Taxonomia e citopatologia causada por Nucleopolyhedrovirus em células de Bombyx mori

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1 Pesquisa Vírus Entomopatogênicos no BICHO DA SEDA Rose Meire Costa Brancalhão Profa. Dra. Departamento de Ciências Biológicas UNIOESTE-Campus de Cascavel, CCBS/CCB Cascavel PR Fotos e ilustrações cedidas pela autora Taxonomia e citopatologia causada por Nucleopolyhedrovirus em células de Bombyx mori o Brasil, a sericicultura é uma importante atividade agroindustrial que contribui substancialmente para a economia rural. O País é o 4 produtor mundial de casulos verdes 1 e de fios de seda. A cadeia produtiva da seda no Brasil apresenta um faturamento Fig. 1 - Corte histológico do tecido gorduroso de lagartas de B. mori de 5 estádio, no 5 dia pós-inoculação com BmNPV. Coloração: Azan modificado. Observem-se várias células em diferentes fases da infecção; os poliedros apresentam-se corados em vermelho no interior das células e no meio extracelular; 400 X. Em detalhe, A- núcleo hipertrofiado com os poliedros maduros (em vermelho), B- núcleo de célula gordurosa sadia processada da mesma maneira que o material infectado e utilizado como controle nos experimentos. Envoltório nuclear (EN), citoplasma (C), membrana plasmática (M); X bruto anual da ordem de US$ 129 milhões, a maior parte na forma de divisas auferidas com exportações, uma vez que 97% da produção de fios de seda é destinado a esse mercado. O Paraná é o principal estado produtor, concentrando 83,59% da produção nacional. Atualmente, 241 municípios paranaenses são produtores de casulos verdes e é o número de criadores existentes nesses municípios, explorando uma área de 34 mil hectares de amoreira, e gerando mais de empregos diretos na zona rural (Watanabe et al., 2000). A atividade tem-se desenvolvido sobretudo nas pequenas propriedades rurais, onde predomina o trabalho familiar, representando uma alternativa importante para a melhoria da renda dessas propriedades e contribuindo de forma significativa para a diminuição do êxodo rural. Somando-se a essas características, a sericicultura contribui para o desenvolvimento sustentável do país, em virtude de seu relevante aspecto social e por se tratar de atividade de baixo impacto no meio ambiente. A sericicultura abrange o cultivo da amoreira (Morus sp.), a produção e o preparo dos ovos, e a criação das lagartas do bicho-da-seda. Parte dessa fase do ciclo de vida do inseto é conduzida por produtores rurais, produzindo os casulos que as indústrias transformam em fios e tecidos de seda. O bicho-daseda da amoreira, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), contribui com 95% da produção total de fios de seda, utilizados na confecção de diferentes tipos de tecidos (Fonseca & Fonseca, 1986; Watanabe et al., 2000). Nos vários estágios do seu ciclo de vida, o bicho-da-seda é sensível a doenças e ataques de pragas e parasitos. Entre 1 Casulos verdes- casulos coletados pelo produtor, nos barracões de criação do bicho-da-seda e encaminhados aos entrepostos de compra das indústrias de fiação. Esses ainda apresentam as crisálidas vivas. No entreposto, os casulos verdes são desidratados em um secador que mata as crisálidas. 54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

2 Tabela 1- Sinais e sintomas observados nas lagartas de B. mori de 5 estádio, que caracterizam a doença causada por NPV. Dias de infecção Sintomas 4-5 mudança na coloração do tegumento (branco para branco-amarelado); diminuição na alimentação. 5-7 inchação das membranas intersegmentais; parada na alimentação; comportamento alterado, busca de lugares mais altos e deslocamento aleatório; rastro líquido leitoso; início da morte de lagartas. 6-8 fragilidade e ruptura do tegumento início do encasulamento e produção de casulos defeituosos. os agentes patogênicos já descritos, citam-se protozoários, vírus, fungos e bactérias. As doenças causadas por esses patógenos ocorrem em quase todas as áreas de criação do mundo, e as doenças virais, quando não tomadas as medidas profiláticas, são responsáveis por quase 70% das perdas, representando mundialmente um sério problema para a sericicultura (Fonseca & Fonseca, 1986; Sengupta et al., 1990). Baculoviridae é uma importante família de vírus entomopatogênicos, que infecta predominantemente, insetos holometábolos, particularmente os da ordem Lepidoptera. Taxonomicamente apresenta-se dividida nos gêneros Nucleopolyhedrovirus (NPV) e Granulovirus (GV). Os NPV são constituídos por uma molécula de DNA de filamento duplo, que se asssocia com proteínas do capsídeo formando o nucleocapsídeo (Bilimoria, 1991; Murphy et al., 1995). NPV podem abrigar partículas virais ou vírions contendo apenas um nucleocapsídeo por envelope, single (S), cujo genótipo é conhecido como SNPV; ou vários nucleocapsídeos por envelope multiple (M), no caso do genótipo MNPV. No Brasil, NPV infectando lagartas de B. mori foram detectados em 1976, por GATTI et al., e 1979, por ONGARELLI, ambos no estado de São Paulo. No estado do Paraná, maior produtor de seda no Brasil, poucos são os trabalhos com o NPV. Assim sendo, o presente estudo foi desenvolvido para se verificar a ocorrência de NPV, procedendo sua identificação taxonômica; utilizar o isolado geográfico do BmNPV (Bombyx mori NPV) para análise do seu ciclo reprodutivo em células alvos, através de estudos citopatológicos. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Foram utilizadas lagartas híbridas do bicho-da-seda da amoreira, Bombyx mori, de 5 estádio ou instar, sadias e com suspeita de infecção viral. O material suspeito incluiu lagartas originalmente coletadas doentes e mortas. As coletas foram realizadas diretamente nos barracões de criação de produtores rurais, localizados nas regiões Norte, Oeste e Sul do estado do Paraná. Em laboratório, as lagartas suspeitas de infecção foram armazenadas a temperatura de -4 C. Para a pré-identificação do agente infeccioso, as lagartas suspeitas foram maceradas em água destilada, sendo o macerado filtrado em algodão. Esse foi observado ao microscópio de luz para a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro

3 Fig. 2- Microscopia eletrônica de de 5 instar, no 5 dia pósinoculação Visualiza-se, no núcleo de uma célula traqueal o início da replicação do NPV, com formação do estroma virogênico (EV). Cromatina (CR), envoltório nuclear (EN) e citoplasma celular (C). Escala 1 µm verificação da presença ou não de corpos de oclusão de origem viral, através de preparações rápidas, a fresco e corado pelo Azocarmin G (Brancalhão, 2000). Confirmada a presença dos corpos de oclusão, esse macerado foi centrifugado por três vezes a rpm em microcentrífuga por 10 minutos, sendo descartados os sobrenadantes e o material restante ressuspendido em água destilada a cada centrifugação. Após esse tempo, os corpos de oclusão foram recolhidos, colocados em frascos esterilizados e armazenados a -10 C até o momento de usar. O material resultante dessa semi-purificação, denominado inóculo, foi pulverizado sobre folhas de amoreira a uma concentração de 2,26 x 10 6 COP/ml (COP= corpos de oclusão poliédricos), e essas folhas fornecidas na alimentação de lagartas sadias do 5 estádio. Os sintomas manifestados pelas lagartas doentes foram observados e anotados diariamente em fichas próprias. Em diferentes tempos pós-inoculação (durante onze dias com intervalos Fig. 3- Microscopia eletrônica de de 5 instar, no 5 dia pósinoculação Parte do núcleo de uma célula traqueal mostrando nucleocapsídeos não envelopados (NE), situados, preferencialmente, no interior do EV, e nucleocapsídeos envelopados (E), na periferia do EV e próximos ao envoltório nuclear (EN). Envoltório nuclear (EN), citoplasma celular (C), mitocôndria (Mt). Escala 1 µm de vinte e quatro horas), as lagartas foram anestesiadas e dissecadas, o tecido gorduroso e traqueal foram rapidamente retirados e colocados no fixador. No estudo com a microscopia de luz foi utilizado o fixador DuBosq Brasil. Posteriormente, o material foi passado pelas etapas convencionais dos preparados histológicos (Brancalhão, 1998); e corado pela técnica de Azan, modificada para corpos de oclusão virais, segundo Hamm (1966). Nos estudos ultra-estruturais, os tecidos foram mergulhados em solução fixadora de Karnovsky refrigerada e reduzidos a fragmentos, de aproximadamente, 1 mm 3. O processamento para microscopia eletrônica seguiu o protocolo descrito por Brancalhão (1998). O fluxograma da metodologia descrita é apresentado no esquema 1. Fig. 4- Microscopia eletrônica de transmissão de lagarta de B. mori de 5 instar, no 5 dia pós-inoculação com o BmMNPV. Mostra, em detalhe, os nucleocapsídeos não envelopados (NE) e os nucleocapsídeos envelopados (E) ou vírions. Vírions em cortes longitudinal (è) e transversal (ð). Escala 0,1 µm RESULTADOS E DISCUSSÃO As observações diárias das lagartas de B. mori revelaram uma série de sintomas característicos (tabela 1) de doença causada por Nucleopolyhedrovirus (NPV) (Granados & Williams, 1986; Hanada & Watanabe, 1986; Fonseca & Fonseca, 1986; Sengupta et al., 1990; Adams & McClintock, 1991; Brancalhão, 1998). As análises citopatológicas e histopatológicas dos tecidos gorduroso e traqueal revelaram a presença de corpos de oclusão de forma poliédrica, ou poliedros, no núcleo das células infectadas. Poliedros são estruturas virais características de duas famílias de vírus entomopatogênicos, Baculoviridae (NPV) e Reoviridae (Cypovirus), que infectam B. mori. A ausência de infecção no citoplasma das células permitiu a distinção de infecção por NPV, pois Cypovirus se multiplica no citoplasma celular (Adams & McClintock, 1991; Murphy et al., 1995). Os poliedros foram detectados primeiro nas células do tecido gorduroso, a partir do 4 dia pós-inoculação com o 56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

4 Fig. 5- Microscopia eletrônica de transmissão de lagarta de B. mori de 5 instar, no 7 dia pósinoculação Parte do núcleo de uma célula traqueal mostrando os poliedros em formação (PI). Nucleocapsídeos não envelopados (NE) e nucleocapsídeos envelopados (E). Envoltório nuclear (EN), citoplasma celular (C). Escala 1 µm NPV. Os núcleos apresentavam-se hipertrofiados e em diferentes estágios da infecção, indicando uma replicação assincrônica do vírus (fig. 1). Nestes núcleos a primeira estrutura visível é o viroplasma ou estroma virogênico (EV) (fig. 2), onde os nucleocapsídeos não-envelopados são produzidos e, posteriormente, adquirem o envelope formando os vírions (fig. 3). A figura 4 apresenta em detalhe o nucleocapsídeo não-envelopado e o nucleocapsídeo envelopado ou vírion. No desenvolvimento do processo infeccioso os vírions são ocluídos dentro de um corpo de oclusão de forma poliédrica, o poliedro (fig. 5). Nesta fase, o EV apresentava-se envolto por poliedros de tamanhos variados, representando diferentes estágios do desenvolvimento da estrutura poliédrica, que cresce pelo acúmulo e cristalização contínuos da proteína poliedrina (fig. 6). Cada poliedro apresentava-se constituído por muitos vírions. Ao final do ciclo reprodutivo desse Fig. 6- Microscopia eletrônica de de 5 instar, no 7 dia pósinoculação Mostra, em detalhe, o processo de formação do poliedro, onde os nucleocapsídeos envelopados (E) ou vírions agregam-se em torno da matriz densa, constituída de poliedrina (MT), que cresce conforme vai havendo a agregação de mais vírions. Escala 0,1 µm vírus, ocorre citólise e, conseqüente, liberação dos poliedros já maduros na cavidade geral do corpo do inseto (fig. 7). Todas estas etapas são condizentes com a citopatologia da infecção causada por NPV (Granados & Williams, 1986; Adams & McClintock, 1991; Brancalhão, 1998). Os dados ultra-estruturais revelaram a presença de um ou mais nucleocapsídeos por envelope (fig. 7, detalhe), característica diagnóstica para os MNPV (Granados & Williams, 1986; Blissard e Rohrmann, 1990; Adams e McClintock, 1991; Murphy et al., 1995). O MNPV é um genótipo virulento, uma vez que é maior o número de nucleocapsídeos por envelope (Tanada & Kaya, 1993). A virulência desse isolado geográfico do BmMNPV pode ser constatada pelo curto intervalo de tempo levado para o início da morte das lagartas, a partir do 5 dia pósinoculação e, pela morte de 80% das lagartas ao final dos experimentos. As 20% restantes construíram casulos de baixa qualidade e, em sua maioria, morreram na fase de pupa. Contudo, ressalta-se que este período que vai da infecção pelo baculovírus até a morte da lagarta doente é, também, afetado por outros fatores, incluindo a idade da lagarta, as condições ambientais, a quantidade de vírus ingerido, a densidade populacional das lagartas, a disponibilidade de alimento e a incidência de outros patógenos (Longworth, 1973; Granados & Williams, 1986; Hanada & Watanabe, 1986). Os poliedros são estruturas de resistência, que persistem por longo tempo no meio ambiente (David, 1975; Longworth, 1973; Cianciarullo et al., 1977; Lewis & Rollinson, 1978; Blissard & Rohrmann, 1990; Adams & McClintock, 1991; Bilimoria, 1991). Assim, torna-se essencial, que ao se detectar a presença deste vírus, as lagartas infectadas sejam imediatamente eliminadas, pois uma vez doentes elas não se curam (Hanada & Watanabe, 1986). Além disso, estas lagartas representam um foco potencial de vírus, eliminando poliedros infectivos através da boca, do ânus e do tegumento rompido, na forma de um liquido leitoso. Este líquido é, também, constituído pela hemolinfa e por restos de células lisadas pelo vírus (Granados & Williams, 1986; Sengupta et al., 1990; Adams & McClintock, 1991; Bilimoria, 1991; Brancalhão, 1998). Os poliedros eliminados aderemse facilmente às folhas da amoreira, possibilitando sua ingestão por lagartas sadias; e uma vez que a via oral é a principal via de entrada dos NPV (Longworth, 1973; Sengupta et al., 1990; Vasconcelos, 1996), estes podem reiniciar seu processo infeccioso no novo hospedeiro. Soma-se a isto o deslocamento aleatório e o geotropismo negativo exibido pelas lagartas infectadas, alterações comportamentais comuns nas infecções pelo baculovírus, o que auxilia ainda mais na dispersão da doença dentro dos barracões de criação (Granados & Williams, 1986; Hanada & Watanabe, 1986; Brancalhão, 1998). O produtor rural deve ainda ter especial atenção com os resíduos (restos de ramos da amoreira, fezes) da criação do bicho-da-seda. Não é aconselhável seu uso, sem tratamento prévio, como adubo nas plantações de amoreira, uma vez que os NPV podem, também, permanecer no solo de uma estação para outra e vir a ser reintroduzidos nos barracões de criação. O mesmo cuidado deve ser tomado na desinfecção de utensílios e do próprio barracão de criação. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro

5 Fig. 7- Microscopia eletrônica de de 5 instar, no 7 dia pós-inoculação com o BmNPV. Mostra dois poliedros associados (irregulares), no meio extracelular, liberados após a lise celular. No seu interior, aparecem nucleocapsídeos envelopados (vírions), em cortes longitudinal (è) e transversal (ð). Matriz do poliedro, constituída de poliedrina (MT). Escala 1 µm. Em detalhe, aspectos de nucleocapsídeos envelopados individualmente (a), em par (b) ou em grupo de três (c), o que permite classificar taxonomicamente como BmMNPV. Escala 0,1 µm. A ultra-estrutura do vírion indicado em a, está representada diagramaticamente abaixo. No caso de a, não é possível individualizar o capsídeo REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, J. R.; McClintock, J. T. Baculoviridae. Nuclear polyhedrosis viruses. Part 1. Nuclear polyhedrosis viruses of insects. In: Adams, J. R.; Bonami, J. R. (Eds.) Atlas of invertebrate viruses. Florida: CRC Press, p Bilimoria, S. L. The biology of nuclear polyhedrosis viruses. In: KURSTAK, E. Viruses of invertebrates. New York: Marcel Dekker, p.1. Blissard, G.W. & Rohrmann, G.F. Baculovirus diversity and molecular biology. Annu. Rev. Entomol., v.35, p , Brancalhão, R.M.C. Nucleopolyhedrovirus em Bombyx mori L., 1758 (Lepidoptera: Bombycidae), no Estado do Paraná. Curitiba, p. [Tese (Doutorado) - Departamento de Zoologia UFPR]. Brancalhão, R.M.C.; Souza, V.B.V.; Fortes, J.C. Método Simplificado para Detecção de Nucleopolyhedrovirus em Bombyx mori L., 1758 (Lepidoptera: Bombycidae). Arq. Inst. Biol., v. 67, n.1, p.89-92, jan./jun., Fonseca, A.S. & Fonseca, T. C. Cultura da amoreira e criação do bicho-da-seda. São Paulo: Nobel, p Gatti, I. M.; Silva, D. M.; Matys, J. C.; Nogueira, N. L.; Oliveira, A. R. Constatação ao microscópio eletrônico de poliedroses em bicho da seda (Bombyx mori L.). V Colóquio Brasileiro de Microscopia Eletrônica. Piracicaba, p.88-89, Granados, R.R. & Williams, K.A. In vivo infection and replication of baculovirus. In: Granados, R.R. & Federici, B.A. (Eds.) The biology of baculoviruses. Florida: CRC Press, v.1, p Hamm, J.J. A modified Azan staining technique for inclusion body viruses. J. Invertebr. Pathol., v.8, p , Hanada, Y.; Watanabe, J. K. Manual de criação do bicho-da-seda. COCAMAR, p. Junqueira, L. C.; Junqueira, L. M. M. S. Técnicas básicas de citologia e histologia. São Paulo: Santos, p. Longworth, J. F. Virus and lepidoptera. Chapter 21. In: Gibbs, A. J. Viruses and invertebrates. North-Holland Research Monographs Frontiers of Biology. Amsterdam-London: North-Holland Publishing Company, v.31, Murphy, F.A.; Fauquet, C.M.; Bishop, D.H.L.; Ghabrial, S.A.; Jarvis, A.W.; Martelli, G.P.; Mayo, M.A.; Summers, M.D. Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses. Arch. Virol., v.140, Supplement, 10. Ongarelli, M. G. Alterações e modo de ação das partículas do vírus da poliedrose nuclear e estudos autoradiográficos em células de Bombyx mori L., 1758 (Lepidoptera: Bombycidae). São Paulo, p. [Dissertação (Mestrado) ESALQ USP]. Sengupta, K.; Kumar, P.; Baig, M.; Govindaiah Handbook on pest and disease control of Mulberry and Silkworm. Bangkok, Thailand: UNESCAP (United Nations Economic and Social Commission for Asia and the Pacific), Tanada, Y.; Kaya, H. K. Insect Pathology. Chapter 6. DNA-Viral Infections: Baculoviridae. Academic Press, p , Watanabe, J.K.; Yamaoka, R.S.; Baroni, S.A. Cadeia produtiva da seda: diagnósticos e demandas atuais. Londrina/ PR: IAPAR, p.30-33, AGRADECIMENTOS CAPES e Fundação Banco do Brasil pelo apoio financeiro. EMATER-Paraná, ABRASEDA e às empresas de fiação de seda: COCAMAR, KANEBO SILK DO BRA- SIL S. A. e FIAÇÃO DE SEDA BRATAC S. A., pelo fornecimento das lagartas de B. mori e informações sobre a sericicultura. 58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002