WALISSON JUNIO MARTINS DA SILVA 1, FERNANDO TORRES MACHADO 2, LUISA TROILES ROMERO 2, ALESSANDRA LOPES DE OLIVEIRA 3

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1 EXTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DA POLPA DE PEQUI (Caryocar brasiliense Camb) UTILIZANDO CO 2 SUPERCRÍTICO E ETANOL E DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS WALISSON JUNIO MARTINS DA SILVA 1, FERNANDO TORRES MACHADO 2, LUISA TROILES ROMERO 2, ALESSANDRA LOPES DE OLIVEIRA 3 1 Pós-graduando em Engenharia de Alimentos. Laboratório de tecnologia à Alta Pressão e Produtos Naturais (LTAPPN), Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), Universidade de São Paulo (USP). 2 Graduandos em Engenharia de Alimentos, LTAPPN, FZEA, USP. 3 Docente, LTAPPN, FZEA, USP. RESUMO: O pequi (Caryocar brasiliense, Camb.) pode ser considerado boa fonte dos antioxidantes. Trabalhos envolvendo a quantificação de polifenóis (FT) e a atividade antioxidante (AA) de alimentos demonstram que o consumo de frutas ou de seus extratos estão relacionados à prevenção de várias doenças. A utilização de extrações que permitem a obtenção de extratos isentos de solventes, como é o caso das extrações supercríticas (SFE) utilizando o CO 2 e o etanol como modificador de polaridade é desejável. A partir de um delineamento central composto rotacional as variáveis do processo de extração supercrítica (pressão, temperatura e % de cossolvente) foram avaliadas em função do rendimento, FT e AA dos extratos. Extrações com maiores concentrações de etanol (10-15%) contribuíram para extratos com maior atividade antioxidante e teor de fenólicos totais, demonstrando a importância da utilização deste cossolvente para a obtenção de extratos mais ricos compostos de maior polaridade e que possuem atividade. Palavras-chave: Polifenóis, Fluído Supercrítico, Antioxidante. INTRODUÇÃO O pequi (Caryocar brasiliense Camb.) é uma fruta típica do Cerrado brasileiro. Ele é economicamente explorado pela população regional que o consome in natura, bem como utilizado na preparação de sucos, sorvete, licor, farinha, geleia e pratos tradicionais. No entanto, o consumo de pequi não é generalizado em todo o Brasil, uma vez que é altamente perecível (MACHADO, MELLO, HUBINGER, 2013). O óleo extraído da polpa de pequi é rico em polifenóis e carotenoides, fitoquímicos que beneficiam a saúde principalmente por meio da ação antioxidante e é excelente para o uso em cosméticos. Devido à importância econômica e nutricional do óleo de pequi, estudos sobre o emprego de extrações voltadas para a sustentabilidade, como é o caso da extração supercrítica utilizando o CO 2 puro ou na presença do cossolvente etanol, que geralmente permitem a obtenção de melhores rendimentos e que visem a maior preservação de seus compostos bioativos são consideravelmente relevantes para o enriquecimento desta área do conhecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a obtenção de extratos oleosos da polpa de pequi desidratada com altos rendimentos e verificar a extração de polifenóis, assim como a atividade antioxidante destes extratos obtidos utilizando o CO 2 supercrítico e o etanol, ambos solventes considerados como seguros (GRAS, Generally Reconized as Safe). MATERIAL E MÉTODOS Os frutos (pequis) foram provenientes do município de Mirabela, na região norte de Minas Gerais (latitude: 16º 15' 46" S, longitude: 44º 09' 52" W, altitude: 800 m, área: 723,3 Km 2, temperatura média é 21.8 C e média anual de pluviosidade é de mm). Os frutos foram sanitizados, descascados e despolpados manualmente. A polpa foi seca à 40 o C

2 durante 19 h em bandejas de aço inox perfuradas em estufa com circulação de ar forçada (Fanem 515, São Paulo, BR). A polpa seca foi acondicionada em embalagens plásticas impermeáveis ao vapor d água e, antecipando a extração, foi triturada em processador Walita twist (São Paulo, BR), e em seguida peneirada em peneira com diâmetro de 0,84 mm. EXTRAÇÃO SUPERCRÍTICA O processo de extração supercrítica (SFE) consistiu em promover o contato entre a matriz vegetal e o CO 2 supercrítico no extrator sob condições pré-estabelecidas de pressão (P), temperatura (T) e cossolvente (Cs). Na otimização do processo, em cada extração a massa de polpa de pequi seca (umidade menor que 3%) foi de 15 g, a vazão do CO 2 fixada em 5 g/min, a duração de cada extração foi de 3 h e as condições das variáveis do processo, P,T e Cs, definidas com base em um delineamento composto central rotacional (DCCR) (Tabela 1). O equipamento empregado foi o sistema de extração supercrítica TharSCF (Waters, Milford, USA). Além das extrações supercríticas, fez-se outra utilizando 15 g de polpa seca e solvente orgânico (50 ml de acetona) sob agitação constante em agitador magnético (Tecnal, Piracicaba, BR) durante 30 min. Tabela 1.Valores das variáveis utilizadas no DCCR para pressão, temperatura porcentagem de cossolvente para o estudo da otimização da extração com fluido supercrítico. Variáveis -α α Pressão (bar) Temperatura ( C) Etanol (%) 1, ,4 α=±1,68 DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS O conteúdo de fenólicos totais (CFT) foi analisado pelo método espectrofotométrico utilizando ácido gálico como padrão de referência, segundo a metodologia utilizada por Correia et al, (2011). A leitura em espectrofotômetro (Bioespectro SP22, São Paulo, BR) foi feita à 765nm. Os resultados foram expressos em µg de equivalentes ácido gálico-eag/g de extrato baseados numa curva de calibração. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DO RADICAL ABTS + (2,2' AZINO-BIS(3- ETILBENZOTIAZOLINA-6-ÁCIDO SULFÔNICO) Para a determinação da atividade antioxidante pelo método do radical ABTS + foi utilizada a metodologia descrita por RE et al. (1999). A leitura em espectrofotômetro (Biospectro SP 22, BR) a 734 nm, após 10 min de reação. Como solução-padrão, utilizou-se o antioxidante sintético Trolox diluído em etanol. RESULTADOS E DISCUSSÃO O maior rendimento obtido foi de 66,40%, nas condições de 350 bar, 45 C e 15% de etanol (ensaio 6, Tabela 2). O rendimento médio do extrato oleoso da polpa de pequi obtido por Ribeiro et al. (2012) foi de 60,53%, valor menor do que alguns valores de rendimentos das extrações supercríticas. Na análise dos efeitos principais (ensaios 1-9 mais os pontos centrais, 15, 16 e 17 da Tabela 2) das variáveis de extração nas respostas, especificamente para o rendimento (R), somente a pressão mostrou-se significativa à 95% de confiança (Tabela 3). Para as demais

3 respostas, conteúdo de fenólicos totais (FT) e atividade antioxidante (AA), nenhuma das três variáveis apresentaram-se significativas. Tabela 2. Rendimento (R) concentração de fenólicos totais (FT) e atividade antioxidante (AA) obtidos como resposta para os diferentes valores de P, T e Cs usados no DCCR completo. Ensaios P T ( o Cs Densidade FT (µgeag/g de ABTS + (μmtrolox/ g C) (bar) (%) CO 2 (g/cm 3 R (%) ) extrato) de extrato) ,86 35,47 60,53 ± 0,47 h 115,46± 10,79 h ,92 61,13 74,55 ± 0,37 d,e 301,07± 12,27 g ,86 31,47 67,30 ± 0,07 f,g 283,74 ± 10,16 g ,88 60,20 74,17 ± 2,54 e,f 559,46± 21,02 e ,86 39,67 67,75 ± 1,63 f,g 270,91 ± 6,37 g ,92 66,40 77,83 ± 1,28 c,d 814,15 ± 20,53 b,c ,86 34,40 78,53 ± 1,17 c,d 381,64± 14,09 f ,88 62,00 82,64 ± 1,80 b,c 759,08 ± 0,06 c,d ,80 18,93 45,93 ± 0,96 i 162,15 ± 8,15 h ,91 60,47 71,91 ± 0,12 e,f 744,08 ± 12,55 d ,90 63,20 74,70 ± 0,26 d,e 993,02 ± 48,02 a ,84 51,00 97,58 ± 0,51 a 864,21 ± 22,78 b ,6 0,87 46,53 67,61 ± 1,44 f,g 410,05 f ± 20,60 f ,4 0,87 65,13 83,57 ± 1,36 b 746,72 ± 43,38 d 15* ,87 56,27 67,36 ± 3,38 h 823,21 ± 20,65 c,d 16* ,87 60,93 64,42 ± 1,10 h 772,40 ± 27,90 c,d 17* ,87 54,53 60,85 ± 0,13 h 790,42 ± 34,85 c,d *Ponto Central. ** Médias de Tukey com letras iguais nas colunas não diferem (p<0,05) entre si. Tabela 3. Efeito estimado, erro padrão, coeficiente t, significância estatística e estimativas por intervalo para cada fator no modelo codificado para o R. Fatores Efeitos Erro Estimativa por intervalo t(4) p estimados padrão -95% +95% Média 51,134 2,003 25,532 0,000 45,573 56,694 P 27,180 4,697 5,787 0,004 14,139 40,221 T -3,650 4,697-0,777 0,480-16,691 9,391 Cs 3,550 4,697 0,756 0,492-9,491 16,591 PxT 0,985 4,697 0,210 0,844-12,056 14,026 PxCs -0,015 4,697-0,003 0,998-13,056 13,026 Em busca de compor um modelo para predizer a influência das variáveis nas respostas (R, FT e AA) avaliou-se os coeficientes que iriam compor um modelo de segunda ordem (ensaios 1-17, Tabela 2) segundo o planejamento experimental do tipo DCCR 2 3. Nas análises de variância (ANOVA) dos modelos quadráticos, apresentados no Quadro 1, com seus coeficientes significativos, constatou-se que os modelos que descrevem o comportamento do R e de FT são significativos e consequentemente preditivos, o que se constata nos valores dos coeficientes de determinação (R 2 ). Para R e FT todos os coeficientes de cada uma das variáveis (P, T e Cs) foram significativos, no entanto nenhum coeficiente das interações entre as variáveis apresentaram-se significativos (Quadro 1). Para a AA apenas a T não influenciou significativamente. Em condições de alta P e maiores teores de Cs os rendimentos tenderam a ser maiores, como pode ser notado na Tabela 2 e na superfície de resposta gerada pelo modelo (Figura 1). A densidade do CO 2 geralmente influencia no rendimento das extrações sendo que nas maiores densidades (alta pressão e baixa temperatura) os rendimentos foram maiores. O etanol interage fortemente com analitos através de, por exemplo, ligações de hidrogênio, dipolo-dipolo e dipolo induzido tendendo a resultar em melhoria significativa dos rendimentos de extração (AHLUWALIA, SHIVHARE e BASU, 2013), isto explica o fato de

4 que em alguns ensaios, a maior concentração de cossolvente resultou em maiores rendimentos e atividades, tanto que o coeficiente de Cs para as três respostas avaliadas foram positivos (Quadro 1). Quadro 1. ANOVA do modelo de segunda ordem do DCCR 2 3 para R, FT e AA. Rendimento R = 57, ,07P 6,57P 2 2,57T + 3,33Cs, R 2 =0,97. Fonte de Variação Soma dos Quadrados (SQ) Graus de Liberdade (GL) Quadrado Médio (QM) F calculado F tabelado Regressão (R) 3103, ,91 98,04 3,36 Resíduo (r) 93, ,81 Total (T) 3197,4 16 Fenólicos Totais FT = 64,35 + 5,41P + 4,08T + 7,30T 2 + 4,39Cs + 3,57Cs 2 R 2 =0,92. Regressão (R) 1843, ,64 27,37 3,20 Resíduo (r) 148, ,47 Total (T) 1991,34 16 Atividade Antioxidante AA = 808,82+172,86.P -167,41.P ,19.Cs 123,12.Cs 2, R 2 =0,85. Regressão (R) ,25 20,54 3,11 Resíduo (r) ,43 Total (T) F tabelado com 95% de confiança. F calculado (QM R /QM r ) maior que o F tabelado a 95% de confiança. Na superfície de resposta gerada pelo modelo que descreve o comportamento de FT com as variáveis do processo, especificamente T e Cs (Figura 2), para maiores T e teor de Cs a extração de fenólicos foi maior. O aumento da temperatura do processo pode acarretar no aumentou a solubilidade devido ao aumento da pressão de vapor do soluto. Na comparação de FT obtidos nos extratos via SFE com aqueles de extração convencional, (58,42 ± 2,86 µgeag/g de extrato) nota-se que os valores obtidos via SFE são superiores. Figura 1. Superfície de resposta gerada pelo modelo quadrático para o rendimento em função de P e T. Figura 2. Superfície de resposta dos efeitos das variáveis T e Cs no teor de polifenóis presentes no extrato. A influência das variáveis estudadas no processo de extração supercrítica indica que maiores concentrações de cossolvente (10-15%) propiciaram a obtenção de maiores atividades antioxidantes dos extratos, com a vantagem de, assim como o CO 2, apresentar toxicidade mais baixa em comparação a outros solventes e cossolventes. Na Figura 3 também é possível notar que o aumento da pressão contribuiu para o aumento da atividade antioxidante. Na análise da atividade antioxidante pelo método ABTS + o melhor resultado de acordo com o teste Tukey, foi obtido para o ensaio 11 (Tabela 2), porém foi menor do que o obtido por Morais et al., (2013), no qual o mesocarpo interno do pequi destacou-se em relação ao

5 potencial antioxidante pela captura de radical livre ABTS + com valores equivalentes a 1.230,00±0,125 μmol Trolox/g de extrato obtido quando empregou-se solventes polares na extração como metanol, acetona e água. Figura 3. Superfície de resposta dos efeitos das variáveis P e Cs na quantidade de radical ABTS + que reagiu com os antioxidantes presentes no extrato oleoso. CONCLUSÃO A utilização da extração supercrítica na presença de etanol possibilitou a obtenção de extratos naturais com elevada pureza e o extrato oleoso do pequi devido a sua riqueza em fitoquímicos e alto rendimento pode ser considerado como excelente matriz a ser utilizada, por exemplo, na indústria de alimentos, cosméticos e farmacêutica. REFERÊNCIAS AHLUWALIA S, SHIVHARE U.S, BASU S. Supercritical CO 2 Extraction of Compounds with Antioxidant Activity from Fruits and Vegetables Waste -A Review. Focusing on Modern Food Industry, v. 2, n.1, p.43-62, CORREIA, A. A. S.; GONZAGA, M. L. C.; AQUINO, A. C.; SOUZA, P. H. M.; FIGUEIREDO, R. W.; MAIA, G. A. Caracterização química e físico química da polpa do noni (Morinda citrifolia) cultivado no estado do Ceará. Alimentos e Nutrição, v. 22, n. 4, p , MACHADO, M.T.C. ; MELLO, B.C.B.S. ; HUBINGER, M. D. Study of alcoholic and aqueous extraction of pequi (Caryocar brasiliense Camb.) natural antioxidants and extracts concentration by nanofiltration. Journal of Food Engineering, v. 117, p , MORAIS, M. L. ; SILVA, A. C. R. ; ARAÚJO, C. R. R. ; ESTEVES, E. A. ; PINTO, N. A. V. D. Determinação do potencial antioxidante in vitro de frutos do Cerrado brasileiro. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 35, p , OLIVEIRA, L.R. Avaliação dos compostos fenólicos e das propriedades antioxidantes da polpa do pequi (Caryocar spp) processado e in natura f. Dissertação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, RE, R., PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, PANNALA A, YANG M, RICE-EVANS C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, v. 26, n. 9/10, p , RIBEIRO, M. C. ; VILAS BOAS, E. V. B. ; RIUL, T. R. ; PANTOJA, L. ; MARINHO, H. A. ; SANTOS, A. S. Influence of the extraction method and storage time on the physicochemical properties and carotenoid levels of pequi (Caryocar brasiliense Camb.) oil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 32, n.2, p , AGRADECIMENTOS: Á Capes e ao Banco Santander pelas bolsas concedidas. Autor a ser contatado: alelopes@usp.br