33, MELO, A. F. M., et al. Avaliação da toxicidade subcrônica do extrato bruto seco de Anacardium occidentale linn em cães em cães. Acta Sci. Health Sci. Maringá, v. 28, n. 1, p , MENON, A. R. R., PILLAI, C. K. S., SUDHA, J. D., MATHEW, A. G. Cashew nut shell liquid-its polymeric and other industrial products. J. Sci. Ind. Res. 44, , MUROI, H., KUBO, I. Antibacterial activity of anacardic acid and totarol, alone and in combination with methicillin, against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Appl. Bacteriol. 80, , PARAMASHIVAPPA, P., Kumar, P. P., VITHAYATHIL, P. J., RAO, A. S. Novel method for isolation of major phenolic constituints from cashew (Anacardium occidentale L.) nut shell liquid. J. Agric. Food Chem. 49, , PARENTE, J.I.G.; PESSOA, P.F.A.P.; NAMEKATA, Y. Diretrizes para recuperação da cajucultura no Nordeste. Fortaleza: EMBRAPA. Março, (Documento nº 4).

6 SUNG, B., PANDEY, M. K., AHN, K. S., YI, T., CHATURVEDI, M. M., LIU, M., AGGARWAL, B. B. Anacardic acid (6-nonadecyl salicylic acid), an inhibitor of histone acetyltransferase, suppresses expression of nuclear factor-kappa B- regulated gene products involved in cell survival, proliferation, invasion, and inflammation through inhibition of the inhibitory subunit of nuclear factorkappabalpha kinase, leading to potentiation of apoptosis. Blood 111, , TOCCO, G., FAIS, A., MELI, G., BEGALA, M., PODDA, G., FADDA, M. B., CORDA, M., ATTANASI, O. A., FILIPPONE, P., BERRETTA, S. PEG-immobilization of cardol and soluble polymer-supported synthesis of some cardol coumarin derivatives: prelimi-nary evaluation of their inhibitory activity on mushroom tyrosinase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 36 39, TREVISAN, M. T. S., PFUNDSTEIN, B., HAUBNER, R., WÜRTELE, G., SPIEGELHALDER, B., BARTSCH, H., OWEN, R. W. Characterization of alkyl phenols in cashew (Anacardium occi-dentale) products and assay of their antioxidant capacity. Food Chem. Toxicol. 44, , ZAULI-NASCIMETO R. C., MIGUEL D. C., YOKOYAMA-YASUNAKA J. K., PEREIRA L. I., PELLI DE OLIVEIRA M. A., RIBEIRO-DIAS F., DORTA M. L., ULIANA S. R. In vitro sensitivity of Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis Brazilian isolates to meglumine antimoniate and amphotericin B. Trop Med Int Health. Epub