INSTRUMENTAL A ESPECTROFLUORIMETRIA BIOLUMINESCÊNCIA ORGANISMOS FLUORESCENTES MINERAIS FLUORESCENTES. FOTOLUMINESCÊNCIA Fluorescência.

Transcrição

1 QUI 221 AÁLISE ISTRUMETAL A ESPECTRFLURIMETRIA LUMIESCÊCIA FTLUMIESCÊCIA Fluorescência Fosforescência QUIMILUMIESCÊCIA BILUMIESCÊCIA PRF. FERAD B. EGREJA FILH DQ ICEx UFMG BILUMIESCÊCIA Luciferin + Luciferase + xygen = LIGHT MIERAIS FLURESCETES RGAISMS FLURESCETES LUZ BRACA LUZ UV 1

2 Aumento de fluorescência da 1,8-AS (ácido 1- anilinonaphthaleno-8-sulfônico) ao ligar-se a uma proteína (albumina de soro bovino). Candida albicans com branco de calcofluor Microscópio de fluorescência, X 1 REAGETES FLURESCETES ADITIVS FLURESCETES LUZ BRACA LUZ UV LÂMPADA FLURESCETE LÂMPADA FLURESCETE (Ca 5 (P 4 ) 3 F 1-x Cl x ) AZUL + AMAREL = BRAC emissão em 254 e 185 nm Ca 5 (P 4 ) 3 F 1-x Cl x Dopado com Sb 3+ e Mn 2+ 2

3 QUIMILUMIESCÊCIA Quimioluminescência do produto de reação da codeina com tris(2,2'-bipiridil)ruthenio(iii) Um teste particular que revela a presença de sangue é o Teste do Luminol. este teste as manchas de sangue aparecem sob uma luz azul devido ao produto luminescente da reação de do luminol na presença do ferro da hemoglobina FSFRESCÊCIA Identifica-se uma mancha particular como sangue ou não, ou talvez até mesmo revelar manchas escondidas em materiais escuros ou onde foram feitas tentativas lavar o sangue. Absorção, geralmente, no UV e emissão, possível, em todo o espectro visível vel 3

4 H 2 C H H 3 C fenantreno Processos de desativação Relaxação não radioativa (vibracional) Conversão Interna Conversão Externa Cruzamento Intersistemas Pré-dissociação Dissociação Eficiência Quântica (Ф)( φ = φ = k f fótons _ emitidos fótons _ absorvidos + k + k i ce k f + k ci + k pd + k d Fatores que afetam a Fluorescência a) Tipo de transição Principal π* π (1 a 1x > π* n) ão ocorre δ* δ, pois 2 nm = 14 kcal/mol b) Estrutura: duplas conjugadas (π* π ) c) Rigidez estrutural d) Solvente e Temperatura e) ph f) 2 dissolvido 4

5 Rigidez estrutural Fluoreno φ = 1 Bifenila φ =,2 Fluorescência x Concentração F I I F φ = ( I I ) = 1 I = I 1 εbc εbc εbc ( 1 ) = φi 1 Expandindo o termo exponencial em série de Maclaurin: 2 ( 2,33εbC) ( 2,33εbC) 3 F = Iφ 2,33εbC ! 3! Se εbc <,5 F = Iφ2, 33εbC F = I kc ε ~ 1 C < 5x1 mol. L Fatores que afetam a linearidade Auto-supressão: perda de energia por choques em concentrações mais altas; Auto-absorção: absorção de radiação por moléculas não excitadas, entre as excitadas e o detector. Importante quando ocorre a fluorescência de ressonância. FLURÍMETR 5

6 FTES DE UV FLURÍMETRS MEDIDR DE CLRFILA EM CAMP Gambiômetro (quininômetro) Bacterial luciferin is a reduced riboflavin phosphate (FMH 2, pictured here) Excitação por lâmpada de vapor de mercúrio; Detecção por célula fotoelétrica (calculadora solar); Detecção por ldr (plotar 1/R x F); Sem sistema de seleção de λ ; Determinação de quinino em água tônica. Água tônica: Água gaseificada com 2 7 mg L -1 de quinino, Benzoato de sódio (C 6 H 4 Ca); Sorbato de potássio (H 3 C- CH=CH-CH=CH-CK) Ácido tartárico (HC CH(H)-CH(H)-CH) Ácido cítrico (HCCH 2 ) 2 -C(H)- CH 6

7 Gambiômetro (quininômetro) Absorvância Espectro de Excitação (Absorção) Espectro de Fluorescência (Emissão) λ EXC = 35 nm λ (nm) H 3 C H H 2 C F (cpsx1-6 ) Absorbância 3.5 Espectro de Absorção Tonica Quinina Comprimento de nda (nm) VATAGES Maior Sensibilidade e menor limite de detecção (até 1x mais sensível que a espectrofotometria); Grande Seletividade nas determinações diretas DESVATAGES Exatidão e Precisão 2 a 5 x pior que EAM; Fosforimetria menos precisa que a Fluorimetria; Alto custo; Menor Aplicabilidade. APLICAÇÕES FLURIMETRIA Espécies orgânicas: Enzimas, coenzimas, agentes medicinais, produtos de plantas, alcalóides, esteróides, vitaminas,... Espécies inorgânicas: metais (quelatos fluorescentes), ânions (inibição de fluorescência) Íon determinado Al 3+ F - Métodos fluorimétricos p/ espécies inorgânicas Reagente Alizarina Granada R Alizarina Granada R com Al 3+ Comprimento de onda (nm) Sensibilidade (µg ml -1 ) Interferentes Excit. Emis. 47 5,7 Be, Co, Cr, Cu F -, 3 -, i, P4 3-, Th, Zr 47 5,1 Be, Co, Cr, Cu Fe, i, P4 3-, Th, Zr B47 2- Benzoína 37 45,4 Be, Sb Cd 2+ 2-(o-hidroxifenil)- 365 Azul 2 H3 benzoxanol Li + 8-hidroxiquinolina 37 58,2 Mg Sn 4+ Flavonol 4 47,1 F -, Zr, P4 3- Zn 2+ Benzoína --- Verde 1 B, Be, Sb, íons coloridos Ca 2+ Calceína 33 54,4? 7

8 Ligantes Fluorescentes H H 8-hidroxiquinolina: Al, Be e outros metais Zn + 3 complexo fluorescente de Zn-8-hidroxiquinolina H Flavonol reag. p/ Zr e Se H Benzoína reag. p/ B, Zn, Ge e Si H H H H (- 2 CH 2 C) 2 H (CH 2 C 2 -) 2 H Alizarina granada R (p/ Al3+, F-) S 3 a Calceína Fluoresceína FSFRÍMETR APLICAÇÕES FSFRIMETRIA Ácidos nucléicos, Aminoácidos, Purina e Pirimidina, Hidrocarbonetos do petróleo, Pesticidas FLURÍMETR Efeito da substituição da fluorescência do benzeno Composto Fórmula λ de Fluorescência (nm) Intensidade relativa de fluorescência Benzeno C6H Tolueno C6H5CH Propilbenzeno C6H5C3H Fluorobenzeno C6H5F Clorobenzeno C6H5Cl Bromobenzeno C6H5Br Iodobenzeno C6H5I --- Fenol C6H5H Fenolato C6H Anizol C6H5CH Anilina C6H5H Anilínio C6H5H Ácido benzóico C6H5CH Benzonitrila C6H5C itrobenzeno C6H