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1 Niro Kasahara Rastreamento do polimorfismo TIGR/MYOC mt.1 (-1000C>G) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo aberto e correlação com o risco e a gravidade da doença. Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina São Paulo 2009

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4 Niro Kasahara Rastreamento do polimorfismo TIGR/MYOC mt.1 (-1000C>G) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo aberto e correlação com o risco e a gravidade da doença. Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina. Área de concentração: Ciências da Saúde Orientadora: Mônica Barbosa de Melo Co-orientador: Murilo Rezende Melo São Paulo 2009

5 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Kasahara, Niro Rastreamento do polimorfismo TIGR/MYOC mt.1 (-1000C>G) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo aberto e correlação com o risco e a gravidade da doença./ Niro Kasahara. São Paulo, Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Curso de Pós-Graduação em Medicina. Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Mônica Barbosa de Melo Co-Orientador: Murilo Rezende Melo 1. Glaucoma de ângulo aberto/genética 2. Glaucoma de ângulo aberto/diagnóstico 3. Polimorfismo genético 4. Genes 5. Fatores de risco BC-FCMSCSP/25-09

6 Aos meus pais: Por seus genes Por seus valores

7 Agradecimentos Aos meu orientadores, Prof a. Dr a. Mônica B. de Melo e Prof. Dr. Murilo R. Melo, pelo tempo, dedicação, conselhos e incentivo. Aos colegas e parceiros de bancada Dr. Cristiano Caixeta-Umbelino, Prof. Dr. Maurício D. Paolera, Mylene N. Rocha e Flávio Richeti, pelo apoio e constante companhia. Aos meus mestres Prof. Dr. Geraldo V. Alemida, Prof. Dr. Ralph Cohen e Prof. Dr. Carmo Mandia Jr., incentivadores da minha carreira. Aos colegas Prof. Dr. José Paulo C. Vasconcelos e Prof. Dr. Vital P. Costa pela idéia do tema e colaboração. À Prof a. Dr a. Maria Cristina Nishiwaki-Dantas por confiar em mim. Ao Prof. Dr. Carlos A. Longui pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório. À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.

8 Abreviaturas e símbolos aa AF+ AG AMP AMPc B-Y cdna CFNR C CO 2 CPSD D datp db dctp DEX dgtp DL DNA DO dttp DVC ECC EDA EDTA E/D EMGT ERE FDT aminoácido antecedente familiar positivo anti-glaucomatosa adenosina monofostato adenosina monofostato ciclíco blue-yellow DNA produzido a partir do mrna camada de fibras nervosas da retina citosina gás carbônico corrected pattern standard deviation dipotria desoxiadenosina trifosfato decibel desoxicitosina trifosfato dexametasona desoxiguanosina trifosfato desequilíbrio de ligação ácido desoxiribonucleico disco óptico desoxitimidina trifosfato disease-causing sequence variations espessura central da córnea ensaio de discriminação alélica ácido etilenodiaminotetraacético relação escvação/disco Early Manifest Glaucoma Trial ensaio de replicação da endonuclease Frequency doubling technology

9 FFC frequência de fusão crítica FRET ressonância de Förster g grama G guanina GDx VCC polarimetria (variable corneal compensation) GDx ECC polarimetria (enhanced corneal compensation) GHT glaucoma hemifield test GLC código de genes associados ao glaucoma GPAA glaucoma primário de ângulo aberto - HCO 3 hidrogeno carbonato H 2 O 2 água oxigenada HW equilíbrio de Hardy-Weinberg Kb quilobase KCl cloreto de potássio kda kilodalton kg kilograma LDL low density level M molar MAF minor allele frequency mm milimolar M:F relação masculino:feminino MGB minor groove-binder MgCl 2 cloreto de magnésio MHz megahertz mitdn A DNA mitocondrial mm milímetro mm 2 milímetro quadrado mmhg milímetros de mercúrio MMP1 matrix metalo proteinase 1 mosm miliosmol mrna RNA mensageiro

10 MYOC MYOC mt.1 Nd:YAG nm OCT OD OHTS OPTN ORA OS P pb PCR PG ph PIO pmoles RNA rpm RT-PCR SITA SNP SSCP SWAP TA TAG Tg TIGR TOP Tris-HCl UBM myocilin polimorfismo C<G do gene myocilin neodymium-doped yttrium aluminium garnet nanômetro tomografia de coerência óptica oculum dexter Ocular Hypertension Treatment Study optineurin gene Ocular Response Analyser oculum sinister nível de significância estatística pares de bases polymerase chain reaction prostaglandina potencial hidrogeniônico pressão intra-ocular picomoles ácido ribonucleico rotação por minuto real time polymerase chain reaction Swedish interactive threshold algorithm single nucleotide polymorphism polimorfismo de conformação em fita simples short wavelength automated perimetry acetato de triancinolona tonometria de aplanação de Goldmann transgênico trabecular meshwork-induced glucorticoid response tendency oriented perimetry tris-hidroximetil aminometano - ácido clorídrico ultrasound biomicroscopy

11 UV ultravioleta VNTR variable number tandem repeat Wt selvagem WDR36 WD repeat domain 36 gene µm micrometro µg micrograma µl microlitro C grau centrígrado

12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Revisão da Literatura Patogenia Antecedente familiar Quadro clínico e qualidade de vida Diagnóstico Tratamento Bases genéticas do glaucoma Justificativa OBJETIVOS CASUÍSTICA E MÉTODO Amostra e critérios de seleção Métodos laboratoriais Extração de DNA PCR das amostras controle e padrão PCR em tempo real Análise estatística Considerações éticas RESULTADOS Características demográficas e oftalmológicas da amostra Análise genética Frequência dos genótipos Frequência dos alelos Equilíbrio de Hardy-Weinberg Correlação entre fenótipo e genótipo DISCUSSÃO Frequências de genótipos e alelos Correlação entre fenótipo e genótipo Das limitações do estudo 63

13 6. CONCLUSÕES ANEXOS 68 Anexo 1. Método de extração de DNA REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72 FONTES CONSULTADAS 82 RESUMO 83 ABSTRACT 84 LISTAS E APÊNDICE 85 Apêndice 1. Relação dos pacientes com GPAA 85 Apêndice 2. Relação dos indivíduos do grupo controle 89 Apêndice 3. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 92 Apêndice 4. Aprovação do CEP - Santa Casa de São Paulo 95 Apêndice 5. Aprovação da CONEP 96

14 1. INTRODUÇÃO O glaucoma compreende um grupo de doenças oculares que são caracterizadas por atrofia crônica e progressiva do disco óptico, geralmente acompanhado de elevação da pressão ocular (PIO) e defeitos característicos do campo visual, culminado com a perda irreversível da visão nos casos não tratados. A doença pode ser classificada de acordo com a amplitude do seio camerular (ângulo entre o endotélio da córnea e a face anterior da íris) em aberto ou fechado; ou de acordo com a presença de fator causal identificável ao exame ocular em primário (idiopático) ou secundário (como, por exemplo, glaucoma neovascular, pseudoexfoliativo, pigmentar e corticogênico dentre outros). Sua forma mais comum é o glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA). Cerca de 70 milhões de pessoas podem ser afetadas pela doença e 10% delas são cegas de ambos os olhos (Quigley, 1996). A etiologia do GPAA, embora desconhecida, é multifatorial e fatores genéticos estão implicados, tendo sido o gene MYOC (locus GLC1A) o primeiro gene relacionado à doença (Sheffield et al, 1993). Diferentes autores, trabalhando independentemente e por meio de estudos de análise de ligação, identificaram o primeiro locus para o GPAA no braço longo do cromossomo 1, posteriormente denomidado locus GLC1A (Sheffield et al, 1993; Richards et al, 1994; Wiggs et al, 1994; Morissete et al, 1995; Belmouden et al, 1997). O gene associado ao locus GLC1A foi identificado por Stone et al (1997) e denominado TIGR (trabecular meshwork-induced glucorticoid response). Kubota et al (1997) isolaram um clone de cdna humano que codificava uma proteína de 55 kda, nomeando o gene responsável por ela de Myocilin (MYOC). Posteriormente, constatou-se que os genes TIGR e MYOC apresentavam a mesma seqüência. O gene MYOC compreende uma região de 20 kb, incluindo 3 exons com 606, 126 e 718 pb, respectivamente, duas regiões intrônicas com 10 e 1,5 kb e uma região promotora de 5 kb. Sua região promotora, responsável pela modulação do processo de transcrição, apresenta as seguintes seqüências reguladoras: (a) sítios de iniciação à montante: TATA box e CAT box, (b) elementos de resposta a sinais hormonais (glicocorticóides, estrogênios), (c) elementos de resposta ao plasma, interferon e 3 sítios de ligação em potencial para o ácido retinóico e vitamina D. Acredita-se que a presença de repetições de dinucleotídeos à frente dos elementos de resposta aos glicocorticóides possa interferir na

15 expressão do gene justificando a variação de sensibilidade das células trabeculares aos corticóides. A relação causal entre as alterações no promotor do gene MYOC e a patogenia do GPAA ainda não está esclarecida. Alguns estudos têm sugerido que a presença de polimorfismos na região promotora possa estar associada a pior prognóstico e maior gravidade da doença (Colomb et al, 2001; Polansky et al, 2003). Outros autores porém, não observaram uma associação definitiva entre a presença de polimorfismos no nesta região e a gravidade do glaucoma (Alward et al, 2002; Fan et al, 2004; Özgül et al, 2005, López- Martinéz et al, 2007). Saura et al (2004) propõem que variações na sequência desta região do gene possam operar como ativadoras ou inibidoras da transcrição, alterando a expressão do gene MYOC. O polimorfismo MYOC.mt1está localizado no 1000 o par de bases à montante do início da sequência codificadora do gene e corresponde à substituição da base guanina pela citosina. Os dados da literatura com relação ao papel do polimorfismo MYOC.mt1 são controversos, no que diz respeito à patogenia do GPAA e quanto à sua associação com maior gravidade do GPAA. Estes resultados, aparentemente conflitantes, podem ser devidos a eventuais diferenças entre as populações. Até o presente, não se realizou nenhum estudo que avaliasse o papel do polimorfismo MYOC.mt1 na população brasileira. 1.1 Revisão da Literatura O GPAA, a forma mais comum de todos os glaucomas, é definido como neuropatia óptica crônica e progressiva, cujo principal fator de risco é a PIO. A estimativa do número de pessoas com as diversas formas de glaucoma, em 2010, é de 60,5 milhões, aumentando para 79,6 milhões, em A cegueira bilateral por glaucoma afetará 8,4 milhões de pessoas, em 2010, e 11,2 milhões, em 2020 (Quigley, Broman, 2006). Embora seja a segunda causa de cegueira no mundo, o glaucoma ainda é uma doença relativamente pouco conhecida do público em geral e seu diagnóstico na prática clínica é subestimado. Estudos populacionais sugerem que mais da metade dos indivíduos com glaucoma identificados nos Estados Unidos não sabiam ser portadores da doença anteriormente. No Baltimore Eye Survey, 56% e no Proyecto VER, 62% referiram não saber que tinham glaucoma antes de

16 participarem dos estudos (Sommer et al, 1991; Quigley et al, 2001). Dados referentes à doença no Brasil são escassos. Em estudo de Almeida et al (2001) foi observada prevalência de 1,9% em pessoas com mais de 35 anos Patogenia Em termos histológicos, o GPAA leva à perda progressiva das células ganglionares da retina e de seus axônios por apoptose (Quigley et al, 1995). A patogenia da doença não é plenamente conhecida e acredita-se que diversos fatores atuem simultaneamente no seu desenvolvimento e progressão. Vários fatores de risco foram descritos no glaucoma, como a PIO, que dentre todos é considerado o mais importante, a espessura central da córnea (ECC), hemorragia no disco óptico, relação escavação/disco, além dos fatores não oculares como a idade, a etnia, a história familiar (predisposição genética) e doenças vasculares (hipertensão arterial, vasoespasmo e hipotensão arterial noturna). Duas grandes vertentes de pensamento investigacional sugerem dois possíveis mecanismos patogênicos, a teoria mecânica e a teoria vascular. É improvável que qualquer uma das duas possa exclusivamente explicar a patogenia da doença em todos os casos. Possivelmente, ambas atuam paralelamente no desenvolvimento da doença, sendo uma delas mais intensamente em alguns casos do que a outra (Quigley, 2003) Teoria mecânica Mais de 90% do humor aquoso deixa a câmara anterior do olho pela via convencional (trabecular). O humor aquoso atravessa as três partes do trabeculado, a saber, corneoescleral, uveal e justacanalicular. Após atravessar a parede do canal de Schlemm, por mecanismo ainda não completamente esclarecido, o humor aquoso é conduzido pelos canais coletores até as veias aquosas, parte do sistema venoso episcleroconjuntival. O ponto de maior resistência à drenagem do humor aquoso, tanto nos indivíduos normais como nos glaucomatosos é a parede interna do canal de Schlemm-trabeculado justacanalicular. Não se sabe, entretanto, porque a resistência à drenagem do humor aquoso aumenta no GPAA (Allingham et al, 2005). De qualquer modo, segundo a teoria mecânica, a PIO exerce força na lâmina crivosa, levando a seu abaulamento posterior e consequente pinçamento dos axônios e da

17 neuroglia na cabeça do nervo óptico. Desta forma, o fluxo axoplasmático retrógrado e anterógrado das fibras ganglionares da retina fica interrompido levando à morte celular. O efeito deletério da PIO é mais intenso nas porções superior e inferior do disco óptico, regiões estas que apresentam menor densidade de fibras colágenas e assim mais sensíveis ao aumento da PIO (Quigley et al, 1985) Teoria vascular É grande a suspeita entre investigadores de que a isquemia inicia ou participa de alguma forma na lesão glaucomatosa do disco óptico. A teoria vascular considera que o GPAA ocorre por insuficiência circulatória no disco óptico (Chun et al, 1999). O fluxo sanguíneo em qualquer tecido é resultado da pressão de perfusão (pressão arterial menos pressão venosa) e da resistência ao longo da via entre artérias e veias. Quando a pressão venosa no disco óptico excede a PIO, a pressão de perfusão intraocular é reduzida. Mesmo em olhos normais, a PIO exerce impacto na pressão de perfusão e a nutrição é mantida somente através da auto-regulação, ou seja, este é um fenômeno fisiológico em que a resistência altera-se de forma dinâmica de modo a manter o fluxo sanguíneo em nível constante para as atividades metabólicas apesar de quaisquer alterações na pressão de perfusão. Assim, a isquemia pode ocorrer no glaucoma se a auto-regulação estiver prejudicada em um paciente, seja por deficiência inata ou, talvez, resultante de doença vasoespástica. A auto-regulação também pode estar prejudicada se outra doença (por exemplo, um ateroma) tenha causado uso além da capacidade auto-regulatória, de modo que pouco ou nada possa ser utilizado para corrigir um insulto adicional provocado pela elevação da PIO. Além disso, a isquemia pode resultar também de oclusões microvasculares provocadas por anormalidades plaquetárias ou na coagulação, talvez induzindo a uma forma de neuropatia óptica glaucomatosa independente da elevação da PIO (Anderson, 1999) Antecedente familiar Diferentes estudos populacionais avaliaram a importância do antecedente familiar para glaucoma no risco de desenvolvimento da doença. O Baltimore Eye Survey observou que 16% dos pacientes com GPAA referiram antecedente familiar positivo para a doença,

18 comparados com 7,2% dos indivíduos controle. O risco relativo para desenvolvimento de glaucoma foi em média, de 2,85, sendo de 3,69 para irmãos e 1,12 para os filhos de glaucomatosos (Tielsch et al, 1994). No Barbados Eye Study, o risco relativo para aparecimento de GPAA foi de 2,43 para os indivíduos com história familiar positiva para glaucoma, alcançando o valor de 7,88 para os indivíduos do sexo masculino (Leske et al, 1995). Posteriormente, Wu e Leske (1997) observaram associação positiva entre PIO mais elevada e história familiar positiva. Wolfs et al (1998), estudando a população de Rotterdam, determinaram um risco relativo de 9,2 para o desenvolvimento da doença. A importância da história familiar positiva no desenvolvimento do glaucoma foi estudada no Blue Mountain Eye Study. Dos 323 indivíduos com história familiar positiva, 18 (5,57%) apresentavam glaucoma e 32 (9,90%) hipertensão ocular. Considerando as 3331 pessoas sem antecedente familiar para o glaucoma, 90 (2,7%) apresentavam a moléstia e 128 (3,84%) apresentaram diagnóstico de hipertensão ocular (Michell et al, 1999). Estudando populações de gêmeos monozigóticos e dizigóticos, Kalenak, Paydar (1995) observaram que a média de variação da PIO entre os pares de gêmeos monozigóticos era menor que a média de variação da PIO entre os pares de gêmeos dizigóticos, sugerindo que fatores hereditários possam estar envolvidos na determinação da PIO. Teikari et al (1987) avaliaram a ocorrência de glaucoma em dois pares de gêmeos monozigóticos. No primeiro par, os dois irmãos apresentavam GPAA, ao passo que no segundo, um dos irmãos apresentava GPAA e o outro tinha PIO elevada sem lesão de nervo óptico ou defeito de campo visual. Os mesmos autores avaliaram a concordância de diagnóstico entre gêmeos monozigóticos e dizigóticos com GPAA na Finlândia. Analisando banco de dados epidemiológicos governamentais sobre pares de gêmeos e pacientes que tinham assistência ao tratamento pelo estado, o autor observou maior concordância de diagnóstico de GPAA envolvendo pares monozigóticos sugerindo que fatores genéticos tenham seu papel no desenvolvimento da moléstia (Teikari et al, 1987) Quadro clínico e qualidade de vida O GPAA na fase inicial não causa qualquer sintoma aos portadores. Com a progressão da moléstia, ocorre a perda periférica do campo visual. Mesmo nesta fase, uma vez que funcionalmente o campo visual do olho direito sobrepõe-se ao campo visual do

19 olho esquerdo e vice-versa, o paciente raramente percebe alguma limitação na visão. Somente nas fases mais tardias, com a constricção do campo de visão e eventual acometimento da visão central (10 centrais do campo visual) o paciente pode referir diminuição da acuidade visual (Rivera et al, 2008). A auto-percepção do paciente em relação à sua saúde também é seriamente comprometida nos pacientes glaucomatosos. A qualidade de vida foi avaliada por Cypel et al (2004) por meio do Medical Outcome Study 36-item short-form Survey, em pacientes com diferentes tipos de glaucoma (inclusive GPAA). Os autores observaram que os pacientes com glaucoma apresentam pior estado funcional e pior sensação de bem estar do que indivíduos não glaucomatosos Diagnóstico O diagnóstico do glaucoma baseia-se eminentemente na medida da PIO, na avaliação do DO e da camada de fibras nervosas da retina (CFNR) e na avaliação do campo visual Medida da pressão ocular Como referido anteriormente, PIO é considerada, no conceito moderno do GPAA, um fator de risco para o desenvolvimento da doença. Isto porém, não diminui sua importância na propedêutica do glaucoma, uma vez que até agora, é o único fator de risco controlável e sua redução é a única modalidade terapêutica eficaz para se impedir a progressão da doença Tonometria de aplanação de Goldmann e paquimetria A tonometria é um método pouco eficaz para o diagnóstico do glaucoma (Mundorf et al, 1989). No entanto, é um exame fundamental para o acompanhamento dos pacientes glaucomatosos e para a avaliação da eficácia do tratamento hipotensor ocular. A tonometria de aplanação de Goldmann (TAG) ainda é o exame utilizado na prática clínica diária e nos ensaios clínicos. É baseada no princípio de Imbert-Fick que define a pressão no interior de uma esfera de paredes infinitamente finas como a força necessária para aplanar sua superfície dividida pela área de aplanação. A TAG é influenciada por um número de

20 variáveis do tecido corneal, como sua curvatura, espessura e astigmatismo. Em córneas com astigmatismo acima de 3 dioptrias as medidas com o tonômetro de Goldmann podem ser imprecisas e a PIO fica hipoestimada em córneas relativamente finas, bem como falsamente superestimadas nas córneas mais espessas. Neste contexto, a paquimetria, ou medida da ECC assume grande importância. De fato, o Ocular Hypertension Treatment Study (OHTS) determinou que a ECC menor que 555 µm é um fator de risco independente para a conversão da hipertensão ocular em glaucoma (Gordon et al, 2002). Esta observação pode ser interpretada de modo simples como a influência da ECC na medida da PIO com a TAG. De qualquer forma, a paquimetria para determinação da ECC é importante nos pacientes com hipertensão ocular para se avaliar o risco de desenvolvimento de glaucoma e evitar o tratamento desnecessário em pacientes com baixo risco. A determinação da ECC é importante tambem naqueles pacientes com tecidos mais finos e cuja medida da PIO pela TAG é subestimada. Pacientes que apresentam sinais de progressão da doença e PIO aparentemente normal ou controlada podem na verdade, ser pacientes com córneas finas que tem valores de PIO subestimados pela TAG. Embora não exista um nomograma absolutamente preciso para se corrigir as medidas da PIO pela TAG em função do desvio da ECC do seu valor médio, a incorporação da paquimetria na semiologia do glaucoma auxilía o raciocínio clínico e ajuda a quantificar a diminuição relativa da PIO em casos específicos Histerese da córnea e Ocular Response Analyzer (ORA) As propriedades biomecânicas da córnea incluem, além da sua espessura central, as propriedades materiais do tecido, a saber, fibras colágenas e matriz de sustentação, hidratação e a variação fisiológica provocada pela idade (a córnea tende a se tornar mais rígida com o envelhecimento). Todos estes fatores influenciam diretamente na medida da PIO pela TAG. A histerese representa uma medida mais direta das propriedades biomecânicas da córnea. O Ocular Response Analyzer (ORA, Reichert Corporation, EUA) é um novo instrumento que mede a resposta da córnea à indentação por um rápido pulso de ar. Este equipamento faz duas medidas consecutivas em menos de um segundo: primeiramente, ele mede a força na qual a córnea se achata à medida que a pressão do pulso de ar aumenta e,

21 depois, a força na qual ela volta ao normal quando a pressão do pulso de ar diminui. Devido às propriedades biomecânicas da córnea, ocorre diferença entre a primeira aplanação e a segunda resultando em duas diferentes medidas de pressão. A diferença entre estes dois eventos é a medida da histerese da córnea. O ORA corrige a medida da PIO pela histerese da córnea e, teoricamente, uma medida mais precisa da PIO (ElMallah, Asrani, 2008). A medida objetiva da histerese da córnea abre a perspectiva de medidas mais precisas da PIO. Este método, porém, necessita de maior comprovação científica bem como a própria histerese precisa ser melhor entendida Tonometria com o Pascal Dynamic Contour O tonômetro Pascal é um tonômetro digital que mede a PIO e a amplitude do pulso ocular. O aparelho não é baseado na tonometria de aplanação, mas no princípio de que a força aplicada na face interna da córnea pela PIO é igual à força da pressão medida na sua superfície externa quando o tecido se encontra em estado neutro (sem a ação de forças tangenciais). O tonômetro é composto por um sensor de pressão sólido montado dentro de uma sonda que é aplicada na superfície da córnea. Ao tocar a córnea durante a medição, a PIO é detectada 100 vezes por segundo; as medidas são digitalizadas e guardadas na memória do aparelho. Um microprocessador determina a PIO e as flutuações pulsáteis causadas pelos batimentos cardíacos (amplitude do pulso ocular). A ponta da sonda foi projetada de modo a causar mínima deformação na córnea. Acredita-se que as medidas da PIO com este tonômetro sejam menos influenciadas pela biomecânica da córnea (Francis et al, 2007) Avaliação do disco óptico e da camada de fibras nervosas da retina A semiologia estrutural do glaucoma inclui métodos qualitativos para avaliação do disco óptico (DO) da camada de fibras nervosas da retina (CFNR) e métodos quantitativos para avaliação do DO e da CFNR peripapilar. Os axônios das células ganglionares da retina são as primeiras estruturas oculares a sofrerem o dano glaucomatoso. De fato, muitos pacientes podem ser diagnosticados pela observação cuidadosa do DO, sem a confirmação do correspondente dano funcional (glaucoma pré-perimétrico). Por isso é importante o

22 estudo detalhado do disco óptico, conhecer sua anatomia biomicroscópica e variações não glaucomatosas do padrão normal Avaliação qualitativa do disco óptico e da camada da fibras nervosas da retina Os métodos qualitativos de avaliação do DO são realizados com a utilização do oftalmoscópio direto ou através da biomicroscopia de fundo com lente de Volk de 78 D ou 90 D. A documentação das características do disco óptico ao longo do tempo é muito importante. Antigamente, a documentação era feita com lápis colorido e desenhos das papilas, mas foi substituída pelas fotografias estereoscópicas seriadas que são uma forma útil de avaliar alterações do DO no seguimento dos pacientes com glaucoma. Os sinais característicos observados na biomicroscopia da papila descritos na literatura incluem: assimetria de escavação entre ambos os olhos, atrofia setorial da camada de fibras nervosas da retina (sinal de Hoyt), defeito localizado da rima neural (notch), aumento concêntrico da escavação, aumento vertical da escavação, discrepância palidez-escavação (escavação pintada de rosa), escavação nasal, desnudamento de vaso circunlinear, vaso em passarela, vaso em baioneta e hemorragia do disco (Caprioli, 2001). Muitos destes sinais são, por si mesmos, suficientes para o diagnóstico da neuropatia óptica glaucomatosa. Entretanto, todos estes sinais são qualitativos sendo difícil a avaliação da progressão da neuropatia através do aumento da escavação ou da atrofia da CFNR baseados na fotografia do DO Avaliação quantitativa do disco óptico e da camada da fibras nervosas da retina Os equipamentos que avaliam de forma objetiva parâmetros estruturais do DO e da CFNR foram uma adição útil na semiologia do glaucoma. Estes aparelhos utilizam tecnologias como a oftalmoscopia confocal a laser, a tomografia de coerência óptica e a polarimetria de varredura a laser que serão descritas brevemente a seguir Oftalmoscopia confocal a laser A oftalmoscopia confocal a laser (HRT II, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha) fornece uma imagem topográfica tridimensional da cabeça do nervo óptico

23 construída a partir de uma série de imagens seccionais de vários planos focais. Cada imagem contem 256 x 256 pixels e cada pixel representa a altura da retina naquela localização em relação ao plano de referência. Trinta e dois cortes coronais são obtidos em intervalos de 3,5 mm. Além da imagem colorida da topografia da cabeça do nervo óptico, medidas da área e volume da escavação, área e volume da rima neural são fornecidas. O contorno da imagem do DO é desenhada pelo próprio examinador. A diferenciação entre glaucoma e normal pode ser realizada utilizando a Moorfields regression analysis que está impressa no próprio exame (Stouthidis, Garway-Heath, 2008) Tomografia de coerência óptica A tomografia de coerência óptica (Optic coherence tomography ou OCT, Carl-Zeiss Meditec, Dublin, Califórnia, EUA) é aparelho com tecnologia que provê imagens em cortes seccionais da cabeça do nervo óptico de alta resolução (7 µm) utilizando uma fonte de luz de diodo. O feixe de luz é escaneado transversalmente através do olho semelhante ao que ocorre no ultrassom, de modo a produzir imagens transversais do tecido em estudo. Para a análise específica do glaucoma, o OCT fornece cortes lineares do DO e cortes circulares ao seu redor para análise da CFNR peripapilar. O corte circular ao redor do DO tem diâmetro de 3,37 mm e fornece uma medida da espessura da CFNR. A medida é apresentada para cada quadrante e para cada setor de 1 hora nos 360. Eventuais defeitos focais da CFNR podem ser detectados, medidos e comparados com avaliações posteriores. Os parâmetros inferior average e average thickness parecem ser os mais específicos para se diferenciar os indivíduos normais dos glaucomatosos (Chang, Budenz, 2008) Polarimetria de varredura a laser A polarimetria a laser (GDx, Carl-Zeiss Meditec, Dublin, Califórnia, EUA) provê avaliação quantitativa da CFNR peripapilar por meio de uma fonte de luz laser de diodo polarizada (780 nm). A distribuição paralela da CFNR em forma de microtúbulos produz uma birrefringência linear de modo que alterações na polarização podem ser medidas quando a luz atravessa o tecido. A alteração na polarização do feixe de luz (retardo) é proporcional à espessura do meio birrefringente e computado pelo equipamento como

24 índice de espessura da CFNR. Na sua versão mais atualizada, o GDx VCC (variable corneal compensation), analisa a polarização da córnea que é calculada individualmente para cada paciente e proporciona uma avaliação mais precisa. Uma atualização do software (GDx ECC, enhanced corneal compensation) permitiu a melhora da qualidade das imagens de modo que os padrões de birrefringências atipícos relacionados à idade e a miopia tornaram-se menos frequentes. Dentre todos os índices fornecidos pela análise do aparelho, o NFI (nerve fiber indicator) parece ser o mais sensível e específico para o diagnóstico de glaucoma (Lemij, Heus, 2008) Avaliação do campo visual A semiologia funcional do glaucoma é realizada pela avaliação do campo visual (perimetria) por meio de exames seletivos e não seletivos quanto ao subtipo de célula ganglionar da retina. A perimetria computadorizada acromática convencional é o exame mais utilizado tanto para o diagnóstico como acompanhamento do glaucoma e serve ainda para determinar a gravidade da doença. A perimetria computadorizada é um exame psicofísico subjetivo e, por isso, é influenciado pela atenção do paciente (O Brien, Wild, 1995). Os defeitos perimétricos no glaucoma por serem tipicamente secundários à defeitos da CFNR, apresentam particularidades que ajudam a diferenciar o glaucoma de outras doenças. Os defeitos quase sempre são localizados nos 30 o centrais, iniciam-se do lado nasal, respeitam o meridiano horizontal no aspecto nasal do campo visual e, em geral, os defeitos são localizados (Caprioli et al, 1987) Perimetria acromática convencional A perimetria convencional é o exame mais utilizado na prática clínica. Não é útil para o diagnóstico precoce da doença mas é o principal exame funcional para o seguimento de pacientes glaucomatosos. Este exame pesquisa o limiar de sensibiliade para cada ponto específico do campo visual e é inespecífico quanto ao subtipo de célula ganglionar da retina. Os campímetros Humphrey (Carl-Zeiss Meditec, Dublin, Califórnia, EUA) e Octopus (Haag-Streit, Suiça) são os mais utilizados nos ensaios clínicos e os programas central 24-2 e SITA 24-2 do campímetro Humphrey são os de preferência. A estratégia

25 SITA foi desenvolvida com o objetivo de reduzir o tempo de realização do exame sem prejuízo na sua sensibilidade (Bengtsson et al, 1997). Esta, praticamente, substituiu a estratégia convencional na prática clínica. A estratégia TOP é o equivalente SITA do perímetro Octopus. Para a interpretação dos resultados do exame de campo visual, utilizam-se critérios específicos de anormalidade. Os critérios definidos por Anderson (1992) são os mais utilizados na prática clínica [quadro 1]. Caprioli (1991) definiu outros critérios baseados no gráfico de total deviation para o programa central Estes mesmos critérios podem ser utilizados na estratégia SITA, substituindo-se o índice CPSD pelo PSD (Takahashi, Kasahara, 2008). A aplicação de qualquer destes critérios sugere a presença de defeito glaucomatoso, porém, o bom senso clínico irá diferenciar o defeito de fato de possíveis artefatos. Quadro 1. Critérios de Anderson para defeito glaucomatoso mínimo. 3 ou mais pontos adjacentes com p < 5% no pattern deviation, um deles com P < 1% GHT outside normal limits CPSD com P < 5% Na perimetria convencional, o estímulo luminoso apresentado durante o exame tem o tamanho III de Goldmann. Recentemente, Mattos et al (2008) observaram que diminuindo o tamanho do estímulo (tamanho I de Goldmann; 0,25 mm 2 ) o exame perimétrico torna-se mais sensível para o diagnóstico funcional precoce do glaucoma. A perimetria computadorizada é utilizada também para a avaliação da progressão do dano funcional dos pacientes glaucomatosos. O defeito glaucomatoso pode progredir com o aumento da extenção do defeito inicial, piora da profundidade (diminuição do limiar de sensibilidade) do defeito inicial ou com o aparecimento de um defeito em outra região do campo visual (Mikelberg, Drance, 1984). A análise de progressão funcional do glaucoma é difícil pela própria subjetividade do exame e, por isso, a progressão deve ser sempre confirmada por dois ou três exames consecutivos. O perímetro Humphrey oferece programas específicos para análise de progressão como o Glaucoma Change Probability e o Glaucoma Progression Analysis, que é específico para a estratégia SITA. Outra forma de

26 se avaliar a progressão é pela análise ponto-a-ponto. Neste método, a progressão é definida pela piora em dois pontos contíguos ou adjacentes ao defeito inicial em 10 db (Schulzer, 1994). A frequência com que se realizam os exames de campo visual varia conforme a gravidade da doença mas, em geral, dois a três exames por ano são suficientes nos pacientes relativamente estáveis e nos estadios iniciais. Para os casos mais graves e nos casos de suspeita de progressão, exames adicionais devem ser realizados Perimetria azul-amarelo A perimetria azul-amarelo ou perimetria de ondas curtas (SWAP) foi desenvolvida para antecipar o diagnóstico funcional precoce do glaucoma. O exame utiliza um estímulo azul que é projetado sobre a cúpula iluminada em amarelo. O SWAP está disponível tanto nos campímetro Humphrey como Octopus. Este método perimétrico pesquisa especificamente a sub-população de células ganglionares biestratificadas B-Y (Johnson, 2002). Acredita-se que seja capaz de detectar o dano funcional até 5 anos antes que a perimetria convencional e a progressão pode ser observada mais precocemente (Johnson, 1993). Para a interpretação dos resultados da SWAP pode-se utilizar critérios específicos, como os critérios de Polo et al (2001) [quadro 2]. A interpretação do exame nos casos iniciais pode ser mais precisa pela análise do gráfico pattern deviation, e dos índices PSD e GHT. Quadro 2. Critérios de Polo para defeito glaucomatoso na SWAP. 4 ou mais pontos no total deviation com P < 5% 3 ou mais pontos no total deviation com P < 1% A SWAP apresenta algumas desvantagens. É um exame demorado que leva de 14 a 18 minutos em média para ser realizado; o que foi resolvido com o SITA-SWAP, a versão mais recente do exame que utiliza a estratégia rápida com acentuada redução no tempo de exame. A variabilidade inter-teste (longterm flucutation) também limita seu uso rotineiro.

27 Além disso, o exame é sensível a alterações na densidade do cristalino sendo impreciso nos pacientes com catarata (Johnson, 2002) Perimetria de dupla fequência A perimetria de dupla frequência (FDT) é baseada no princípio da dupla frequência, i.é, a alternância de barras escuras e claras dão a impressão de ter o dobro do número de barras quando apresentadas em baixa frequência espacial e alta frequência temporal. É um fenômeno mediado pelas células ganglionares My que correspondem a 15 % das células ganglionares da retina e apresentam a propriedade de resposta não linear (Johnson, 2002). O FDT Visual Field Instrument (Carl Zeiss Meditec, Dublin, Califórnia, EUA) oferece os programas full-threshold e screening para a pesquisa da sensibilidade ao contraste nos 20 0 ou 30 0 centrais. É um exame rápido e pode ser realizado com a correção óptica do próprio paciente. Para a interpretação dos resultados do exame pode-se estabelecer como critério diagnóstico a presença de uma única área com P < 5% (mais sensível e menos específico) ou duas áreas adjacentes com P < 5% (menos falsos positivos). É um exame utilizado no diagnóstico funcional precoce do glaucoma e, em comparação com a SWAP, é mais sensível nos casos de glaucoma pré-perimétrico (Bowd et al, 2001). A versão mais recente do aparelho, o FDT Matrix, apresenta estímulos menores e, consequentemente, mais áreas do campo visual podem ser estudadas. Entretanto, a possível superioridade desta nova versão ainda precisa ser comprovada Perimetria flicker Este método de avaliação funcional mede a frequência de fusão crítica (FFC) em diferentes pontos do campo visual. A FFC é a frequência máxima que um estímulo luminoso que pisca funde-se em um aparente estímulo luminoso contínuo (Weijland et al, 2004). O perímetro (Octopus) apresenta um estímulo luminoso de contraste fixo e, durante o exame, a frequência com que este pisca é aumentada. O paciente é instruído a responder se percebe o estímulo como uma luz que pisca ou como uma luz que aparece de forma contínua. Nos estádios iniciais do glaucoma, uma pequena diminuição no limiar de sensibilidade corresponde a uma importante perda da FCC. Portanto, a perimetria flicker é

28 mais sensível no diagnóstico precoce da doença. Outra vantagem deste método é que este não sofre influências das opacidades dos meios ópticos Avaliação do seio camerular (Gonioscopia) A gonioscopia é o exame que avalia a amplitude e as características do seio camerular, i.é., o ângulo formado entre a face anterior da íris e o endotélio da córnea. Nesta região do olho encontram-se as estruturas que formam o sistema de drenagem do humor aquoso. O exame gonioscópico é fundamental para diferenciar os glaucomas de ângulo aberto dos glaucomas de ângulo estreito. Os tecidos observáveis à gonioscopia num seio camerular aberto e normal são a linha de Schwalbe, o trabeculado pigmentado, o esporão escleral, a sombra do músculo ciliar e a raíz da íris (Allingham et al, 2005). O exame deve ser realizado com lentes específicas para gonioscopia, pois os raios luminosos proveniêntes do ângulo da câmara anterior são refletidos internamente por excederem o ângulo crítico da interface corneal de 46. Dois tipos de lentes podem ser usadas: direta e indireta (Allingham et al, 2005) Gonioscopia direta As lentes de gonioscopia direta são lentes côncavas de 50 dioptrias que permitem a observação simultânea dos dois olhos para comparação (aplicando-se uma lente em cada olho). As lentes de Koeppe, Worst, Barkan são exemplos de lentes utilizadas para gonioscopia direta (Allingham et al, 2005) Gonioscopia indireta As lentes de gonioscopia indireta neutralizam o poder dióptrico da córnea e refletem, por meio de espelho, os raios luminosos, em ângulo reto, gerando imagem invertida. As lentes de Goldmann e Magnaview são as mais utilizadas e permitem excelente imagem do seio camerular. As lentes de Zeiss e Sussman têm diâmetro menor e, por isso, permitem a indentação da córnea (gonioscopia dinâmica), o que permite diferenciar o ângulo estreito por aposição da íris das goniossinéquias (Allingham et al, 2005).

29 Biomicroscopia ultrassônica (UBM) A UBM (Paradigm Medical Industries Inc., Salt Lake City, Utah, EUA) utiliza sonda com frequência de 50 MHz com profundidade de penetração de 5 mm e fornece imagens com resolução tissular de 50 µ. O exame é realizado com técnica de imersão; a sonda necessita de solução salina como meio de contato e as imagens em tempo real são observadas num monitor. A estrutura mais importante para avaliação e orientação no seio camerular é o esporão escleral, visível como o ponto mais anterior e interno na linha que separa a esclera do corpo ciliar. A técnica é utilizada no glaucoma para se avaliar o seio camerular, principalmente nos casos de bloqueio pupilar, síndrome da íris em plateau, glaucoma malígno e glaucoma traumático. A UBM não substitui a gonioscopia, porém, é um método objetivo e permite medições específicas para avaliação do ângulo da câmara anterior (Nolan, 2008) Tomografia de coerência óptica do segmento anterior Esta técnica permite a aquisição de imagens numa frequência de oito quadros por segundo (2000 A scans por segundo) com resolução transversal de 60 µ e resolução transversal de 10 a 20 µ. Além disso, o uso de varredura óptica de largo campo (16 mm) e amplitude axial profunda (8 mm) faz com que o OCT do segmento anterior capte imagem transversal da câmara anterior em apenas um quadro. Após sua aquisição, as imagens são processadas por software específico que compensa o índice de refração entre a interface lágrima-ar e a córnea e humor aquoso para corrigir as dimensões físicas das imagens. Esta tecnologia permite que diferentes medidas oculares sejam executadas sem contato como a paquimetria, goniometria, configuração da íris e lente, bem como a documentação do resultado de cirurgias anti-glaucomatosas. Duas unidades estão disponíveis comercialmente: SL OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha) e Visante OCT (Zeiss Meditec, Jena, Germany). O OCT de segmento anterior demonstrou alta reprodutibilidade inter- e intra-observador, é tão preciso quanto a ultrassonografia e é mais confortável para o paciente (Müller, Geerling, 2008).

30 1.1.5 Tratamento O objetivo do tratamento do GPAA é preservar a função visual do paciente e manter sua qualidade de vida a um custo razoável. A qualidade de vida do paciente é influenciada diretamente, pela doença propriamente dita, também pelas drogas antiglaucomatosas (efeitos colaterais locais e sistêmicos, sua frequência de instilações) e pelo temor individual da possível cegueira a que a doença pode levar (American Academy of Ophthalmology, 2003). O único tratamento comprovadamente eficaz no glaucoma é a redução da PIO. O EMGT demostrou claramente o efeito benéfico do tratamento hipotensor ocular em pacientes com glaucoma em fase inicial (Heijl et al, 2002). Este estudo acompanhou dois grupos de pacientes com glaucoma em fase inicial; o grupo de estudo foi submetido a trabeculoplastia a laser (vide 1.4.2) e terapia tópica ocular com betaxolol e o grupo controle foi acompanhado sem nenhum tratamento. Após seguimento de seis anos, 45% dos pacientes do grupo de estudo evoluíram com progressão estrutural e/ou funcional do glaucoma comparados com 62% dos indivíduos do grupo controle. Para cada paciente é definida uma pressão alvo, i.é, o valor teórico da PIO que acredita-se ser a ideal para impedir a progressão do glaucoma no paciente específico. Seu cálculo é individual e ajustável ao longo do tratamento. Para a determinação da pressão alvo deve se considerar a idade e a expectativa de vida do paciente, o nível da PIO em que ocorreu a lesão glaucomatosa, o estádio evolutivo da doença e fatores de risco adicionais. A PIO pode ser reduzida por meio de medicamentos tópicos oculares, pelo laser e por meios cirúrgicos (American Academy of Ophthalmology, 2003) Tratamento clínico O princípio básico do tratamento clínico do glaucoma é a monoterapia, i.é, inicia-se o tratamento com uma única droga, que seja eficaz, com poucos efeitos colaterais e que possa ser instilada uma ou duas vezes ao dia. Se a resposta hipotensora for insuficiente, recomenda-se a substituição da droga de primeira escolha. Se o efeito hipotensor for adequado mas a pressão alvo não foi atingida inicia-se a associação de drogas de outras classes terapêuticas. A associação de drogas se faz até que se tenha atingido a máxima terapia clínica tolerada pelo paciente (American Academy of Ophthalmology, 2003).

31 As medicações hipotensoras diminuem a PIO por reduzir a produção do humor aquoso ou por aumentar sua facilidade de escoamento pelas vias convencionais ou não convencionais. Atualmente, existem cinco grandes classes de drogas utilizadas no tratamento do GPAA (Marquis, Whitson, 2005): Agonistas do receptor de acetilcolina (colinérgicos ou mióticos); Agonistas adrenoceptores (α-2 agonistas); Inibidores da anidrase carbônica; Antagonistas beta-adrenérgicos (β-bloqueadores); Análogos das prostaglandinas. Qualquer medicação disponível para o tratamento da neuropatia óptica glaucomatosa apresenta efeitos adversos potenciais e envolve uma medida de risco e gasto financeiro. A medicação de primeira escolha geralmente é um β-bloqueador (seletivo ou não seletivo) ou um análogo da prostaglandina tópicos. As drogas de segunda escolha incluem os agentes alfa agonistas e os inibidores da anidrase carbônica. Os agentes parasimpatomiméticos, mais comumente a pilocarpina, são consideradas opções de terceira linha (Lee, Higginbotham, 2005). As medicações de segunda escolha também são eficazes em promover redução adicional da PIO nos pacientes não controlados com monoterapia (uma única medicação). A introdução de novas classes de medicações hipotensoras (α-2 agonistas, inibidores da anidrase carbônica e análogos das prostaglandinas) na última década contribuiu para uma mudança no padrão de prescrição médica. O número de combinações de tratamento medicamentoso possível aumentou proporcionalmente. Webers et al (2008) revisaram as combinações de duas, três ou quatro medicações para apresentar evidências científicas da eficácia hipotensora das opções medicamentosas na situação em que a droga de primeira escolha tenha sido eficaz mas, redução adicional da PIO é necessária. Revisão sistemática da literatura inicialmente revelou 2729 artigos. Após processo de seleção criterioso, 42 estudos foram considerados elegíveis para inclusão. Alguns artigos foram excluídos quando o objetivo primário do estudo não era a PIO. Adicionalmente, estudos que relatassem resultados de monoterapias também foram excluídos. A grande maioria dos braços de estudo relataram combinações de um β-bloqueador com inibidor da anidrase carbônica ou combinações de um β-bloqueador com análogo da prostaglandina. Para

32 grande número de combinações, nenhum estudo elegível estava disponível nem puderam ser incluídos. A revisão demonstrou que a combinação de drogas resulta em redução adicional da PIO. A magnitude exata desta redução adicional e os pacientes que dela se beneficiariam permanence obscura. Em muitos estudos, nenhuma informação quanto ao valor da PIO na fase de run in foi encontrada. Este tipo de informação é importante para se determinar se foram incluídos preferencialmente pacientes com PIO elevada não tratados ou pacientes não responsivos às medicações da fase run in. Outra questão que limita a interpretação é o fato de que os timepoints das medidas da PIO antes e após a introdução das medicações deveriam estar relacionados, respectivamente, com seus horários de pico de ação e de menor efeito. Além disso, as diferenças entre uso concomitante das medicações e combinações fixa de drogas também podem interferir na interpretação dos resultados (Webers et al, 2008). Como em qualquer doença crônica, o tratamento eficaz depende da minimização dos efeitos adversos da terapia concomitante ao aumento da fidelidade. A introdução de uma variedade de medicações potentes e bem tolaradas nos últimos anos permitiram aos oftalmologistas escolher um regime terapêutico individualizado para cada paciente e, portanto, tratar do glaucoma de modo mais efetivo (Marquis, Whitson, 2005) Tratamento com laser O tratamento a laser utilizado no GPAA é a trabeculoplastia. Esta técnica objetiva aumentar a facilidade de escoamento do humor aquoso pela via de drenagem convencional (trabecular). A trabeculoplastia consiste na aplicação do laser de argônio, diodo ou Q- switch 532-nm Nd:YAG na transição entre o trabeculado pigmentado e não pigmentado observado pela lente de gonioscopia indireta. Inicialmente, 180 do seio camerular é tratado. Acredita-se que a energia do laser provoque estiramento da malha trabecular e consequente aumento de seus poros. A lesão térmica das células trabeculares estimula a sua regeneração e melhora a função fagocítica com melhora na facilidade de drenagem do humor aquoso. O tratamento não é eficaz em todos os casos e, invariavelmente, após cinco anos o tratamento deve ser repetido (Stein, Challa, 2007).

33 Tratamento cirúrgico As técnicas de tratamento cirúrgico para o glaucoma compreendem as cirurgias fistulizantes (trabeculectomia e esclerotomia não-penetrante), os dispositivos artificiais de drenagem e os procedimentos ciclodestrutivos Trabeculectomia Descrita inicialmente por Cairns (1968), a trabeculectomia é a técnica de eleição no tratamento cirúrgico do glaucoma e consiste na criação de uma comunicação entre a câmara anterior e o espaço subconjuntival. A fístula criada é protegida por pequeno retalho da esclera através do qual o humor aquoso passa. Caracteristicamente, os pacientes submetidos à trabeculectomia apresentam uma vesícula na conjuntiva bulbar chamada de bolha filtrante que corresponde histologicamente ao acúmulo de humor aquoso no tecido conjuntivo. Esta técnica permite o controle adequado dos níveis pressóricos sem a necessidade do uso de medicações tópicas oculares. Entretanto, a trabeculectomia pode perder sua função ao longo dos anos devido ao constante processo cicatricial que leva ao fechamento da fístula. Com o objetivo de impedir a cicatrização e permitir a longevidade da trabeculectomia, antimitóticos como a mitomicina-c e o 5-fluorouracil são aplicados, respectivamente, no trans-operatório e no pós-operatório. As principais complicações no período pós-operatório imediato da cirurgia são câmara anterior rasa, vazamento na bolha filtrante e hipotonia ocular; as complicações tardias incluem a falência da bolha, aparecimento ou progressão da catarata e infecção da bolha filtrante principalmente nos casos de aplicação de mitomicina- C que determinam a formação de bolhas filtrantes com parede isquêmica (WuDunn et al, 2002) Esclerotomia não-penetrante Desenvolvida mais recentemente, a esclerotomia não-penetrante consiste na criação de pequena janela na membrana de Descemet da córnea por onde o humor aquoso transuda. Superiormente, um pequeno retalho de esclera guarda o espaço intraescleral que contém o humor aquoso; o líquido alí represado é drenado para o espaço subconjuntival e, em menor quantidade, para o espaço supracoroidal. A técnica é mais segura que a trabeculectomia por apresentar menos complicações no período pós-operatório precoce, porém, não se sabe se a

34 longo prazo, sua função hipotensora se perpetuará. Alguns casos podem complicar por aumento da PIO a curto prazo e a goniopunctura com Nd:YAG laser pode ser útil. A mitomicina-c também pode ser utilizada no trans-operatório (Carassa, 2008) Dispositivos artificiais de drenagem Os dispositivos artificiais de drenagem constituem-se basicamente de um tubo de silastic conectado a um prato de superfície variável. Uma vez que a ponta do tubo seja inserida na câmara anterior do olho, cria-se uma via alternativa para a drenagem do humor aquoso. Alguns dispositivos podem ser valvulados, como o tubo de Ahmed, ao passo que outros (tubos de Molteno, Suzanna e Baerveldt) necessitam da ligadura temporária na sua extremidade distal para prevenir a principal complicação, a hipotonia. Estes implantes são indicados nos casos em que houve falência de uma trabeculectomia prévia, casos de glaucoma refratário ou na inviabilidade de se fazer a trabeculectomia (Assaad et al, 1999) Procedimentos ciclodestrutivos Os procedimentos ciclodestrutivos objetivam provocar a diminuição da produção do humor aquoso pelo corpo ciliar. Inicialmente desenvolvida como técnica de criocauterização transconjuntival, os procedimentos ciclodestrutivos atualmente, são realizados quase que exclusivamente com técnicas de laser. A endociclofotocoagulação constitui-se de sonda introduzida no olho via pars plana e, através de observação vídeoendoscópica direta a energia laser é aplicada nos vários corpos ciliares. Outro método mais comum é a ciclofotocoagulação transescleral com laser de diodo. O laser é aplicado por meio de sonda específica através da conjuntiva-esclera por cerca de dois segundos. Em ambas as técnicas, a principal complicação é a hipotonia severa pela falência do corpo ciliar até a atrofia bulbar. Os procedimentos ciclodestrutivos são a última instância do tratamento cirúrgico, indicados quando todas as técnicas pregressas foram insuficientes para o controle pressórico, em olhos com baixa acuidade visual e prognóstico reservado (Lin, 2008) Bases Genéticas do Glaucoma

35 A importância da busca dos genes responsáveis pelo glaucoma Uma das principais razões pela busca dos genes responsáveis pelo glaucoma é a possibilidade de, no futuro, ser possível o desenvolvimento de métodos diagnósticos baseados em exames de DNA que possam indicar quais indivíduos estão sob risco aumentado de apresentar a doença em algum momento da vida. Como já mencionado anteriormente, um dos fatores de risco para o desenvolvimento de glaucoma é o antecedente familiar positivo da doença. Além disso, em algumas famílias é possível identificar um padrão claro de herança. Isto sugere que um ou mais genes sejam responsáveis pela predisposição à doença. A identificação destes genes permitirá que sejam desenvolvidos novos testes preditivos baseados nas possíveis mutações nos genes que resultam na doença. Estes testes permitirão que indivíduos com risco para o desenvolvimento de glaucoma sejam reconhecidos nos estádios mais iniciais da doença, antes mesmo que se observem a atrofia do DO e a perda parcial da função visual, permitindo que o tratamento seja iniciado precocemente. Outro benefício das pesquisas genéticas em glaucoma é o entendimento da patogenia da doença. Apesar da doença ser reconhecida há séculos, pouco se sabe sobre os defeitos moleculares e as reações bioquímicas anormais envolvidas no glaucoma. As enzimas e proteínas envolvidas na embriogênese do olho humano são importantes para a fisiologia do trabeculado e os possíveis defeitos nos genes codificadores destas proteínas podem exercer um papel na predisposição genética do glaucoma, especialmente naqueles casos com história familiar positiva. Será possível também que, com a identificação dos genes responsáveis pelos casos hereditários de glaucoma, as respectivas proteínas por eles codificadas sejam caracterizadas bioquimicamente e o papel desempenhado por elas na função trabecular e escoamento do humor aquoso sejam melhor compreendidos. Por último, a identificação dos genes responsáveis pelo glaucoma e a subsequente caracterização da proteína codificada pelo gene pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Se determinado gene codificador de uma enzima específica fosse considerado defectivo, terapias genéticas específicas para a inibição da atividade enzimática daquela proteína poderiam ser desenvolvidas.

36 Classificação dos genes A Organização Mundial do Genoma Humano propõe que os genes associados ao glaucoma sejam designados pela sigla GLC. Os números 1, 2 e 3 que seguem a sigla geral ( GLC ) para os glaucomas representam, respectivamente, o glaucoma de ângulo aberto, glaucoma de ângulo estreito e glaucoma congênito. Finalmente, as letras A, B, C e assim por diante, indicam o primeiro e os subseqüentes loci identificados para o tipo específico de glaucoma (Raymond, 1997). Assim, o primeiro locus identificado em associação com o GPAA recebeu o nome de GLC1A e o primeiro locus relacionado ao glaucoma congênito foi denominado GLC3A Genes relacionados ao glaucoma primário de ângulo aberto Até o momento, pelo menos 20 loci para o GPAA foram relatados. Apenas três genes causadores foram identificados: myocilin (MYOC), optineurin (OPTN) and WD repeat domain 36 (WDR36), que em conjunto, são responsáveis por menos de 10% dos casos de GPAA. Apenas uma pequena parcela segue padrão de herança mendeliana; de fato, a relativa baixa prevalência da doença contradiz o padrão simples de herança genética. Teikari et al (1990), estudaram o componente genético no GPAA em gêmeos monozigóticos e dizigóticos e sugeriram a ocorrência de padrão poligênico multifatorial (padrão complexo de herança) para a doença. Uma considerável fração dos casos de GPAA resultam de grande número de variantes em diferentes genes, cada um contribuindo com pequenos efeitos. Nos últimos 10 anos, têm sido realizados esforços para mapear os genes causadores de GPAA. Os principais métodos laboratoriais foram a clonagem funcional (o gene candidato pode ser inferido a partir do conhecimento da proteína codificada por ele), análise de ligação em famílias, estudos de associação do tipo caso-controle e análises de microarranjos (microarrays, ou seja, arranjos pré-definidos de moléculas de DNA [fragmentos de DNA genômico, cdnas ou oligonucleotídeos] quimicamente ligadas à uma superfície sólida, utilizados em ensaio de hibridização). Estudos de associação descobriram 16 genes relacionados ao GPAA, porém relatos sobre efeitos causadores de glaucoma nestes genes são muitas vezes, conflitantes. Estudos de expressão gênica por microarray relacionados ao GPAA também foram realizados. Um número de genes potencialmente relacionados ao GPAA foram identificados e podem servir de fonte para selecionar genes

37 candidatos para análise de mutações em estudos de associação. Embora os estudos de ligação sejam a maioria, a tendência atual é utilizar estudos de associação para mapear os genes do GPAA (Fan et al, 2006) O gene TIGR/MYOC O TIGR/MYOC (locus GLC1A) foi primeiro gene relacionado à doença. Diferentes autores, trabalhando independentemente e por meio de estudos de análise de ligação, identificaram o primeiro locus para o GPAA no braço longo do cromossomo 1, posteriormente denomidado locus GLC1A (Sheffield et al, 1993; Richards et al, 1994; Wiggs et al, 1994; Morissete et al, 1995; Belmouden et al, 1997). O gene associado ao locus GLC1A foi identificado por Stone et al (1997) e denominado TIGR (trabecular meshwork-induced glucorticoid response). Kubota et al (1997) isolaram um clone de cdna humano que codificava uma proteína de 55 kda, nomeando o gene responsável por ela de Myocilin (MYOC). Posteriormente, constatou-se que os genes TIGR e MYOC apresentavam a mesma sequência. A importância da proteína miocilina, codificada pelo gene TIGR/MYOC, foi reconhecida recentemente em estudo experimental por Mackay et al (2008). Os autores, por meio do corante Coomassie modificado e a técnica de Western blot (técnica para detecção de proteínas específicas separadas por eletroforese, por meio de anticorpos marcados), usaram um anticorpo miocilina policlonal anti-humana de coelho, para comparar a concentração da proteína no humor aquoso de 18 cães da raça beagle (normais, portadores genéticos e com GPAA). Os níveis de miocilina nos cães normais foram menores (0,817 unidades) do que nos portadores (3,117 unidades). Com a piora da gravidade do glaucoma, os níveis da miocilina no humor aquoso aumentavam proporcionalmente (6,097 na forma leve, 8,844 na forma moderada e 17,228 na forma grave). As comparações entre normais, portadores e todos os cães com GPAA combinados revelaram diferenças significantes (P < 0,001). Embora o papel exato dos níveis de miocilina do humor aquoso na gênese da hipertensão ocular permanença obscuro, os autores concluíram que a proteína pode afetar adversamente a drenagem do humor aquoso.

38 Região codificadora Kubota et al (1997,1998) e Nguyen et al (1998) decifraram a estrutura e as propriedades do gene TIGR/MYOC através de clones que foram obtidos, inicialmente, a partir da cultura de células da malha trabecular exposta a glicocorticóide por período de 10 dias. A análise estrutural do cdna do gene TIGR/MYOC identificou uma região de aproximadamente 20 kb, incluindo 3 exons com 606, 126 e 718 pb, respectivamente, duas regiões intrônicas com 10 e 1,5 kb e uma região promotora com 5 kb. O gene TIGR/MYOC apresenta dois possíveis sítios de iniciação de leitura (ATG) que codificam proteínas de 504 e 472 aminoácidos de extensão, respectivamente. Estas proteínas apresentam sítios de glicosilação ligados ao nitrogênio e ao oxigênio, sítios de ligação ao ácido hialurônico e um sítio de clivagem no exon 1 compreendendo os resíduos [Figura 1]. Figura 1. Estrutura do gene TIGR/MYOC (região intrônica, promotora e os três exons) e os possíveis mecanismos para a formação de produtos. Diferentes traduções do RNAm do gene TIGR/MYOC: (a) quando o primeiro ATG é traduzido a proteína apresenta 504 aa; (b) a proteína traduzida a partir do sítio de clivagem do exon 1 apresenta 472 aa; (c) proteína glicosilada (o contorno pontilhado indica a forma com 504 aa). A região preenchida em cor preta corresponde ao domínio da olfactomedina e a região preenchida em cor azul corresponde ao zíper de leucina (Modificado a partir de Nguyen et al, 1998).

39 Uma particularidade desta molécula é a presença de um zíper de leucina no exon 1 e de uma região codificadora homóloga à olfactomedina no exon 3 [Figuras 1 e 3]. A região codificadora do gene TIGR/MYOC apresenta dois domínios principais, a saber, um no exon 1 na porção amino-terminal e outro no exon 3 na porção carboxi-terminal. O primeiro domínio é o da miosina com 29,9% de identidade (seqüência idêntica 20/67 aa) com a cadeia pesada da miosina do Dictyostelium discoideu e 32 aminoácidos adicionais apresentando substituições conservativas, totalizando 77,6% (52/67) de homologia. Este domínio contém o zíper de leucina (entre os aa 71 e 152) dividido em duas sub-regiões (71-85 e ). A cada sete posições aparecem os resíduos de leucina [Figura 2], que podem ajudar na formação de polímeros (estrutura enovelada). Figura 2. Zíper de leucina, configuração helicoidal. Os resíduos de arginina (R) e leucina (L) estão salientados. (Sarfarazi, 1997). O segundo domínio é o da olfactomedina, localizado no exon 3 na região carboxiterminal. Este domínio apresenta identidade de 31,3% (56/179 aminoácidos) com a olfactomedina do sapo boi e outros 83 aminoácidos correspondendo a substituições conservativas, alcançando uma homologia de 77,7% (Kubota, 1997) [Figuras 1 e 3]. A olfactomedina está presente na matriz extracelular do neuroepitélio olfativo e tem a

40 capacidade de polimerizar-se através de pontes dissulfeto. Esta característica é decorrente da propriedade do aminoácido cisteína [Figura 1]. Figura 3. Regiões homólogas à miosina (exon 1) e à olfactomedina (exon 3). A porção preenchida corresponde à região do zíper de leucina. (Modificado de Sarfarazi, 1997). Além disso, outros sítios foram identificados na estrutura do gene TIGR/MYOC: fosforilação da proteína quinase C nos resíduos (Thr-Leu-Arg), ligação de glicosaminoglicanas nos resíduos (Ser-Gly-Glu-Gly), fosforilação da proteína quinase II entre os aminoácidos (Thr-Asp-Ile-Asp) e o sítio para proteína quinase dependente do AMPc nos resíduos com a Ser 425 como substratato da fosforilação (Rosza et al, 1998) Região Promotora Foi identificada uma região de 5 kb (a montante) como a região promotora, considerada responsável por modular o processo de transcrição do gene TIGR/MYOC (Nguyen et al, 1998; Adam et al, 1997). Esta região apresenta as seguintes sequências reguladoras: sítios de iniciação à montante: TATA box (entre 20 e 30 pb à montante do sítio de iniciação) e CAT box; elementos de resposta a sinais hormonais tais como glicocorticóides, estrogênio, progesterona e tireóide; elementos de resposta ao plasma, interferon e três sítios de ligação em potencial para ácido retinóico e vitamina D. Além disso, foram identificados elementos relacionados ao dano oxidativo, a lesões no DNA e a respostas ao calor e ao choque (Polansky et al, 1997; Nguyen et al, 1998). Sequências com função inibitória foram identificadas como o elemento repressor do

41 plasma. Kubota et al (1998) sugeriram que os elementos de resposta a glicocorticóides teriam características únicas no gene TIGR/MYOC. Ademais, este grupo de autores sugeriu que a presença de repetições de dinucleotídeos à frente destes elementos de resposta a glicocorticóides poderiam influenciar a expressão do gene TIGR/MYOC de acordo com o número de repetições encontradas, explicando a variação de sensibilidade das células da malha trabecular aos esteróides Expressão do gene Nguyen et al (1998) realizaram ensaios com imunoprecipitação usando anticorpos anti-tigr com o intuito de avaliar se a proteína codificada pelo gene TIGR/MYOC poderia apresentar-se em um meio de células trabeculares expostas à dexametasona. Os autores observaram a presença de uma glicoproteína extracelular com 66 kda de peso molecular (forma predominante), além de duas proteínas próximas aos 55 kda, representando as formas não glicosiladas de 504 e 472 aminoácidos. Além disto, identificaram também no interior das células trabeculares tratadas com a dexametasona a forma de 55 KDa em quantidade menor. Os autores sugeriram que as diversas formas descritas da proteína devem ser decorrentes de eventos ocorridos durante o processo de tradução e pós-tradução do gene TIGR/MYOC, uma vez que uma única cópia transcrita deste gene foi observada. Simultaneamente, constatou-se a formação de complexos de alto peso molecular (acima de 200 kda), sugerindo que a proteína codificada pelo gene TIGR/MYOC poderia existir na forma de polímeros. Esta característica seria possível pela presença do zíper de leucina e através do resíduo de cisteína na posição 433 no domínio da olfactomedina. A constatação de que diversos tecidos oculares expressam o gene TIGR/MYOC foi comprovada por estudos em olhos humanos utilizando análises por Western blot (Karali et al, 2000) e Northern blot (técnica para detecção de RNAs específicos separados por eletroforese, por meio de hibridização com uma sonda de DNA marcada) (Swiderski et al, 2000). No segmento anterior, observou-se a expressão do gene TIGR/MYOC no estroma corneal, no citoplasma de células endoteliais da córnea, nas células epiteliais anteriores do cristalino e no humor vítreo. Na íris, o gene TIGR/MYOC encontrou-se expresso tanto no estroma como nas células dos músculos dilatador e esfíncter da pupila. No corpo ciliar, o gene TIGR/MYOC se mostrou expresso na musculatura lisa, porém não no estroma (Karali

42 et al, 2000). O gene TIGR/MYOC também foi clonado a partir de uma biblioteca de corpo ciliar humano (Ortego et al, 1997). Na malha trabecular, o gene TIGR/MYOC mostrou-se expresso na região corneoescleral, uveal e justa-canalicular, porém não foi possível determinar se a expressão deste ocorria no meio extracelular (Karali et al, 2000), o que foi constatado posteriormente com a ajuda da microscopia eletrônica (Ueda et al, 2000). Na retina, o gene TIGR/MYOC foi clonado a partir de uma biblioteca de tecido retiniano, estando expresso na região do cílio conector das células fotorreceptoras (Kubota et al, 1997; Karaliet al, 2000; Swiderski et al, 2000). A expressão do gene TIGR/MYOC foi observada também nos astrócitos e axônios do nervo óptico (Karali et al, 2000), no tecido perivascular que circunda a artéria central da retina e na pia máter (Swiderski et al, 2000). Os autores inferiram que o gene TIGR/MYOC seria expresso não somente na malha trabecular, por onde ocorre a maior parte da drenagem do humor aquoso, mas também no nervo óptico, local do dano glaucomatoso. Em contraste, Adam et al (1997) não encontraram vestígio de RNAm do gene TIGR/MYOC no nervo óptico. O gene TIGR/MYOC mostrou-se expresso também em alguns tecidos extraoculares. Kubota et al (1997) constataram a expressão do gene na musculatura cardíaca estriada, no neuroepitélio olfatório e nas células ciliares da cóclea. Ortego et al (1997) observaram níveis detectáveis de expressão no músculo cardíaco e esquelético e não detectáveis em tecido cerebral, placenta, pulmão, fígado, rim e pâncreas. Polanski et al (1997) estudaram a regulação da expressão do gene TIGR/MYOC e, através da análise por reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa, constataram o aumento da concentração de RNAm do gene nas células trabeculares expostas a diferentes agentes, incluindo a dexametasona, H 2 O 2, acetato de tetradecanoilforbol e choque térmico. Os autores observaram ainda o aumento da concentração de RNAm em relação ao seu nível basal após exposição aos mesmos agentes. A exposição à dexametasona resultou na maior concentração após um período de 10 dias, sugerindo a participação, não apenas de estímulos hormonais, mas também do estresse oxidativo na regulação da expressão do produto do gene TIGR/MYOC. Tamm et al (1999) observaram aumento da expressão do gene TIGR/MYOC em cultura de células trabeculares após estímulo mecânico e após exposição ao fator de crescimento (transforming growth factor) TGFβ1. Outros fatores, porém, podem reduzir a

43 expressão do gene TIGR/MYOC em células trabeculares expostas à dexametasona como o fator de crescimento básico de fibroblastos (bfgf) e o hormônio da tieróide (Polansky et al, 2000). Além disto, Kirstein et al (2000) observaram que proteínas associadas ao processo de transcrição atuam facilitando o acoplamento de RNA polimerase ao DNA, contribuindo para a transcrição do gene TIGR/MYOC em células trabeculares e astrócitos. Takahashi et al (2000) observaram que o gene TIGR/MYOC encontra-se expresso na malha trabecular tanto de olhos normais como glaucomatosos (GPAA, glaucoma primário de ângulo estreito e secundário a corticoesteróides). Lütjen-Drecoll et al (1998) avaliaram a expressão da proteína codificada pelo gene TIGR/MYOC através de análise por imunohistoquímica e anticorpos policlonais e fluorescentes e observaram um aumento da fluorescência em olhos glaucomatosos (GPAA, glaucoma de pressão normal e glaucoma pseudoexfoliativo) quando comparados a olhos normais pareados por idade. Jacobson et al (2001) descreveram a redução da secreção da proteína TIGR/MYOC na malha trabecular e no humor aquoso em olhos com GPAA associado a mutações no gene GLC1A. Mertts et al (1999) avaliaram a localização intracelular da proteína codificada pelo gene TIGR/MYOC através de análise por deleções da porção amino-terminal do gene, e relacionaram a região compreendida do aminoácido 15 ao aminoácido 138 no exon 1, como responsável pela associação da proteína com os microtúbulos celulares. Ueda et al (2000) avaliando a localização da proteína codificada pelo gene TIGR/MYOC através de análise por Western blot, microscopia eletrônica e análise quantitativa por immunogold labelling (anticorpo marcado com ouro), identificaram a presença desta nas mais diferentes organelas celulares (principalmente na mitocôndria, além das vesículas citoplasmáticas, filamentos de actina, filamento intermediário e citosol) e mesmo no meio extracelular, em cultura de células e tecido trabecular humano exposto e não exposto à dexametasona. O Brien et al (2000), avaliando células endoteliais do canal de Schlemm expostas à dexametasona, constataram a presença da proteína codificada pelo gene TIGR/MYOC no complexo de Golgi. Analisando a estrutura genômica, os autores observaram que o gene compartilha regiões de homologia com proteínas associadas ao complexo de Golgi tanto na porção amino-terminal como no domínio da olfactomedina nas posições 298 (FEYDL), 369 (FPYS) e 451 (FAYD). O mecanismo segundo o qual as mutações no gene MYOC levam ao

44 desenvolvimento do glaucoma é o ganho de função. De acordo com este mecanismo, mutações podem aumentar a atividadede um determinado produto gênico, conferir uma nova atividade ao produto gênico ou levar a sua expressão inapropriada. Jacobson et al. (2001) sugerem que as mutações acarretam alterações na estrutura quaternária bem como alterações na capacidade de polimerização na proteína codificada, impedindo sua secreção para o meio extracelular da malha trabecular. Isto, por sua vez, desencadearia processo de estresse oxidativo no retículo endoplasmático rugoso e a morte da células do trabeculado e, consequentemente, à menor capacidade de drenagem de humor aquoso. Senatorov et al (2006) desenvolveram modelo genético de camundongo com GPAA por meio de expressão do gene MYOC mutado no camundongo transgênico (Tg). A mutação pontual Tyr423His, correspondente à mutação Tyr437His no gene MYOC humano e causadora de forma grave de glaucoma, foi introduzida no DNA do cromossomo artificial de bactéria contendo o gene MYOC. Tanto o tipo selvagem (Wt) como os animais Tg expressaram o gene nos tecidos do ângulo irido-corneal e da esclera. A expressão do gene MYOC mutante induziu o acúmulo da proteína no citoplasma celular e impediu sua secreção para o espaço extracelular. Os níveis de ATPase-1 estavam reduzidos no ângulo írido-corneal dos camundongos Tg comparados com os animais Wt. Os camundongos Tg demonstraram elevação moderada da PIO, perda de aproximadamente 20% das células ganglionares da retina periférica e degeneração axonal no nervo óptico. A depleção das células ganglionares foi associada ao encolhimento do núcleo e fragmentação do DNA. As alterações patológicas observadas nos olhos de camundongos Tg foram similares àquelas descritas nos pacientes com glaucoma. A expressão da miocilina nos tecidos do ângulo iridocorneal e humor aquoso foi avaliada por método immunohistoquímico e análise por Western blot nos camondongos transgênicos portadores da mutação pontual Tyr437His (Zhou et al, 2008). As células ganglionares da retina foram marcadas com ouro fluorescente. Os animais demonstraram elevação da PIO mais acentuadamente à noite e, na retina periférica, perda de 20% das células ganglionares e 55% das células ganglionares maiores, alterações estas comparáveis às observadas nos pacientes com glaucoma. Estes resultados contudo, não foram observados por outros pesquisadores. Para testar a hipótese da possível interferência do efeito dominante da molécula

45 MYOC mutante na patogenia do GPAA, Gould et al (2006) geraram em laboratório, um camundongo carreador do alelo mutante do gene MYOC, análogo a uma mutação humana que leva à forma agressiva da doença em humanos. Os autores demonstraram que a proteína mutante não é secretada no humor aquoso, antes porém, fica acumulada no ângulo írido-corneal, consistente com o comportamento de uma proteína anormalmente dobrada. Surpreendentemente, a proteína mutante acumulada não ativa a resposta da proteína não dobrada e nem leva à elevação da PIO ou glaucoma nos camundongos mais velhos. Estes dados levaram os autores a sugerir que a produção, a aparente desestrutura e a não secreção da proteína mutante não são, por sí só, suficientes para causar o glaucoma in vivo. Para avaliar os efeitos de quantidades elevadas de miocilina na dinâmica do humor aquoso em sistema in vivo, foi criado o camundongo transgênico betab1-crystallin-myoc (Tg) que expressa fortemente a proteína nos olhos (cerca de cinco vezes mais). Em estudo experimental, Paper et al (2008) usaram o camundongo Tg para avaliar a resposta dos tecidos oculares à presença de quantidades elevadas de miocilina e identificar as possíveis alterações na expressão do gene MYOC. O RNA foi isolado a partir de tecidos oculares de camundongos Tg e selvagens. Alterações nos genes foram determinadas por técnica de hibridização microarray e confirmadas por Western blot e RT-PCR (PCR quantitativa que utiliza aparelho termociclador detector de fluorescência para amplificar sequências de DNA e simultaneamente medir sua concentração). A expressão dos genes que revelaram estar diferencialmente regulados no camundongo Tg foram adicionalmente analisadas em culturas de células de trabeculado humanas tratadas com miocilina recombinante. Embora o camundongo Tg não apresentasse fenótipo típico, foi observada uma up-e-downregulation de vários genes distintos quando comparadas com os camundongos selvagens. Entre os genes que se apresentavam diferencialmente regulados estavam Wasl, Ceacam1, and Spon2, todos envolvidos na adesão celular e interações na matriz celular. Diferenças na expressão foram observadas tambem no Six1 que codifica um fator de transcrição e no Pftk1 cujo produto é a cdc2 proteína quinase. A expressão destes genes também se achavam reguladas in vitro nas céluas de cultura tratadas com miocilina recombinante. Grandes quantidades de conexina 46 e alfab-cristalina foram encontradas nos tecidos oculares dos camundongos Tg. Além disso, vários genes codificadores das proteínas oftalmomedinas demonstraram alterações distintas na expressão. A Olfml3 estava

46 significativamente downregulated, enquanto que as Lphn1, Lphn2, and Lphn3 encontravam-se upregulated. Os autores sugerem um possível papel para a miocilina na modulação da adesão celular com a possível participação de diferentes processos funcionais envolvendo outras proteínas da família da oftalmomedina. Em virtude das evidências de que vários fatores contribuem para o papel causativo de mutações do gene MYOC no glaucoma e porque níveis elevados de um mrna celular específico e proteínas podem alterar a expressão de outros genes hospedeiros, Borrás et al (2006) investigaram o efeito da superexpressão do gene no transcriptoma das células da malha trabecular de humanos. Os autores utilizaram adenovírus recombinante carregando cdna MYOC, células trabeculares humanas primárias, 300 partículas virais por célula e U133 Affymetrix GeneChips. Os resultados revelaram que 2361 dos genes (10,6%) foram alterados mais que duas vezes pela superexpressão do MYOC. Uma proporção ainda maior dos genes alterados sofreram downregulation (1412 vs. 949). Os genes upregulated potencialmente relevantes incluíram a angiopoetina 2, metaloproteinase 1 da matriz (MMP1) e a trombomodulina; entre aqueles downregulated, foram observados growth arrest specific 1, proteínas envolvidas na via de ubiquitinação (modificação pós-tradução), molécula de adesão vascular 1, colágeno tipo 1 e um dos substratos para a MMP1. Os autores concluem que os genes afetados pelo gene TIGR/MYOC podem ser mediadores candidatos para estudos futuros sobre o mecanismo de desenvolvimento do glaucoma. A expressão do gene MYOC na malha trabecular de humanos em resposta ao tratamento com acetato de triamcinolona (TA) e dexametasona (DEX) foi estudada através de microarray por Fan at al (2008). O gene MYOC revelou-se upregulated nos tecidos tratados com as duas drogas e estava principalmente associado com a resposta na fase aguda, adesão celular, ciclo celular e crescimento, ligação de íons, metabolismo, proteólise e fator de transcrição Mutações e polimorfismos O DNA humano está sujeito a diferentes tipos de alterações em sua sequência normal que são transmitidas aos descendentes e conhecidas como mutações. Em nível molecular, as mutações podem ser do tipo deleção (um ou mais nucleotídeos são eliminados da sequência), inserção (um ou mais nucleotídeos são inseridos na sequência)

47 ou substituição de bases (substiuição de uma ou grupo de bases nitrogenadas). As variações na sequência alélica são chamadas de polimorfismos quando mais de um alelo variante em um locus ocorre na população humana em frequência maior que 1% (frequência maior do que aquela que poderia ser mantida simplesmente por uma mutação recorrente). Os polimorfismos também podem ser de vários tipos, desde os SNP (polimorfismos de único nucleotídeo) até os VNTR (repetição sequencial de número variável). Desde 1997, quando mutações no gene MYOC foram identificadas como causadoras do aparecimento de glaucoma juvenil e GPAA, mais de 180 variantes foram documentadas. Aproximadamente um em cada 30 pacientes com GPAA apresentam uma mutação causadora da doença e foi demonstrado que existe correlação genótipo-fenótipo. Hewitt et al (2008) compilaram catálogo online das variantes do MYOC e seus respectivos fenótipos associados (disponível em Este banco de dados, construído usando MySQL, contém uma lista de todas as variantes identificadas, um sumário estatístico e informações fenotípicas (idade no diagnóstico, PIO, proporção de pacientes que necessitaram de cirurgia e penetrância relacionada à idade). Aproximadamente 40% das sequências variantes identificadas foram caracterizadas como causadoras de GPAA e a maioria (c. 85%) destas são mutações missense, isto é, mutações pontuais na região codificadora do gene que levam à substituição aminoácidos diferentes. Dados preliminares desta fonte online destacam a forte correlação genótipo-fenótipo associada a mutações específicas. Apesar da utilidade desta fonte, algumas citações específicas, por seu ineditismo à época ou por sua importância histórica merecem ser mencionadas e são descritas brevemente a seguir. A frequência de mutações no gene MYOC foi estudada por diversos autores. Stone et al (1997), observaram frequências de 4,4% em pacientes com GPAA e antecedente familiar positivo, 2,9% em pacientes com GPAA sem história familiar e 0,3% na população geral. Vasconcellos et al (2001), estudando pacientes brasileiros com GPAA, obtiveram frequência de mutações de 3,8%. Apesar da relativa baixa frequência de mutações no gene MYOC em pacientes com GPAA, as alterações existem em todas as populações estudadas até agora. Ao revisarem o perfil das 76 mutações descritas no gene, Gong et al (2004) concluiram que a maioria era população específica.

48 Mutações e polimorfismos na região promotora O polimorfismo MYOC mt.1 está localizado no milésimo par de bases à montante do início da sequência codificadora do gene e corresponde à substituição da base citosina (C) pela guanina (G). A relação causal entre as alterações específicas na região promotora do gene MYOC e a patogenia do GPAA ainda não está esclarecida. Alguns estudos têm sugerido que a presença de polimorfismos na região promotora pode estar associado a pior prognóstico e maior gravidade da doença. Colomb et al (2001), em estudo retrospectivo com 142 pacientes com GPAA, avaliaram a possível influência do polimorfismo bialélico -1000C>G no fenótipo da doença. As frequências dos alelos foi similar entre pacientes e controles, Entretanto, o alelo G (frequência 17,6%) estava associado a PIO mais elevada (+ 4,9 mmhg) e a dano perimétrico mais acentuado. Estas duas características eram predominantes nas mulheres. Além disso, enquanto a PIO nos não-portadores MYOC mt.1 diminuiu acentuadamente até níveis normais no período entre o diagnóstico da doença e a inclusão no estudo, sugerindo sucesso terapêutico, ela diminuiu menos nos pacientes MYOC mt.1 (+) do sexo masculino e não diminuiu nas pacientes MYOC mt.1 (+) do sexo feminino. Os autores concluem que o polimorfismo MYOC mt.1 parece ser indicador de controle insuficiente da PIO e de maior dano de campo visual em pacientes com GPAA, potencialmente devido à falta de resposta à intervenção terapêutica e sugerem que sua genotipagem poderia ajudar na seleção de paradigmas terapêuticos no controle de pacientes glaucomatosos. Polanski et al (2003) utilizaram análise time-to-event (modelo de regressão de Cox) e observaram evidências estatísticas substanciais que a variante TIGR/MYOC mt.1 (+) presente no promotor do gene, acelera a piora do aspecto do disco óptico e medidas funcionais de progressão da doença. Estas análises foram baseadas na avaliação de 147 pacientes com GPAA maiores de 35 anos com acompanhamento médio de aproximadamente 15 anos. As análises dos autores revelaram que existem efeitos independentes desta variante na progressão da doença, levando-se em consideração outros fatores de risco relevantes como a idade, história familiar, droga de escolha inical para tratamento, tratamento cirúrgico inicial, diabetes, sexo, miopia e gravidade inicial da doença. Os autores concluem que o achado do MYOC mt.1 (+) é forte marcador da

49 progressão da doença, mais do que outros fatores de risco, e sugerem que a tipagem deste genótipo é de utilidade clínica. De fato, existe um teste genético disponível comercialmente (OcuGene, InSite Vision, Inc., Alameda, CA, EUA), desenvolvido especificamente para esta variante como indicador da gravidade da doença e resistência ao tratamento. A presença deste marcador, em tese, ajudaria o oftalmologista a nortear a sua conduta nas decisões terapêuticas de pacientes com GPAA. Outros autores porém, não observaram uma associação definitiva entre a presença do polimorfismo MYOC mt.1 na região promotora do gene e a gravidade do glaucoma. Alward et al (2002) determinaram a prevalência do polimorfismo MYOC mt.1 em 779 pacientes consecutivos (652 com glaucomas de ângulo aberto e 127 suspeitos de glaucoma). As sequências codificadoras do gene MYOC e o locus MYOC mt.1 no promotor foram rastreados e as características clínicas dos indivíduos com e sem o polimorfismo foram comparadas. Variações de sequência causadoras de doença (DVC) foram encontradas em 3% da amostra. Estas variações foram encontradas nos pacientes com a maioria das formas de glaucoma de ângulo aberto estudadas. Os pacientes com GPAA que apresentavam sequências codificadoras DVCs eram clinicamente similares àqueles sem as mesmas DVCs. Os pacientes que apresentavam o raro alelo MYOC mt.1 (G) não eram diferentes em qualquer medida de gravidade da doença daqueles que apresentavam o alelo mais comum (C). Os autores concluem que testar indivíduos para a pesquisa do MYOC mt.1 aparentemente não teria valor na avaliação dos pacientes com glaucoma. Fan et al (2004) avaliaram a associação de polimorfismos na região promotora proximal de 2,5 kb em pacientes chineses com GPAA. As alterações da sequência naquela região foram rastreadas em 88 pacientes sem parentesco com GPAA e 94 indivíduos sem glaucoma com mais de 50 anos de idade. Além disso, o polimorfismo MYOC mt.1 foi avaliado em 212 pacientes com GPAA e 221 controles normais. Um total de 14 polimorfismos foram encontrados: -83G>A, -224T>C, -255T>C, -306G>A, -387C>T, C>G, -1081A>G, -1333G>A, -1340delA, -1378insT, -1422G>T, -1760insA, G>A e -2084G>T. Os polimorfismos -1340delA, -1378insT e -1422G>T eram todos homozigotos e foram observados em todos os sujeitos de pesquisa (casos e controles). Outros polimorfismos comuns foram -224T>G, -1081A>G e -2084G>T, cada um presente

50 em mais de 50% dos glaucomatosos e normais. Os polimorfismos menos frequentes foram -255T>G, -1333G>A, -1760insA e -1770G>A, todos encontrados em menos de 5% dos pacientes com glaucoma. A análise de regressão linear univariada e multivariada revelaram que nenhum dos polimorfismo estava significativamente associado com o risco de glaucoma. A análise de haplótipos não indicou qualquer associação do mt.1 com a sucetibilidade para glaucoma. Além disso, não observaram diferenças nos fenótipos de GPAA entre os diferentes genótipos de MYOC mt.1. Os autores concluem que polimorfismos no promotor do gene MYOC não estão associados com o risco de GPAA na população chinesa e não existe associação entre o MYOC mt.1 e a maior gravidade do GPAA. Özgül et al (2005) avaliaram a possível associação da variante -1000C>G do promotor do gene MYOC com GPAA e seu possível papel no fenótipo e gravidade da doença em pacientes turcos. Oitenta e oito pacientes com GPAA e 123 normais foram fenotipados por PCR. As frequências do genótipo MYOC mt.1 e dos alelos não diferiram entre glaucomatosos e normais. No grupo controle, 17,1% dos indivíduos eram portadores MYOC mt.1 (CG ou GG), comparados com 27,3% dos pacientes glaucomatosos. A odds ratio para CG foi de 1,859 (95% CI: 0,9-3,7; P = 0,084) e para GG 1,594 (95% CI: 0,31-8,13; P = 0,575). As variáveis fenotípicas (idade ao diagnóstico, idade na inclusão do estudo, PIO maxima no diagnóstico, número de medicações anti-glaucomatosas, relação E/D, mean deviation [MD] e pattern standard deviation [PSD]) não diferiram entre portadores e não-portadores. Além disso, nenhuma diferença significante foi encontrada na distribuição dos genótipos nos diferentes estádios da doença. Os autores concluem que a variante MYOC mt.1 não é fator de risco para o desenvolvimento de GPAA e nem está associada com o fenótipo e a gravidade do glaucoma. López-Martinéz et al (2007) avaliaram retrospectivamente a participação das sequências variantes dos gene MYOC na patogenia do GPAA e hipertensão ocular em pacientes espanhóis. A região promotora e três exons do MYOC foram analisadas por PCR e sequenciamento direto em 40 pacientes hipertensos oculares e 110 pacientes com GPAA. Os autores identificaram seis SNPs comuns (MAF > 5%) na região promotora do gene MYOC (-1000C>G, -387C>T, -306G>A, -224T>C, -126T>C e -83G>A), entretanto, nenhum destes polimorfismos estava associado com GPAA ou hipertensão ocular. A

51 análise de haplótipos não revelou diferenças nas frequências preditas entre casos e controles. Os autores concluem que o polimorfismo -1000C>G não está envolvido na patogenia do GPAA em pacientes espanhóis. Saura et al (2005) por meio das técnicas de PCR, análise de single stranded conformation polymorphism (SSCP) ou polimorfismo de conformaçãode DNA em fita simples, sequenciamento automático e análise de restrição, estudaram 79 pacientes com glaucoma e encontraram cinco com outras variantes na região promotora do gene TIGR/MYOC, a saber: uma transição heterozigota (-8C>T) em paciente com alta miopia, uma transversão heterozigota (-126T>G) em paciente cuja mãe era cega, duas transições heterozogotas (-77G>A e -78G>C) em paciente com história familiar de glaucoma e o polimorfismo -83G>A em dois pacientes com glaucoma e 11,9% nos indivíduos controle. Todas estas variantes foram encontradas nas regiões reguladoras do promotor e, segundo os autores, suportam a hipótese de que alterações na expressão do gene poderiam desencadear o glaucoma. Os autores propõem que as variações na sequência podem estar envolvidas na associação entre o promotor do gene e o fator de transcrição e isto, possivelmente, poderia favorecer a associação de outros fatores de transcrição que, por sua vez, poderiam operar como ativadoras ou inibidoras da transcrição, alterando a expressão do gene MYOC Optineurim, WDR36, DNA mitocondrial e outros O segundo gene identificado associado ao GPAA foi o Optineurim (OPTN) (Rezaie et al, 2002). Localizado no braço curto do cromossomo 10 (10p15-p14), o gene codifica uma proteína que parece interagir com outras proteínas durante o processo de apoptose das células ganglionares da retina, em especial com o fator de necrose tumoral alpha (TNFα) (Funayma et al, 2004). As frequências da distribuição de mutações no gene OPTN entre indivíduos glaucomatosos e normais nas diversas populações são similares com exceção da mutação M98K em chineses e japoneses e a mutação E50K em britânicos (Libby et al, 2005). O WDR36, localizado no locus GLC1G do cromossomo 5 (5q22.1), foi o último gene identificado e a mutação D658G foi relatada em família com GPAA (Monemi et al, 2005). O gene codifica uma proteína da família WD repeat domain. São regiões minimamente conservadas de cerca de 40 aa agrupados por gly-his e trp-asp (GH-WD), que

52 podem facilitar a formação de complexos multiproteicos. O papel do gene permanece obscuro, embora existam evidências sugerindo que ele atue na ativação da subpopulação de linfócitos T. Em pacientes americanos, as anormalidades no gene não foram por sí suficientes para causar GPAA, porém, ele pode ser um gene modificador de glaucoma (Hauser et al, 2006). Estudo na população alemã revelou a ocorrência de várias variantes raras causadoras de doença em pacientes com glaucoma sugerindo que o WDR36 possa ser um gene causador da doença (Pasutto et al, 2008). A variante não-sinônima p.s664l e a associação de outras duas variantes alélicas (p.i265v e c a>g) no gene WDR36 sugerem que ele esteja provavelmente envolvido na patogenia do GPAA em indivíduos japoneses (Muyazawa et al, 2007). Na população australiana, porém, a mutação D658G do WDR36 é considerada uma variante neutra (Hewitt et al, 2006). Atualmente, outros seis loci associados ao GPAA são conhecidos, a saber, GLC1B (cromossomo 2cen-q13), GLA1C (cromossomo 3q21-q24), GLC1D (cromossomo 8q23), GLC1F (cromossomo 7q35-q36), GLC1H (cromossomo 2p14-p16) e GLC1I (cromossomo 15q11-q13), este último, provavelmente relacionado à herança dominante e baixa penetrância. O estudo da genética molecular no glaucoma compreende também a pesquisa de genes envolvidos em possíveis mecanismos patogênicos relacionados à moléstia. Genes envolvidos no processo de apoptose (p53, p21, TNFα, IGF-II e OPA1) são objeto de estudos tipo caso-controle em pacientes com GPAA (Libby et al, 2005). Existem ainda estudos que pesquisam polimorfismos em genes que participam de processos neurodegenerativos, como o gene APOE (Copin et al, 2002); e estudos com genes envolvidos na homeostase do humor aquoso, em particular o sistema renina-angiotensina (gene AGTR2) e o receptor adrenérgico β2 (gene B2AR) (Lin et al, 2004; Gungor et al, 2003). Devido à baixa frequência de mutações nos genes MYOC e OPTN nos pacientes com GPAA, Abu-Amero et al (2006) estudaram o possível papel desempenhado pelo DNA mitocondrial (mt). Em 27 pacientes com GPAA, os genes MYOC e OPTN e toda a região codificadora do mtdna foram sequenciados; o conteúdo relativo do mtdna foi investigado e a função respiratória mitocondrial foi avaliada. Apenas três polimorfismos foram identificados nos genes MYOC e OPTN nos pacientes com GPAA e nos controles.

53 Por outro lado, 27 diferentes alterações não-sinônimas no mtdna foram encontradas apenas nos pacientes com GPAA (não nos controles), 22 das quais (encontradas em 14 pacientes) eram potencialmente patogênicas. A maioria das alterações na sequências do mtdna dos pacientes com glaucoma eram do tipo transversões que alteram a orientação purina/pirimidina e causam estresse oxidativo. A atividade respiratória mitocondrial média estava diminuída em 21% nos pacientes com GPAA. Os autores concluíram que o espectro de anormalidades mitocondriais nos pacientes com GPAA pode ser fator de risco para a doença e abre novas oportunidades experimentais e terapêuticas. 1.2 Justificativa Os dados da literatura em relação ao papel do polimorfismo MYOC mt.1 são controversos. Estes resultados, aparentemente conflitantes, podem ser devidos a eventuais diferenças entre as populações. Até o presente, não se realizou nenhum estudo que avaliasse o papel do polimorfismo MYOC mt.1 na população brasileira com GPAA.

54 2. OBJETIVOS Os objetivos do estudo foram: 2.1 Avaliar a frequência do polimorfismo C>G (mt.1) localizado na região promotora do gene MYOC em dois grupos de indivíduos: pacientes com GPAA e indivíduos sem glaucoma por meio do ensaio de discriminação alélica (EDA). 2.2 Investigar se a presença do polimorfismo -1000C>G na região promotora do gene MYOC pode estar associado a aspectos clínicos da doença.

55 3. CASUÍSTICA e MÉTODOS 3.1 Amostra e critérios de seleção A amostra foi composta por dois grupos, a saber, 167 indivíduos com GPAA e 130 indivíduos normais, isto é, sem glaucoma (grupo controle). Os grupos de pacientes foram provenientes dos serviços de glaucoma da Santa Casa de São Paulo e da Universidade Estadual de Campinas. Todos os candidatos ao estudo, que tinham idade superior a 40 anos, foram submetidos a avaliação oftalmológica completa incluindo a medida da acuidade visual corrigida, biomicroscopia do segmento anterior com a lâmpada de fenda (modelo BQ 900, Haag-Streit, Berna, Suíça), tonometria de aplanação de Goldmann (modelo AT 870, Haag-Streit, Berna, Suíça), gonioscopia com lente de Goldmann (modelo 905, Haag-Streit, Berna, Suíça), fundo de olho com oftalmoscopia direta e/ou biomicroscopia do disco óptico com lente de não-contato de 78 D (V78, Volk Optical Inc., Mentor, Ohio, EUA) e perimetria computadorizada com Perímetro de Dupla Freqüência (programa Screening) ou Analisador de Campo Visual Humphrey II (programa SITA standard 24-2) [Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, EUA]. O diagnóstico de GPAA foi baseado nos seguintes critérios: idade superior a 40 anos; presença de alterações características de glaucoma ao exame oftalmoscópico, a saber, aumento concêntrico da escavação, defeitos localizados na rima neural, como notch, aumento vertical da escavação e escavação nasal; medida da PIO superior a 21 mmhg sem medicação anti-glaucomatosa; medida da PIO inferior a 21 mmhg com uso de medicações anti-glaucomatosas e história pregressa de glaucoma; alterações na perimetria computadorizada com Humphrey (programa SITA 24-2), de acordo com a presença de 3 ou mais pontos adjacentes deprimidos à significância de 5% no gráfico de pattern deviation, GHT fora dos limites normais ou PSD aumentado à significância de 5% (Anderson, 1993); alterações na perimetria de dupla freqüência de acordo com a presença de dois pontos adjacentes deprimidos à significância de 5%;

56 seio camerular aberto, sendo visível o esporão escleral por ao exame gonioscópico; ausência de sinais biomicroscópicos sugestivos de qualquer tipo de glaucoma secundário. Os indivíduos do grupo controle foram recrutados por demanda expontânea e, para serem considerados normais, deveriam apresentar ao exame oftalmológico: idade superior a 40 anos; antecedentes familiares negativo para glaucoma e cegueira; medida da PIO inferior a 21 mmhg, sem medicação anti-glaucomatosa; câmara anterior profunda na periferia (pelo menos meia espessura corneal); relação escavação/disco inferior a 0,4 nos dois olhos e assimetria na relação escavação/disco inferior a 0,2; exame perimétrico com perimetria computadorizada com Humphrey ou perimetria de dupla frequência sem alterações. 3.2 Métodos laboratoriais Extração de DNA Após obtenção de consentimento formal do paciente [apêndice 3], uma amostra de sangue periférico (aproximadamente 5 ml) foi colhida em tubo estéril contendo EDTA 10% e armazenada à temperatura de 4 C por até duas semanas para a extração de DNA. Para a extração de DNA, foi utilizado o método de fenol/clorofórmio, descrito no anexo PCR (Reação em cadeia da polimerase) das amostras controle e padrão A PCR foi realizada para 10 amostras aleatórias (cinco pacientes com GPAA e cinco controles). Estas amostras, cujo genótipo foi determinado por sequênciamento direto, foram utilizadas como controles positivos na RT-PCR para o ensaio de discriminação alélica (ver ítem adiante). Desenhou-se um par de primers (iniciadores) para amplificação da região promotora do gene TIGR/MYOC compreendendo a mutação a ser investigada por meio do programa primer 3 ( A sequência do

57 primer sense foi 5 AAAGTTGCTCAAAGGCAATC3 (temperatura de anelamento de 57,0 C) e a sequência do primer antisense foi TGGTGAAATCTGGGGAACTC (temperatura de anelamento de 59,9 C), delimitando fragmento de 532 pb. Os primers foram sintetizados pela Invitrogen TM Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA). Parte da sequência promotora do gene MYOC, compreendendo o polimorfismo MYOC mt.1 foi amplificada pela PCR, utilizando-se os seguintes reagentes: 0,5 µl de cada iniciador na concentração de 20 pmoles, 2,5 µl do tampão da enzima 10X (Tris-HCl 20 mm [ph 8,4], KCl 50 mm, gelatina 0,01%), 1,5 µl de MgCl 2 50 mm, 0,5 µl da mistura de nucleotídeos 10 mm (datp, dctp, dttp, dgtp) e 0,1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), somados à 2,0 µl de DNA genômico, completando-se o volume final para 25 µl. Após testes de padronização, as amostras foram amplificadas por meio do aparelho ciclador de temperatura (MasterCycler EP Gradient S, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), de acordo com as seguintes temperaturas e duração dos ciclos: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguida de 35 ciclos a 94ºC por um minuto, 55ºC por um minuto, 72 C por um minuto, finalizando-se com uma extensão a 72ºC por 7 minutos. Finalizando, 5 µl do produto da PCR foram misturados a 1 µl do tampão de corrida 10X Blue Juice Gel Loading Buffer (Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo e observados sob iluminação UV. Os fragmentos amplificados foram comparados ao marcador Tracklt 100bp DNA Ladder (Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) Sequenciamento de DNA Após a amplificação da região promotora contendo o polimorfismo MYOC.mt1, os produtos derivados das PCRs foram purificados de acordo com o método a seguir: 5,0 µl de produto de amplificação da PCR foram adicionados a 2,0 µl da mistura de enzimas exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão ExoSAP-IT (Amersham Life Sciences, Uppsala, Suécia). A seguir as amostras foram levadas ao aparelho ciclador de temperatura por 15 minutos a temperatura de 37ºC e por 15 minutos a 80ºC. Para a reação de sequenciamento utilizaram-se de 3 a 10 ng (2,0 µl) do produto

58 purificado para um volume final de reação de 10 µl, contendo 1 µl de Big Dye Terminator Ready Reaction v3.0 (ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems Foster City, CA, EUA), 3 µl do tampão de sequenciamento 5X (Applied Biosystems Foster City, CA, EUA) e 1 µl (2,0 pmol/µl) de um dos primers (sense ou antisense) utilizados na PCR, sendo o volume final completado com água deionizada estéril. As condições da reação de sequenciamento foram: 25 ciclos a 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e 60ºC por 4 minutos. Após esta reação, as amostras foram novamente purificadas para eliminação dos nucleotídeos não incorporados, de acordo com o protocolo a seguir. Após realização da reação de sequenciamento os 10 µl do produto final foram tratados com adição de 50 µl de isopropanol 65%, permanecendo em repouso no escuro por 20 minutos e logo em seguida submetidos à centrifugação (à temperatura de 25º C, a rpm por 25 minutos). Após centrifugação, o sobrenadante foi retirado por pipetagem. Procedeu-se em seguida com a adição de 250 µl de etanol 60% e nova centrifugação (à temperatura de 25ºC, a rpm, por 10 minutos), sendo o sobrenadante novamente retirado por pipetagem. Em seguida os tubos foram levados ao banho seco a 90º C por 4 minutos para evaporação do etanol residual, permanecendo no tubo apenas o pellet do material tratado aderido à parede do tubo. As amostras foram ressuspensas em 17 µl de formamida Hi-Di (Applied BioSystems, Foster City, CA, EUA), desnaturadas à temperatura de 95ºC durante 3 minutos, colocadas em gelo e submetidas à eletroforese no analisador automático ABI PRISM 310 (Applied BioSystems, Foster City, CA, EUA). Para confirmação da região genômica analisada, as seqüências foram submetidas a buscas por similaridade, utilizandose o algoritmo de buscas Blast ( Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) Ensaio da Discriminação Alélica O ensaio de discriminação alélica (EDA) é um método laboratorial utilizado para se determinar o genótipo de amostras, baseado na análise de polimorfismo de nucleotídeo

59 único (SNP). O EDA determina se a amostra desconhecida é um homozigoto normal (tem apenas o alelo 1), homozigoto afetado (tem apenas o alelo 2) ou heterozigoto (tem tanto o alelo 1 como o alelo 2). O método EDA utiliza duas sondas fluorogênicas que permitem a detecção de produtos específicos de PCR à medida em que estes são produzidos durante a reação. As sonda de oligonucleotídeo contém um pigmento fluorescente na extremidade 5, que é o responsável por diferenciar o alelo detectado (VIC no alelo 1 e FAM no alelo 2), um pigmento quencher (que capta a fluorescência emitida pelos outros pigmentos fluorescentes) no final 3, ligado a um minor groove-binder (MGB). O MGB permite o aumento da temperatura de desnaturação durante a PCR sem aumento no tamanho da sonda permitindo o desenho de sondas mais curtas; este tipo de sonda permite uma diferença maior na temperatura de desnaturação entre sondas e consequentemente, maior acurácia na discriminação alélica. Enquanto a sonda permanence intacta, a proximidade do pigmento quencher reduz ao máximo a fluorescência emitida pelo pigmento por meio da transferência de energia ressonante fluorescente (FRET, ressonância de Förster) através do espaço. Na presença da sequência alvo, a sonda se anela a partir de um dos sítios do primer e é clivado pela atividade 5 nuclease da Taq DNA polimerase à medida em que o primer se extende. A clivagem da sonda separa o pigmento fluorescente do pigmento quencher, aumentado seu sinal e removendo a sonda da fita alvo, permitindo que a extensão do primer continue até o final da fita alvo. Assim, a inclusão da sonda não inibe o processo geral da PCR. Moléculas adicionais do pigmento fluorescente são clivadas da respectiva sonda a cada ciclo, resultando no aumento da fluorescência proporcional à quantidade de amplicons produzidos [figura 4]. Assim, os possíveis resultados do EDA são três: aumento substancial da fluorescência do pigmento VIC indica homozigosidade do alelo 1; aumento substancial da fluorescência do pigmento FAM indica homozigosidade do alelo 2; e aumento no sinal de fluorescência dos dois pigmentos indicando heterozigosidade.

60 Figura 4. Produtos de PCR e posição dos pigmentos fluorescentes Procedimentos para o EDA O primeiro passo para o ensaio de discriminação alélica é a amplificação pela PCR. A amplificação envolve a preparação da mistura de reação, o preparo da bandeja de reações ópticas e a reação de PCR propriamente dita. A mistura de reação foi preparada utilisando-se o método de adição de DNA úmido. Em tubo óptico MicroAmp (Applied Biosystem, Foster City, EUA), foi preparada solução contendo 2X Taqman Universal PCR Master Mix (6,25 µl), 20X working stock of SP Assay Mix (0,62 µl) e amostra de DNA genômico (5,62 µl). O Universal Master Mix combina todos os componentes necessários para se realizar o ensaio 5' nuclease com as sondas TaqMan e contém 250 U de AmpliTaq Gold DNA Polymerase, 100 U de AmpErase UNG, dttp, datp, dctp, dgtp, 10X TaqMan Buffer A, 25 mm de MgCl 2 em solução. O working stock of SP Assay Mix contém um par de primers (sense e antisense) uma sonda marcada com pigmento VIC e uma sonda marcada com pigmento FAM. Os primers e as sondas foram desenhadas conforme orientação do serviço SNP assay-by-design da Applied Biosystem ( O volume final de reação para cada tubo foi de 12,5 µl. Todos os reagentes foram fabricados pela Applied Biosystems (Foster City, EUA). As reações foram realizadas em duplicata, ou seja, para cada amostra de DNA genômico foram preparados dois tubos com a mesma reação. Os tubos ópticos cotendo as misturas de reações de cada amostra dos foram colocados em placa com 96 poços. Um controle negativo (reação sem amostra de DNA) e

61 dois tubos contendo reações de controles com DNA genômico conhecidos (CC e CG) foram incluídos na placa de modo a conseguir alto nível de confiança na análise. A reação de amplificação por PCR propriamente dita foi realizada no 7500 Real- Time PCR System (Applied BioSystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com as seguintes temperaturas e duração dos ciclos: desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguida de 40 ciclos a 95ºC por 15 segundos, finalizando-se com uma extensão a 60ºC por um minuto. O tempo total da reação de amplificação durava, em média uma hora e 40 minutos. Após a reação de amplificação, a análise de quantificação absoluta pós-pcr foi realizada com o programa Allelic Discrimination. O software SDS plota os resultados num histograma do alelo X versos alelo Y. Os pontos podem se localizar ao longo do eixo horizontal (sendo reconhecidos como alelo X), ao longo do eixo vertical (reconhecidos como alelo Y), ou ao longo da diagonal (sendo identificados com alelos X e Y, i.é., heterozigotos) [figura 5] Alelo Y NTC Alelo X e Y Alelo X Figura 5. Histograma dos resultados do ensaio de discriminação alélica (software SDS).

62 3.3 Análise estatística Os dados foram tabulados em planilha eletrônica (Microsoft Office Excel 2003, , Microsof Corporation, EUA) para cálculos estatísticos descritivos (média aritmética, desvio padrão e mediana) e as análises estatísticas mais complexas foram realizadas com o auxílio do programa Epi Info (versão 3.4 de abril de 2007, Center for Disease Control, EUA). Na comparação dos dados demográficos e oftalmológicos entre grupo de estudo e grupo controle foram utilizados o teste exato de Fisher e o teste de qui-quadrado para a distribuição de raça, sexo e antecedentes familiares para glaucoma; o teste U de Mann- Whitney para idade, relação E/D, número de medicações anti-glaucomatosas, número de cirurgias anti-glaucomatosas (distribuição não-paramétrica); e o teste t de Student para os valores da medida da PIO (distribuição paramétrica). O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) foi calculado de acordo com a fórmula: p p.q + q 2 = 1; onde: p 2 é a frequência do genótipo CC, 2.p.q é a frequência do genótipo CG e q 2 é a frequência do genótipo GG. Os valores absolutos foram determinados pelo produto das frequências pelo número total de indivíduos da amostra. As frequências esperadas obtidas pela equação de HW foram comparadas com as frequências observadas pelo teste do qui-quadrado, sendo a hipótese de nulidade (H 0 ) a população está em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A frequência do polimorfismo do MYOC mt.1 (genótipos e alelos) foi comparada entre os grupos utilizando-se o teste de qui-quadrado com correção de Yates ou o teste exato de Fisher, quando apropriado. Os pacientes com GPAA foram subdivididos conforme a presença ou não da variante MYOC mt.1 (alelo G) em portadores (fenótipos CG e GG) e não-portadores (fenótipo CC). Para se avaliar a associação entre polimorfismos do MYOC mt.1 e as variáveis clínicas do glaucoma utilizou-se o teste t de Student (medida da PIO) e o teste U de Mann-Whitney (relação escavação-disco, número de medicações hipotensoras oculares e número de cirugias anti-glaucomatosas). As variáveis fenotípicas usadas nesta comparação

63 foram as do olho mais acometido de cada paciente (com a maior relação E/D), teoricamente o olho com a maior expressão fenotípica. Em todos os testes estatísticos, o nível de rejeição da hipótese nula foi fixado em 5% (P < 0,05). 3.4 Considerações éticas O estudo foi conduzido de acordo com os padrões de ética em pesquisa com seres humanos da Resolução CNS 196, de 10 de outubro de 1996 (e complementares) do Conselho Nacional de Saúde Ministério da Saúde e com os princípios da Declaração de Helsinke de 1995 (revidada em Edimburgo, 2002). O protocolo foi submetido para apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de São Paulo (Projeto no. 028/06) e, após sua aprovação [apêndice 4], foi encaminhado para a CONEP (Comissão Nacional de Ética em Pesquisa) que igualmente, aprovou o estudo [apêndice 5].

64 4. RESULTADOS 4.1 Características demográficas e oftalmológicas da amostra O grupo de estudo incluiu 167 pacientes portadores de GPAA e o grupo controle foi constituído por 130 indivíduos normais. As características demográficas dos sujeitos da pesquisa e os dados de exames oftalmológico são apresentados em detalhes na tabela 1 [Os dados completos são apresentados nos apêndices 1 e 2]. Tabela 1. Características demográficas e oftalmológicas dos 167 pacientes com glaucoma e dos 130 indivíduos normais (Santa Casa de São Paulo, 2009). Grupo de estudo Grupo controle P (n = 167) (n = 130) Idade (anos) 64,41 ± 12,70 69,16 ± 6,31 < 0,000 Etnia* branca 105 (62,87 %) 85 (65,38 %) 0,492 parda negra amarela 35 (20,95 %) 22 (13,17 %) 4 (2,39 %) 24 (18,46 %) 14 (10,76 %) 7 (5,38 %) M : F 80 : : 73 0,562 AF + 50 (29,94 %) 0 < 0,000 PIO OD 24,49 ± 8,69 12,37 ± 2,19 < 0,000 PIO OS 24,74 ± 8,21 12,46 ± 1,76 < 0,000 E/D OD 0,8 (0,3 a 1,0) 0,3 (0,2 a 0,4) 0,006 E/D OS 0,9 (0,5 a 1,0) 0,4 (0,2 a 0,4) 0,001 Medicações AG 0,92 ± 1,06 0 < 0,000 Cirurgias AG 2,45 ± 1,09 0 < 0,000 Legenda: *Conforme cada indivíduo auto-declarava (de acordo com IBGE) AF+: antecedente familiar positivo para glaucoma M : F: proporção de indivíduos do sexo masculino e feminino PIO: pressão ocular (mmhg) E/D: relação escavação/disco óptico [mediana (valores extremos)]

65 OD: olho direito OS: olho esquerdo Medicações AG: número de medicações anti-glaucomatosas Cirurgias AG: número de cirurgias anti-glaucomatosas Os pacientes do grupo controle eram, na média, mais idosos do que os pacientes do grupo de estudo (P = 0,000058). Quanto à distribuição étnica e por sexo os grupos eram estatisticamente semelhantes (P = 0,492 e P = 0,562, respectivamente). Os pacientes com GPAA apresentavam relações E/D nitidamente maiores e os valores da PIO eram o dobro dos do indivíduos do grupo controle em ambos os olhos. 4.2 Análise genética A figura 6 mostra o sequenciamento de dois indivíduos utilizados como controle padrão positivo no EDA (um homozigoto CC e um heterozigoto CG). A B Figura 6. Representação dos padrões de genotipagem do polimorfismo -1000C>G, após seqüenciamento direto automatizado. (A) indivíduo homozigoto CC, (B) indivíduo heterozigoto CG. As setas indicam o local correspondente à alteração. A figura 7 ilustra o histograma com os resultados do EDA para as amostras dos pacientes número 82 a 97 do grupo de estudo (GPAA).

66 Figura 7. Histograma com o resultado do Ensaio de Discriminação Alélica: os indivíduos marcados em ( ) apresentam genótipo CC (normal); os indivíduos marcados em ( ) apresentam genótipo CG (portador heterozigoto) e o indivíduo marcado em ( ) apresenta genótipo GG (portador homozigoto). O símbolo ( ) representa o controle negativo (no template control). 4.3 Frequência dos genótipos A frequência dos genótipos em homozigose (CC e GG) e heterozigose (CG) entre os grupos controle e de estudo são mostrados na tabela 2. Nenhum indivíduo do grupo controle apresentou fenótipo GG ao passo que dois indivíduos glaucomatosos revelaram o fenótipo GG. As diferenças das frequências entre os grupos, porém, não atingiram significância estatística (P = 0,420; Teste exato de Fisher). Tabela 2. Frequências e distribuição dos genótipos CC, CG e GG por grupos (Santa Casa de São Paulo, 2009). CC CG GG Total n (%) n (%) n (%) Grupo de estudo 138 (82,63 %) 27 (16,16 %) 2 (1,19 %) 167 Grupo controle 111 (85,38 %) 19 (14,61 %) 0 (0%) 130 Total

67 Os indivíduos cujos genótipos eram heterozigotos CG e aqueles que eram homozigotos GG foram agrupados em um único grupo e rotulados como portadores do alelo G [tabela 3]. A sua frequência foi comparada com a frequência dos indivíduos de genótipo CC ( homozigotos não-portadores), no entanto, a diferença entre os grupos não atingiu significância estatística (P = 0,631; Teste do qui-quadrado com correção de Yates). Tabela 3. Frequências e distribuição dos genótipos CC (não-portadores) e CG e GG (portadores) por grupos (Santa Casa de São Paulo, 2009). CC CG e GG Total n (%) n (%) Grupo de estudo 138 (82,63 %) 29 (16,47 %) 167 Grupo controle 111 (85,38 %) 19 (14,61 %) 130 Total A odds ratio para se desenvolver glaucoma nos portadores do polimorfismo C>G comparado com os não-portadores foi 0,815 (intervalo de confiança de 95%, de 0,414 a 1,597; P = 0,636). O risco relativo associado com a presença do polimorfismo -1000C>G (tanto CG como GG) foi 0,842 (intervalo de confiança de 95%, 0,472 a 1,479; P = 0,702). 4.4 Frequência dos alelos A frequência dos alelos C e G são apresentados na tabela 4. Os valores das frequências foram muito semelhantes e a diferença entre os respectivos grupos de estudo e controle não revelou significância estatística (P = 0,477; Teste do qui-quadrado com correção de Yates).

68 Tabela 4. Frequência e distribuição dos alelos (C e G) por grupos (Santa Casa de São Paulo, 2009). C G Total n (%) n (%) Grupo de estudo 303 (90,71 %) 31 (9,28 %) 334 Grupo controle 241 (92,69 %) 19 (7,30 %) 260 Total Equilíbrio de Hardy-Weinberg As frequências esperadas, calculadas pela equação de Hardy-Weinberg, são mostradas na tabela 5. Os números obtidos foram muito semelhantes às frequências observadas no estudo (P = 0,997) e, portanto, as frequências dos genótipos estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Tabela 5. Frequências observadas e frequências esperadas (em números absolutos) calculadas pela equação de Hardy-Weinberg dos genótipos CC, CG e GG (Santa Casa de São Paulo, 2009). Frequências CC CG GG Observada Esperada 248,65 45,65 2, Correlação entre fenótipo e genótipo Os pacientes com GPAA portadores do alelo G (genótipos CG e GG) foram comparados com os pacientes não-portadores (genótipo CC), quanto ao valor da medida da PIO e E/D do olho com a doença mais avançada, número de medicações hipotensoras oculares e número de cirurgias anti-glaucomatosas [tabela 6]. Os indivíduos não-portadores apresentavam níveis médios de PIO maiores que os portadores (P = 0,013). Nenhuma diferença foi observada quanto à relação E/D (P = 0,174), quanto ao número de medicações

69 (P = 0,205) e número de cirurgias anti-glaucomatosas (P = 0,551). Tabela 6. Comparação das variáveis fenotípicas dos pacientes glaucomatosos com e sem o alelo G (portadores e não-portadores, respectivamente) (Santa Casa de São Paulo, 2009). Não-portadores (alelo C) Portadores (alelo G) P (n = 138) (n = 29) PIO 26,55 ± 9,06 22,10 ± 6,94 0,013 E/D 0,9 (0,5 a 1,0) 0,8 (0,6 a 1,0) 0,174 Medicações AG 0,93 ± 1,05 0,86 ± 1,15 0,205 Cirurgias AG 2,50 ± 1,08 2,20 ± 1,08 0,551 Legenda: PIO: pressão ocular (mmhg) E/D: relação escavação/disco [mediana (valores extremos)] Medicações AG: número de medicações anti-glaucomatosas Cirurgias AG: número de cirurgias anti-glaucomatosas

70 5. DISCUSSÃO 5.1 Frequências de genótipos e alelos A frequência dos genótipos em heterozigose CG e em homozigose GG neste estudo foi comparável àquelas observadas por outros autores [quadro 3]. Nesta comparação, as frequências foram calculadas tendo como denominador o número total de sujeitos de pesquisa de cada estudo (pacientes com glaucoma e indivíduos do grupo controle). Nenhum dos estudos observou diferença significante na distributição dos alelos do polimorfismo MYOC mt.1 entre casos e controles. A frequência dos genótipos CG e GG foi baixa em todos os estudos, apesar de terem sido realizados em populações e com métodos laboratoriais diferentes. Colomb et al (2001) avaliaram 142 pacientes franceses com GPAA pela técnica de dot-blot (ensaio de hibridização de ácidos nucleicos que utiliza sonda clonada de DNA). Alward et al (2002) incluiram 779 pacientes americanos com GPAA e suspeitos de glaucoma em estudo que utilizou o ensaio de restrição da endonuclease (ERE). Este mesmo método foi usado por Fan et al (2004) em 212 pacientes chineses com GPAA e por Özgül et al (2005) em 88 pacientes com GPAA na Turquia. Em nosso estudo, incluímos 167 pacientes brasileiros com GPAA e o método laboratorial foi o EDA. Quadro 3. Distribuição percentual (%) das frequências do genótipo MYOC mt.1 por estudo (Adaptado de Liu et al, 2008) CC caso CC controle CG caso CG controle GG caso GG controle Colomb et al, ,6 33,5 9,3 6,4 1,3 0 Alward et al, ,5 14,4 11,5 4,3 1,0 0,2 Fan et al, ,8 32, ,4 1,2 2,1 Özgül et al, ,3 48,3 10,0 8,5 1,4 1,4 Kasahara et al, ,6 37,3 9,0 6,4 0,6 0 A frequência dos alelos C e G observadas neste estudo foi comparada aos valores relatados por outros autores [quadro 4]. Da mesma forma que no quadro 3, as frequências foram calculadas tendo como denominador o número total de sujeitos de pesquisa de cada

71 estudo (pacientes com glaucoma e controles normais). A frequência do alelo G foi baixa tanto nos indivíduos glaucomatosos como nos controles normais em todos os estudos. Quadro 4. Distribuição percentual (%) da frequência dos alelos C e G por estudo. Alelo C caso Alelo C controle Alelo G caso AleloG controle Colomb et al, ,2 38,1 4,5 3,2 Alward et al, ,2 16,6 6,8 2,3 Fan et al, ,8 40,7 10,2 10,5 Özgül et al, ,3 52,6 6,4 5,7 Kasahara et al, ,0 40,6 5,2 3,2 5.2 Correlação entre fenótipo e genótipo A presença de polimorfismo nas regiões codificadoras ou promotoras de genes específicos pode fazer com que os indivíduos portadores tornem-se mais suscetíveis a certas doenças, sejam resistestes ao tratamento clínico ou apresentem formas mais graves da doença. Colomb et al (2001) foram os primeiros a verificar a associação de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na região promotora do gene MYOC (MYOC mt.1) com a gravidade do GPAA. Polansky et al (2003) observaram a associação entre o polimorfismo MYOC mt.1 e a progressão do glaucoma. A este propósito, foi inclusive desenvolvido um teste genético disponível comercialmente (OcuGene, InSite Vision Inc., Alameda, CA, EUA) para esta variante como indicador da gravidade da doença e resistência ao tratamento. Outros autores porém, demonstraram o contrário (Alward et al, 2002, Fan et al, 2004, Özgül et al, 2005). Os resultados deste estudo demonstraram também que, nos pacientes brasileiros com GPAA o polimorfismo MYOC mt.1 não está associado a maior gravidade da doença. O quadro 5 mostra a relação do aspecto do disco óptico dos indivíduos glaucomatosos com MYOC mt.1 e sem o polimorfismo. Em nenhum dos estudos (inclusive neste trabalho) foi encontrada diferença estatisticamente significante entre portadores e não-porteadores ( P > 0,05 em todos os estudos).

72 Quadro 5. Relação escavação/disco entre portadores MYOC mt.1 e não-portadores segundo autores (Adaptado de Liu et al, 2008). Autor MYOC mt.1 + MYOC mt.1 - P Genótipo n E/D Genótipo n E/D OD GG 5 0,80 (0,75 0,85) CC 332 0,85 (0,80 0,90) 0,96 Alward et al, GC 56 0,85 (0,78 0,90) 2002 OS GG 5 0,95 (0,70 0,95) CC 0,85 (0,70 0,90) GC 56 0,90 (0,80 0,90) Fan et al, GG 2 0,55 (0,30 0,80) CC 72 0,80 (0,60 0,90) 0, GC 39 0,80 (0,50 1,00) Colomb et al, CG e GG 25 0,73 ± 0,19 CC 117 0,77 ± 0,18 > 0, Özgül et al, 2005 CG e GG 24 0,58 ± 0,21 CC 64 0,54 ± 0,21 0,524 Kasahara et al, CG e GG 29 0,8 (0,60-1,00) CC 138 0,9 (0,50-1,00) 0, Legenda: OD: olho direito OS: olho esquerdo E/D: relação escavação-disco

73 Colomb et al (2001) observaram que o polimorfismo MYOC mt.1 está associado com elevação da PIO (+ 4,9 mmhg, P = 0,0004). Diferentemente, observou-se neste estudo que os indivíduos não-portadores apresentaram valores de PIO mais elevados que os portadores, (26,5 ± 9,0 mmhg e 22,1 ± 6,9 mmhg, respectivamente, P = 0,013), fato este que poderia sugerir um possível efeito protetor do polimorfismo MYOC mt.1 nos indivíduos portadores. Os indivíduos não-portadores porém, não apresentavam maior dano estrutural correspondente à maior elevação da PIO de forma que, esta observação merece cuidado na interpretação. A PIO apresenta variação circadiana, sendo mais alta pela manhã e mais baixa à noite (Liu, 1998). Assim, a medida isolada da PIO tomada em um momento pode não ser variável precisa para caracterizar a gravidade da doença ou seu estádio evolutivo. Além disso, neste estudo, muitos pacientes já se encontravam em tratamento (que diferia de um paciente para outro) e outros já haviam sido operados. Considerando que o tratamento estivesse adequado, a medida da PIO possivelmente estaria controlada em níveis normais ou próximas do normal. Também, a este respeito, Liu et al (2008) não realizaram a análise da PIO em sua meta-análise, pois os tratamentos recebidos pelos pacientes não foram descritos nos estudos. Não seria razoável assumir que os pacientes que tivessem PIO mais alta ao entrarem nos estudos fossem mais resistentes ao tratamento clínico porque a diferença da PIO entre o diagnóstico e a entrada nos estudos seria significante apenas se os pacientes fossem tratados prospectivamente de acordo com protocolo definido e igual para todos. Portanto, a variável PIO, principalmente sua medida isolada em pacientes com esquemas terapêuticos distintos e individualizados, deve ser interpretada com cautela. Liu et al (2008), em meta-análise que incluiu quatro estudos, avaliaram a possível associação do polimorfismo MYOC mt.1 e o risco de GPAA. Os quatro estudos casocontrole (envolvendo no total 835 casos de GPAA e 530 controles) preencheram os requisitos para meta-análise. A odds ratio (OR) de desenvolver GPAA nos portadores MYOC mt.1 versus não-portadores (modelo de efeito fixo) foi 1,06, com intervalo de confiança de 95% (CI) de 0,81 a 1,38 (P = 0,67). Isto indica que, quando comparado ao genótipo -1000CC, o risco associado com os genótipos -1000GG ou -1000GC não foi significante. Assumindo -1000G como alelo de risco, os autores compararam o efeito do alelo nos modelos dominantes. Similarmente, a comparação não revelou risco significante

74 associado com o alelo -1000G versus o alelo -1000C (OR = 1,05; 95% CI: 0,83 1,32; P = 0,71). Todos os estudos incluídos na meta-análise eram do tipo caso-controle e portanto suscetíveis a viés. Embora, por vezes o principal efeito das variantes genéticas não seja significante, qualquer estratificação da amostra pode levar a falsas evidências de associação positiva entre o marcador e a doença. Para se evitar este problema, as subpopulações deveriam ser definidas em termos de fatores que poderiam influenciá-las e de frequências de alelos-marcadores (Liu et al, 2008). Esta potencial fonte de viés pode ter influenciado o estudo de Fan et al (2004), pois os autores incluíram tanto pacientes com GPAA e alguns pacientes com glaucoma juvenil. A patogenia e os mecanismos moleculares destas duas entidades são distintos e a inclusão delas em um grupo tenderia à heterogeneidade do grupo de estudo. Similarmente, Alward et al (2002) incluíram tanto pacientes com GPAA como suspeitos de glaucoma. Apesar disso, as conclusões dos dois estudos foram negativas. Além da heterogeneidade do grupo de estudo, a falta de representividade do grupo controle poderia levar a estimativas imprecisas do efeito do MYOC mt.1 no risco e gravidade do glaucoma. Em nosso estudo, incluímos somente pacientes com GPAA no grupo de estudo e estabelecemos critérios rigorosos para a seleção do grupo controle para evitar qualquer viés de seleção. Por causa da natureza multigênica e multifatorial do GPAA, a similaridade entre grupo de estudo e grupo controle deveria ser a maior possível. Fatores como idade, sexo, etnia, comorbidades sistêmicas e oculares, dentre outros não deveriam diferir significativamente entre casos e controles. Não obstante, isto nem sempre é fácil de se conseguir e se os grupos forem muito diferentes, os resultados serão imprecisos. Em sendo o único estudo da meta-análise que observou a associação entre MYOC mt.1 e GPAA, o trabalho de Colomb et al (2001) deve ter alguma outra diferença metodológica dos outros estudos. De fato, observa-se que a idade média dos pacientes quando do diagnóstico da doença era 45,1 anos, relativamente jovens, uma vez que a prevalência do glaucoma aumenta com a idade e é mais comum após 60 anos. O método laboratorial escolhido também foi diferente dos outros estudos. Os autores usaram o ensaio dot-blot ao passo que os outros utilizaram o ensaio da endonuclease de restrição. Embora o ERE não seja a melhor técnica para genotipagem, é técnica amplamente aceita por sua alta eficiência e

75 acurácia, ao passo que o dot-blot apresenta algumas limitações por ser técnica derivada de hibridização. A especificidade e a sensibilidade da sonda, a temperatura apropriada e o tempo para a hibridização são todos fatores chave que podem afetar o resultado final do ensaio (Liu et al, 2008). Ademais, por ser doença de patogenia complexa, o GPAA tem a característica da heterogeneidade étnica. Estudos realizados em populações de países diferentes podem apresentar conclusões divergentes. Os autores estudaram a população francesa, que apresenta a maior prevalência da mutação do tipo códon de parada MYOC Gln368 (5%) e que pode ser devida a um efeito fundador (Melki et al, 2003), de modo que não deve ser improvável que uma forma mais grave de GPAA com MYOC mt.1 possa ser específica da população francesa. Por último, o polimorfismo MYOC mt.1 pode não ser o único fator causador responsável pelos resultados positivos, mas ele pode estar em desequilíbrio de ligação (DL) com outros genes ou outros loci biologicamente significantes e ainda desconhecidos. Por exemplo, o DL do MYOC -255T>C versus -387C>T e C>G foram encontrados apenas nos pacientes com GPAA no estudo de Fan et al (2004). Copin et al (2002) observaram que o polimorfismo da apolipoproteína E (APOE) - 491A>T, que interage com o MYOC mt.1, foi associado ao aumento da PIO e aumento da resistência ao efeito hipotensor de drogas anti-glaucomatosas em pacientes com GPAA. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é regulador fundamental na cadeia da apoptose que está envolvida na morte das células ganglionares da retina e descobriu-se que o polimorfismo -308 tem efeito no risco e gravidade do glaucoma (Irkec et al, 2005). Em comparação com o estudo de Colomb, neste estudo a idade média dos pacientes com GPAA foi 64,4 anos (vs. 45,1 anos) e procuramos manter as semelhanças entre casos e controles; apesar de os indivíduos do grupo controle serem mais idosos do que os pacientes com GPAA, no nosso estudo os grupos não diferiram quanto a etnia e distribuição por sexo. Ao invés do ensaio dot-blot, neste estudo utilizamos o EDA, cujas vantagens e desvantagens serão discutidas adiante (ítem 5.3). Nossa amostra incluiu apenas indivíduos brasileiros (brancos, pardos, negros e amarelos nascidos no país). A população brasileira é muito miscigenada e os denominados brancos são eminentemente os descendentes europeus da Península Ibérica e da Itália. A contribuição da imigração francesa na formação da população brasileira é mínima ou praticamente nula. Assim, a amostra do estudo de Colomb et al e a deste estudo são distintas.

76 No estudo de Polansky et al (2003), os pacientes com GPAA foram acompanhados por aproximadamente 15 anos e o modelo de regressão proporcional de Cox foi usado para a análise time-to-event para verificar se a variante mt.1 (+) estaria associada com a progressão mais rápida da doença. Os autores observaram que a presença do polimorfismo MYOC mt.1 acelerava a piora dos parâmetros estruturais (disco óptico) e as medidas do campo visual para progressão do glaucoma. Neste estudo, não realizamos a mesma análise nos pacientes, uma vez que os dados prospectivos do acompanhamento em visitas posteriores não estavam disponíveis e o desenho do nosso estudo foi diferente (estudo transversal). Somente o acompanhamento dos pacientes por longo prazo, nos permitiria fazer análise semelhante à de Polansky e verificar o efeito da variante MYOC mt.1 no curso clínico dos pacientes com GPAA. 5.3 Das limitações do estudo O RT-PCR é um método que monitora o progresso da PCR à medida em que ela ocorre, ou seja, em tempo real. Os resultados são, portanto, coletados durante o processo de PCR e não ao fim deste. Neste método, as reações são caracterizadas em períodos específicos do tempo durante seus ciclos quando a amplificação da amostra de DNA é detectada ao invés do total acumulado após um número fixo de ciclos. Quanto maior o número de cópias do DNA em estudo, mais cedo o aumento na fluorescência é observada. Além da eliminação do processo pós-pcr (diminuindo custos e trabalho laboratorial), outras vantagens do método são a necessidade de hibridização específica entre a sonda e o fragmento de DNA para gerar o sinal de fluorescência e a amplificação de duas sequências distintas em um único tubo de reação uma vez que as sondas podem ser marcadas com fluoróforos diferentes. Uma desvantagem é a necessidade de sintetizar diferentes sondas para sequências diferentes de DNA. Além disso, este método não permite a detecção de novos polimorfismos e/ou mutações, uma vez que as sondas são construídas para alelos específicos e, consequentemente, a reação de PCR somente ocorrerá para os alelos correspondentes. Neste estudo, não monitoramos a fluorescência em tempo real, mas quantificamos a fluorescência ao fim da reação de PCR. A fluorescência é proporcionalmente maior quanto

77 maior a quantidade do produto de PCR e, portanto, mais fácil e fidedigna será a medida da fluorescência e consequentemente a identificação dos alelos em estudo. A recomendação dos desenvolvedores do método é a realização de cada reação em triplicata, i.é., para cada amostra de DNA, a reação de PCR deve ser realizada em três tubos distintos para garantir maior precisão dos resultados. Neste estudo, para cada amostra de DNA, foram utilizados dois tubos de reação. Além disso, o volume final de cada reação foi reduzido dos 25 µl recomendado pelos desenvolvedores do método, para 12,5 µl. Isto se justifica pelo alto custo das sondas e misturas de reação, além de nossas limitações de caráter orçamentário. Para não prejudicar a fidelidade dos resultados, aquelas amostras cuja fluorescência geraram dúvidas quanto à correta identificação do alelo correspondente foram testadas novamente em duplicata (a este propósito, a alta reprodutibilidade e precisão do método exigiu a repetição de apenas 14 amostras). Além disso, para se assegurar maior fidelidade dos resultados da reação de PCR, em todas as placas sempre se incluíam dois controles positivos, previamente sequenciados na fase de padronização do estudo, a saber, um controle normal homozigoto CC e um controle heterozigoto CG (ver ítem 3.2.2). Desta maneira, acreditamos que os resultados sejam precisos e altamente fiéis à realidade genotípica de cada sujeito de pesquisa incluido no estudo. Neste estudo não foi realizada a correlação genótipo-fenótipo com uma medida de avaliação funcional. Isto seria desejável e possivelmente contribuiria para melhor entendimento da avaliação do papel do MYOC mt.1 na patogenia do GPAA. Entretanto, nem todos os pacientes tinham dados de exame perimétrico disponíveis para análise. Um número de pacientes foi submetido apenas ao exame perimétrico com o FDT (programa screening) que avalia a sensibilidade ao contraste. Outros pacientes, por outro lado, foram submetidos à perimetria convencional com Humphrey (programa SITA 24-2) que mede a sensibilidade retínica de pontos específicos do campo visual a um estímulo luminoso branco. Estas duas medidas da função visual, a sensibilidade ao contraste e a sensibilidade retínica, são variáveis diferentes e independentes e não se pode utilizar uma em substituição à outra. Assim, qualquer tentativa de correlação do fenótipo com uma variável da função visual neste estudo seria incompleta e imprecisa. Além disso, o exame perimétrico sofre a influência de outros fatores como a atenção do paciente durante sua realização e da opacidade dos meios ópticos, em especial da catarata, muito comum na senilidade e

78 frequentemente coexistindo com o glaucoma. Isto faz com que, por vezes, as variáveis perimétricas não traduzam fielmente o estado funcional do nervo óptico comprometido apenas pela doença glaucoma. Ademais, as variáveis perimétricas são menos sensíveis que as variáveis estruturais do nervo óptico e da CFNR na medida do estádio evolutivo e no diagnóstico precoce da doença. A contagem de células ganglionares da retina em olhos glaucomatosos para os quais um exame de perimetria computadorizada estava disponível demonstrou que a presença de escotoma localizado estava associado com perda celular da ordem de 29% (Kerrigan-Baumrind et al, 2000). A avaliação estrutural do disco óptico traduz mais fielmente o estádio evolutivo do glaucoma e, portanto, uma correlação fenótipo-genótipo no contexto do GPAA, será melhor avaliada se utilizada as variáveis estruturais (por exemplo a relação escavação/disco utilizada neste estudo). A medida da PIO isoladamente, pode ser pouco representativa da gravidade do glaucoma. A PIO sofre influência da variação circadiana que é fisiológica (Liu, 1998). A sua medida sob efeito do tratamento clínico ou após a cirurgia anti-glaucomatosa pode encontrar-se em níveis normais. Idealmente, as medidas da PIO deveriam ser tomadas sem o efeito de quaisquer medicações. Entretanto, a interrrupção do tratamento para a medida da PIO sem medicação é temerosa, principalmente nos pacientes em estádio evolutivo avançado e se realizada somente para fins de pesquisa (sem definir um nível máximo para a inclusão de pacientes no estudo) certamente encontraria enclaves éticos. Na correlação do genótipo com as variáveis fenotípicas foram utilizados o número de medicações e o número de cirurgias. Estas duas variáveis podem ser usadas como medidas indiretas da gravidade da doença, porém, imprecisas. Quanto mais difícil o controle pressórico no glaucoma, maior o número de medicações hipotensoras oculares a serem prescritas ao paciente. Entretanto, a não fidelidade ou não aderência ao tratamento prescrito pode enganosamente levar à falsa conclusão que as medicações prescritas não estariam sendo suficientes para o controle da doença e, assim, outras medicações deveriam ser adicionadas ao esquema terapêutico. Além disso, um paciente pode não responder a uma medicação específica sem que isto represente necessariamente uma forma mais grave da doença. Aos pacientes que não respondem ao tratamento clínico é recomendado a cirurgia anti-glaucomatosa. Pacientes que se apresentem numa forma mais avançada da

79 doença e que necessitam de níveis pressóricos mais baixos também são candidatos à cirurgia. Pacientes que consistentemente não são fiéis ao tratamento clínico por falta de recursos financeiros ou não disponibilidade das medicações hipotensoras oculares também constituem-se em candidatos à cirurgia. Pacientes operados por glaucoma que eventualmente apresentam falência da cirurgia devem ser re-operados, seja pela mesma técnica, seja por outra técnica diferente. Entretanto, a falência da cirugia anti-glaucomatosa não necessariamente está relacionada com a gravidade da doença em sí. Embora estes pacientes constituam os casos refratários, o não funcionamento adequado da trabeculectomia (ver ítem ) está mais relacionado a uma maior resposta inflamatória e a processo cicatricial mais intenso do que maior gravidade da doença propriamente dita. Assim, torna-se claro que tanto o número de medicações antiglaucomatosas das quais o paciente faz uso como o número de cirurgias anti-glaucomatosas a que o paciente foi submetido são medidas indiretas e imperfeitas da gravidade da doença. De qualquer forma, avaliadas em conjunto o número de medicações, o número de cirugias e a medida da PIO, pode-se ter uma avaliação geral da gravidade da doença muito próximo do real.

80 6. CONCLUSÕES As conclusões do estudo foram: 6.1 As frequências dos genótipos e alelos do polimorfismo MYOC mt.1 (-1000C>G) na população brasileira não são diferentes entre pacientes portadores de glaucoma primário de ângulo aberto e indivíduos normais. 6.2 O polimorfismo MYOC mt.1 (-1000C>G) não está associado à maior gravidade da doença na população brasileira.

81 7. ANEXOS Anexo 1. Extração do DNA genômico por fenol/clorofórmio Protocolo Primeira Etapa: 1. Coleta de sangue em tubo contendo EDTA ou ACD; 2. Centrifugação por 10 minutos a 2500 rpm; 3. Descarte do plasma com pipeta Pasteur descartável, em descarte com solução de hipoclorito, num Becker; 4. Remoção dos glóbulos brancos (leucócitos) com pipeta Pasteur; 5. Transferência dos leucócitos para um tubo de polipropileno do tipo Falcon de 15 ml; 6. Adição de tampão RSB 1X até completar o volume final de 11 ml no tubo; 7. Adição de 60 µl de NONIDET - P40 (TRITON ou IGEFAL) e homogeneização por 10 minutos; 8. Centrifugação a 2500 rpm por 10 min e descarte do sobrenadante no descarte; 9. Ressuspensão do pellet em 0,5ml de tampão RSB 1X seguida de homogeneização; 10. Lise das hemácias com 3,0 ml de sabão SDS; 11. Adição de 40 µl de proteinase K; 12. Levar à estufa por 2 a 3 horas à 37 o C ou overnight; Protocolo Segunda Etapa: Adicionar 3,0 ml de fenol no tubo Falcon.; 1. Homogeneização por 10 minutos, seguida de centrifugação a 2500 rpm por 10 min; 2. Remoção da porção superior do tubo (transparente), com pipeta Pasteur para outro tubo Falcon; 3. Adição de clorofórmio-álcool iso-amílico com fenol saturado (1:1) (1,5 ml de clorofórmio e 1,5 ml de fenol.saturado); 4. Homogeneização por 10 minutos e centrifugação por mais 10 minutos a 2500 rpm; 5. Remoção da porção inferior do tubo (fenol), com pipeta Pasteur, seguida de adição de 3.0 ml de clorofórmio-álcool iso-amílico; 6. Homogeneização por 10 minutos e centrifugação por mais 10 minutos a 2500 rpm seguida de remoção completa da porção inferior do tubo;

82 7. Adição de 6,0 ml de etanol absoluto gelado, para que haja a precipitação do DNA; 8. Manutenção do DNA precipitado a 4 C por 16 horas, seguida da remoção do DNA com uma pipeta e ressuspensão em 200 a 250 µl de tampão TE; Soluções empregadas Para a realização das técnicas previamente descritas, foram utilizadas algumas soluções cujos protocolos encontram-se a seguir: Para extração de DNA: RSB 10X (500,0 ml): Tris HCl ph 7,6; 0,1M 50,0 ml KCl 0,1M 25,0 ml MgCl 0,1M 50,0 ml H 2 0 qsp 500,0 ml RSB 1X (500,0 ml): RSB 10X H 2 0 qsp 50,0 ml 500,0 ml SDS (solução para sangue) (500,0 ml): RSB 1X 500,0 ml de RSB 10X NaCl 0,4 M 40,0 ml de NaCl 5 M SDS 0,5 % 12,5 ml de SDS 20 % EDTA 20 mm 2,0 ml de EDTA 0,5 M H 2 0 qsp 500,0 ml TE 10X (200,0 ml): Tris HCl ph 8,0 EDTA 0,2M H 2 0 qsp Autoclavar 1,0mL 1,0 ml 200,0 ml

83 Clorofórmio Álcool Isoamílico (25,0 ml): Clorofórmio 24,0 ml Álcool isoamílico 1,0 ml Não autoclavar (guardar em geladeira) EDTA ph 8 0,2M (100,0 ml): PM = 372,24 EDTA 7,44 g H 2 0 qsp 100,0 ml Autoclavar Tris/HCl 2M ph 7,5< 8,0 (500,0 ml): PM Tris = 121,1g V= volume em litros M = m.v.pm PM = peso molecular M = 2.0,5. 121,1 M = quantidade final M = 121,1g Tris 121,1 g H 2 0 qsp 500,0 ml HCl 35,0 a 40,0 ml Autoclavar Tris/Hcl 0,5 M (500,0mL): C 1. V 1 = C 2. V 2 2. V 1 = 0, V 1 = 125 ml de Tris/HCl 2M EDTA 0,5M (500,0 ml): M = m. V(e). PM M = 0,5. 0,5. 372,24g/mL M = 93,6g de EDTA EDTA=93,06 g

84 H 2 0 qsp=500,0 ml Autoclavar, ph 8,7. Molaridade da solução (M): É a quantidade de mol do soluto dissolvido em 1 litro de solução. M = n1/v ou M = m1/ mg1. V Para acertar o ph das soluções: NaOH: deixa a solução básica (maior ou igual a 7,0) HCl: Deixa a solução ácida (menor ou igual a 4,0) Fenol Saturado: 1. Descristalizar o fenol em banho maria a 68º C; 2. Em um becker de 2000mL, despejar o fenol já descritalizado e adicionar a solução Tris/Hcl 0,5M num volume final de 500mL; 3. Agitar por 15 minutos no agitar magnético e esperar a separação das fases; 4. Descartar a fase superior (Tris/Hcl); 5. Adicionar Tris/Hcl 1M; 6. Agitar por 15 minutos no agitar magnético e esperar a separação das fases; 7. Verificar o ph da solução (7.8) com fita medidora; 8. Se não obtiver o ph desejado, repetir o passo 5 em diante; 9. Após obtido o ph adicionar 10% do volume total da solução de Tris/Hcl 1M; 10. No frasco do fenol adicionar 0,1g de BME hidroxiquinolina para evitar oxidação da solução; 11. Despejar o fenol de volta ao frasco e armazená-lo em geladeira a 4ºC.

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96 RESUMO Rastreamento do polimorfismo TIGR/MYOC mt.1 (-1000C>G) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo aberto e correlação com o risco e a gravidade da doença. Niro Kasahara. Tese (Doutorado, 2009). O objetivo deste estudo foi investigar o polimorfismo -1000C>G na região promotora do gene MYOC (MYOC mt.1) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA) e avaliar seu papel no fenótipo e na gravidade da doença. Cento e sessenta e sete pacientes com GPAA e 130 indivíduos normais (controles) foram incluídos no estudo. Amostras de DNA foram preparadas e o polimorfismo MYOC mt.1 na região promotora foi rastreado pela RT PCR (PCR em tempo real) em um ensaio de discriminação alélica (EDA). As frequências do polimorfismo MYOC mt.1 foram determinadas nos dois grupos e comparadas por meio dos testes exato de Fisher e de quiquadrado com correção de Yates. A pressão intra-ocular (PIO), relação escavação-disco (E/D), número de medicações anti-glaucomatosas e número de cirurgias anti-glaucomatosas foram comparadas entre os portadores MYOC mt.1 e os não-portadores. Nosso resultados revelaram que as frequências do genótipo MYOC mt.1 não diferiram entre os indivíduos glaucomatosos e os controles normais (P = 0,420); 14,6% dos indivíduos controle e 16,4% dos pacientes com GPAA eram portadores MYOC mt.1 (tanto CG como GG). A frequência do alelo foi similar entre os indivíduos com GPAA e controles (7,3% e 9,2%, respectivamente; P = 0,477). Entre os pacientes com GPAA não foi observada diferença, de acordo com o genótipo, na relação E/D, número de medicações anti-glaucomatosas e número de procedimentos cirúrgicos para controle da PIO. Entretanto, os níveis de PIO nos não-portadores eram mais elevados do que nos portadores (P = 0,013). Em conclusão, nosso estudo mostrou que o alelo G do polimorfismo MYOC mt.1 na região promotora foi distribuído igualmente entre pacientes com GPAA e indíduos normais e este polimorfismo possivelmente não está relacionado com o risco e a gravidade da doença na população brasileira.

97 ABSTRACT Screening of the TIGR/MYOC mt.1 (-1000C>G) polymorphism in Brazilian patients with primary open-angle glaucoma and correlation with the risk and severity of the disease. Niro Kasahara. Tese (Doutorado, 2009). The purpose of this study was to investigate the myocilin (MYOC) gene promoter polymorphism -1000C>G (MYOC mt.1) in Brazilian patients with primary open angle glaucoma (POAG) and to evaluate its possible role on the phenotype and the severity of the disease. One hundred sixty-seven patients with POAG and 130 normal controls were enrolled in the study. DNA samples were prepared and the MYOC mt.1 polymorphism in the promoter region was screened by RT PCR in a SNP assay. Frequencies of the MYOC mt.1 promoter polymorphism were determined for both groups and compared by Fisher s exact test and Chi-square test with Yate s correction. Intraocular presssure (IOP), cup-todisk ratio (C/D), number of glaucoma medications, and number of glaucoma surgeries were compared between MYOC mt.1 carriers and non-carriers. Our results showed that MYOC mt.1 genotype frequencies did not differ between POAG and healthy subjects (P = 0.420); 14.6% of control subjects and 16.4% of POAG patients were MYOC mt.1 carriers (either CG or GG). The frequency of the G allele was similar between glaucoma and controls (7.3% and 9.2%, respectively; P = 0.477). Amongst POAG patients there was no difference, according to the genotype, in the C/D ratio, number of glaucoma medications and surgical procedures for IOP control. However, non-carriers presented with average IOP levels higher than carriers (P = 0.013). In conclusion, our study showed that the G allele of the MYOC mt.1 promoter polymorphism was equally distributed in POAG patients and healthy subjects and it is possibly unrelated to the risk and severity of disease in the Brazilian population.

98 LISTAS E APÊNDICES Apêndice 1. Relação dos pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto. No. IDADE SEXO ETNIA AF PIO OD PIO OS E/D OD E/D OS C M GEN ,8 0,7 3 2 CC ,9 0,9 2 2 CC , CC CC ,9 3 3 CC ,9 0,9 3 3 CC ,7 0,5 2 1 CC ,9 0,9 1 1 CC ,4 0,9 1 3 CC CC ,8 0,8 1 1 CC ,7 0,9 2 3 CC CC , CC CC ,8 0,8 2 2 CC , CC CC ,9 0,8 3 3 CC ,3 0,1 1 1 CC CC , CC ,8 0,7 2 3 CC ,7 0,6 1 1 CC ,7 0,8 2 2 CC CC CC , CC ,9 0,9 2 2 CC ,8 0,8 1 1 CC ,7 0,8 1 2 CC , CC CC ,6 0,4 1 1 CC ,5 0,5 1 1 CC ,8 0,9 2 2 CC , CC ,6 0,6 1 1 CC CC ,6 0,7 1 1 CC CC , CC ,9 0,9 1 0 CC CC ,7 0,6 0 4 CC

99 ,7 0,8 0 2 CC ,5 0,5 0 3 CC ,5 0,5 0 3 CC ,7 0,8 1 0 CC ,4 0,6 0 3 CC ,7 0,6 0 3 CC ,9 0,9 0 4 CC ,7 0,7 0 2 CC ,7 0,7 0 2 CC ,8 0,6 1 3 CC ,6 0,8 0 3 CC ,9 0,8 0 0 CC ,7 0,7 0 1 CC , CC CC ,9 0,9 0 4 CC , CC CC , CC ,8 0,9 1 4 CC ,8 0,8 0 3 CC ,9 0,8 0 3 CC CC CC , CC ,5 0,6 1 1 CC ,9 0,9 0 4 CC ,6 0,8 0 3 CC ,8 0,5 0 3 CC ,9 0,9 0 2 CC ,9 0 2 CC ,9 0,9 1 2 CC ,8 1 1 CC ,8 0,9 0 3 CC ,9 0,9 0 4 CC ,9 0,9 1 2 CC ,6 0,9 1 4 CC ,9 0,9 1 0 CC ,9 0,9 1 2 CC ,7 0,7 0 4 CC ,6 1 1 CC CC ,8 0,5 0 3 CC ,9 0,9 1 3 CC , CC ,6 0,7 0 1 CC CC ,8 1 4 CC ,8 0,7 1 4 CC ,8 0,5 0 1 CC ,4 1 1 CC

100 , CC ,8 0,9 0 3 CC ,9 0,9 0 4 CC ,9 0,9 0 3 CC ,9 0,9 0 3 CC ,8 0,8 0 3 CC ,4 0,6 0 3 CC ,8 1 2 CC ,8 0,7 0 3 CC ,8 0,7 0 3 CC ,9 0,8 0 4 CC CC ,6 0,7 0 4 CC ,9 0,9 1 1 CC CC CC CC ,9 0,9 0 4 CC ,5 0,5 0 2 CC CC ,8 0,8 0 2 CC ,9 0,8 1 1 CC ,8 0,8 0 1 CC ,5 0,9 0 3 CC ,8 0,9 0 2 CC ,6 0,9 0 2 CC ,7 0,7 0 2 CC ,7 0,6 1 1 CC ,7 0,7 0 1 CC ,8 0,8 0 2 CC ,7 0,8 1 3 CC ,7 0,7 0 2 CC ,9 0,8 0 3 CC ,5 0,5 0 3 CC CC ,9 0,9 0 4 CC ,9 0,9 0 3 CC ,8 0,8 0 3 CC ,9 0,8 0 3 CC ,7 0,7 0 2 CC ,5 0,6 0 1 CC CC CG ,6 0,6 1 1 CG ,9 3 3 CG ,5 0,5 1 1 CG ,6 0,7 1 1 CG ,9 0,9 3 3 CG ,9 0,9 3 3 CG ,7 0,6 2 2 CG ,8 0,8 2 2 CG

101 ,6 0,8 1 2 CG ,9 0,8 0 3 CG CG ,5 0,6 0 1 CG ,5 0,7 0 3 CG ,9 0,9 1 3 CG CG ,7 0,4 0 3 CG ,8 0,8 1 1 GG ,6 0,6 0 3 CG ,3 0,6 0 0 GG ,8 0,9 0 3 CG ,7 0,6 0 4 CG ,8 0,7 0 2 CG CG ,6 0,7 0 2 CG ,9 0,9 0 4 CG ,6 0,9 1 0 CG ,9 0,8 0 2 CG ,6 0,6 0 3 CG Legenda: AF: antecedente familiar (0 = negativo; 1 = positivo) PIO: pressão ocular E/D: relação escavação/disco OD: olho direito OS: olho esquerdo C: número de cirurgias oculares M: número de medicações hipotensoreas oculares GEN: genótipo

102 Apêndice 2. Relação dos indivíduos do grupo controle. No. IDADE SEXO ETNIA AF PIO OD PIO OS E/D OD E/D OS C M GEN ,2 0,2 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,3 0,3 0 0 CG ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,5 0,5 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CG ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,3 0 0 CC

103 ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CG ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CG ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,5 0,5 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CG

104 ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,5 0,5 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,4 0 0 CG ,4 0,4 0 0 CC ,4 0,4 0 0 CC ,3 0,3 0 0 CC ,2 0,2 0 0 CG Legenda: AF: antecedente familiar (0 = negativo; 1 = positivo) PIO: pressão ocular E/D: relação escavação/disco OD: olho direito OS: olho esquerdo C: número de cirurgias oculares M: número de medicações hipotensoreas oculares GEN: genótipo

105 Apêndice 3. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1.NOME DO PACIENTE:... DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº :... SEXO : M [ ] F [ ] DATA NASCIMENTO:.../.../... ENDEREÇO... Nº... APTO:... BAIRRO:... CIDADE... CEP:...TELEFONE: DDD (...)... 2.RESPONSÁVEL LEGAL... NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.)... DOCUMENTO DE IDENTIDADE :...SEXO: M [ ] F [ ] DATA NASCIMENTO.:.../.../... ENDEREÇO:...Nº...APTO:... BAIRRO:...CIDADE:... CEP:...TELEFONE:DDD(...)... II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA 1. TÍTULODOPROTOCOLO DE PESQUISA: Rastreamento do polimorfismo TIGR/MYOC mt.1 (-1000C>G) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo aberto e pacientes com glaucoma corticogênico e correlação com o risco e a gravidade da doença. 2. PESQUISADOR: Dr. Niro Kasahara CARGO/FUNÇÃO: Médico INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº DEPARTAMENTO DE OFTALMOLOGIA DA I.S.C.M.S.P. 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: SEM RISCO [ ] RISCO BAIXO [x] RISCO MÉDIO [ ] 4. DURAÇÃO DA PESQUISA : dois anos III - REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA, CONSIGNANDO: O Sr(a). está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa envolvendo pacientes com e sem glaucoma. O objetivo da pesquisa é identificar a mutação mt.1 na região promotora do gene TIGR/MYOC que está relacionada com o desenvolvimento do glaucoma em nossa amostra de pacientes. Esse estudo poderá levantar dados que possibilitarão um conhecimento mais aprofundado sobre o glaucoma, doença que representa uma das principais causas de cegueira no mundo. Tanto as amostras de DNA, como a informação médica que forem obtidas para este estudo, poderão ser compartilhadas com outros pesquisadores, podendo assim ser utilizadas eventualmente para outros fins de pesquisa desta moléstia. O sigilo será mantido em todos os estudos colaborativos através da utilização de um código para a identificação dos indivíduos participantes.

106 Caso concorde em participar desse estudo, os pesquisadores participantes farão perguntas a respeito dos seus antecedentes médicos e familiais. A única vantagem que poderá ter é conhecer a presença da mutação mt.1 no gene TIGR/MYOC, que por ventura possa ser encontrada na análise do DNA obtido com a amostra de sangue coletada. No entanto, que essa análise pode não detectar a mutação. O(a) Sr(a) será submetido(a) a um exame oftalmológico para confirmar seu estado clínico. O exame oftalmológico tem o objetivo de observar se há alterações no olho que lembrem aquelas que vemos no glaucoma. Além disso, sua pressão ocular será medida, o que pode causar um leve ardor ocular ou embasamento transitório da visão, exame de campo visual e do fundo do olho também serão realizados. Estes procedimentos são normalmente realizados em qualquer exame oftalmológico, são seguros e não apresentam riscos à sua vista. Finalmente, uma amostra de sangue será colhida (5 ml, equivalente a uma colher de sopa) para pesquisa de gene TIGR/MYOC relacionado ao glaucoma. Hospitalização não será necessária. Os voluntários para o grupo controle, serão recrutados através de palestras ao público leigo, sobre o que é glaucoma e qual a finalidade do estudo. Serão realizados procedimentos que são normalmente realizados em qualquer exame oftalmológico como: medida da acuidade visual e da pressão ocular, realização de fundo de olho e campo visual com aparelho perimetria de freqüência dupla (FDT). A finalidade destes exames é excluir a possibilidade de haver no grupo controle algum individuo portador de glaucoma. Também será colhida uma amostra de sangue (5 ml) para pesquisa da mutação mt.1 no gene TIGR/MYOC relacionado ao glaucoma. Os procedimentos mencionados acima serão realizados dentro do primeiro ano após o seu consentimento em participar do estudo e, com exceção da coleta de amostra de sangue, fazem parte dos cuidados médicos de rotina para um paciente com glaucoma. Porém, a pesquisa laboratorial utilizando as amostras de sangue só poderá ser feita durante um período máximo de 5 anos após a coleta. Este prazo pode ser renovado mediante solicitação da instituição depositária, acompanhada de justificativa e relatório das atividades de pesquisa desenvolvidas com o material. O(a) Sr(a). poderá autorizar que o material genético, extraindo da amostra de sangue coletada, seja guardado. Os resultados deste estudo podem gerar interesse em outros estudos relacionados com o tema. Porém, qualquer outro projeto que pretenda utilizá seu material genético armazenado deverá ser aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa CONEP e com a obtenção de novo termo de consentimento e livre esclarecimento (TCLE), sempre que possível. ( ) Concordo que o material genético seja guardado. ( ) Não concordo que o material genético seja guardado. Desconfortos e riscos esperados: Uma coleta de 5 ml de sangue será efetuada. Os riscos associados a esse procedimento são mínimos, podendo ocorrer dor e manchas roxas (equimoses) no local da coleta de sangue. O desconforto será mínimo pois trata-se de uma coleta de sangue geralmente da veia do braço que será realizado por profissional treinado e devidamente habilitado para realizar esse procedimento. Benefícios que poderão ser obtidos: o Sr(a). não obterá nenhuma vantagem direta com a participação neste estudo e que o diagnóstico e o tratamento provavelmente não serão modificados. Os resultados dos testes moleculares que por ventura forem obtidos estarão disponíveis através do acompanhamento no ambulatório de origem. IV - ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA: Acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e benefícios relacionados à pesquisa, inclusive para dirimir eventuais dúvidas: Toda a informação médica, assim como o resultados dos testes genéticos decorrentes desse projeto de pesquisa, farão parte do prontuário médico do propósito e serão submetidos aos regulamentos das instituições participantes, referentes ao sigilo da informação médica e somente terão acesso aos resultados os pesquisadores

107 envolvidos e que não será permitido o acesso a terceiros (seguradoras, empregadores, supervisores hierárquicos, etc.). Liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de participar do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência: sua participação é voluntária e você poderá recusar a participar ou retirar seu consentimento interrompendo a sua participação no estudo a qualquer momento (incluindo a retirada da amostra de sangue) sem comprometer os cuidados médicos que recebe atualmente ou receberá no futuro nas instituições participantes. O Dr. Niro Kasahara poderá interromper a sua participação nesse estudo a qualquer momento que julgar apropriado. Neste estudo, o objetivo não é a realização de aconselhamento genético e sim da triagem da mutação genética que podem ou não aumentar a predisposição de desenvolver glaucoma. Portanto desejo ser informado dos resultados dos exames: ( ) SIM ( ) NÃO Salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade: se os resultados ou informações fornecidas forem utilizados para fins de publicação científica, nenhum nome será citado. Disponibilidade de assistência na Santa Casa, por eventuais danos à saúde, decorrentes da pesquisa: o(a) Sr(a) poderá requisitar informações adicionais relativas ao estudo a qualquer momento. O Dr Niro Kasahara, estará disponível para responder suas questões e preocupações no telefone (11) Ramal 5888 (ambulatório do Departamento de Oftalmologia da Santa Casa de São Paulo no Prédio Conde de Lara, toda terça e quarta-feira pela manhã). Em caso de recurso, dúvidas ou reclamações contatar a diretoria do Departamento de Oftalmologia da Santa Casa de São Paulo, locado no Prédio Conde de Lara, na rua Cesário Motta Júnior nº 112, bairro de Santa Cecília São Paulo SP. Considerando que os procedimentos propostos não oferecem risco à integridade física ou mental do sujeito voluntário participante do estudo, não está previsto ressarcimento ou indenização em caso de dano. Entretanto é assegurado ao voluntário o direito de recorrer aos órgãos competentes, caso considere necessário. V. INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS. 1. Dr. Niro Kasahara: Rua Peixoto Gomide, conjunto 53 - Cerqueira Cesar - São Paulo - SP VI - CONSENTIMENTO Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, consinto em participar da presente Pesquisa São Paulo, de de 200. assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal assinatura do pesquisador (carimbo ou nome Legível)

108 Apêndice 4. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de São Paulo.

109 Apêndice 5. Aprovação da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

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