EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOLÓGICOS DE H. pluvialis

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1 EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOLÓGICOS DE H. pluvialis N. Mezzomo 1,2, T. C. S. Pereira 1, L. M. O. Reis 3, K. O. de Matos 4, M. Zimmermann 3, S. R. S. Ferreira 1 1-Laboratório de Termodinâmica e Extração Supercrítica, Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Trindade CEP: Florianópolis SC Brasil, Telefone: +55 (48) (natimezzomo@gmail.com) 2- Instituto Federal Catarinense (IFC), Campus Brusque R. Hercilio Luz, 373 Centro, Brusque SC - Brasil 3- Brastax Tecnologias Sustentáveis de Saneamento com Microalgas R. Uruguai, 458, Centro, UNIVALI, ITE_UNIINOVA, Itajaí SC Brasil, Telefone: +55 (47) Núcleo Avançado, Instituto SENAI de Tecnologia em Alimentos e Bebidas FIESC/SENAI, Rodovia SC 401, 3730, Saco Grande CEP: Florianópolis SC Brasil, Telefone: +55 (48) RESUMO O presente trabalho objetivou avaliar a extração de astaxantina a partir de H. pluvialis, utilizando diferentes sistemas de extração. Os seguintes sistemas foram aplicados: extração supercrítica (ESC) a 260 bar/60 o C com dióxido de carbono (CO 2 ) puro e CO 2 + cossolventes (etanol e acetona).; Soxhlet com acetona e etanol; e extração a frio com acetona e etanol. Os resultados indicaram que a ESC com CO 2 puro foi pouco eficiente para extração de astaxantina, mas tanto rendimento em extrato como teor de astaxantina total foram incrementados com o uso de cossolvente. Os resultados de potencial antioxidante dos extratos ESC foram promissores, com destaque para CO 2 +etanol. Os sistemas a baixa pressão, em especial Soxhlet com acetona, promoveram maiores rendimentos em extrato e conteúdo de astaxantina total. Finalmente, os extratos de H. pluvialis se mostraram potenciais para uso como corante e/ou como agente antioxidante. ABSTRACT This study aimed to evaluate the astaxanthin extraction from H. pluvialis using different extraction systems. The following systems were applied: supercritical fluid extraction (SFE) at 260 bar/60 C with pure carbon dioxide (CO 2 ) and CO 2 + co-solvents (ethanol and acetone); Soxhlet with acetone and ethanol; and cold extraction with acetone and ethanol. The results indicated that the SFE with pure CO 2 was inefficient for astaxanthin extraction, but both extraction yield as total astaxanthin content were increased with the use of cosolvent. The results of antioxidant potential of SFE extracts were promising, especially for CO 2 +ethanol. The low pressure systems, in particular Soxhlet with acetone, promoted higher extraction yield and total astaxanthin content. Finally, the H. pluvialis extract showed potential for use as colorant and/or as an antioxidant agent. PALAVRAS-CHAVE: astaxantina; antioxidante; extração supercrítica KEYWORDS: astaxanthin; antioxidant; supercritical fluid extraction. 1. INTRODUÇÃO. A Haematococcus pluvialis é uma alga de água doce e considerada a maior fonte de astaxantina encontrada na natureza. A astaxantina é um pigmento que apresenta importante atividade biológica, principalmente protegendo sistemas contra espécies reativas, peroxidação lipídica oxidação dos ácidos graxos poliinsaturados essenciais, luz UV-b, entre outros. A astaxantina (3,3 - dihidroxi-β,β-caroteno-4,4 -diona) é um oxicarotenóide de fórmula C40H52O4 e peso molecular 596,86 g/mol. Na forma cristalina e pura, aparece como um pó fino de coloração escura violeta

2 amarronzada. Seu ponto de fusão é de aproximadamente 224 o C. É insolúvel em solução aquosa, podendo ser dissolvida à temperatura ambiente em diclorometano, clorofórmio, acetona, dimetilsulfóxido e outros solventes não polares (JOHNSON e AN, 1991). Um crescente interesse no uso de astaxantina na avicultura e na piscicultura tem se desenvolvido (PANGANTIHONKUHLMANN et al., 1998) uma vez que este pigmento não é sintetizado por animais, devendo ser adicionado às rações de forma a se obter uma coloração atraente para os consumidores. Além disso, a astaxantina é um poderoso antioxidante, com atividade 10 vezes superior à zeaxantina, luteína, cantaxantina e β-caroteno. Ainda, apresenta propriedades antitumorais, o que aumenta seu potencial de utilização na área da saúde (SHIMIDZU et al., 1996). Até 2009, toda a produção comercial de astaxantina foi de forma sintética através de fontes químicas, com uma movimentação anual de US$ 200 milhões, gerando um preço de mercado de US$ 2.000,00/kg astaxantina (ALGA TECHNOLOGIES, 2009). Estes altos custos de síntese, aliado à crescente preocupação com a segurança alimentar ocasionada pelos aspectos negativos dos pigmentos sintéticos, tem estimulado a busca de alternativas naturais para estes corantes. A bioprodução industrial de carotenoides está bem estabelecida e vem se expandindo comercialmente. Porém, as operações de extração e recuperação do produto, bem como a extração diretamente a partir de matrizes vegetais consideradas fontes desses compostos estão ainda em fase de desenvolvimento. Além disso, esta etapa do processo contribui para aumento dos custos da produção, enfatizando a necessidade de aprofundamento dos estudos nesta área. O fator limitante das técnicas que utilizam altas quantidades de organossolventes está na presença de resíduos de solventes de extração nos extratos e no produto final. O uso de pigmentos naturais que sejam extraídos por solvente torna-se pouco viável à medida que o que se busca justamente é algo mais saudável. Além disso, um grande número de solventes orgânicos utilizados em tecnologias tradicionais de extração é tóxico e de difícil remoção dos extratos, o que tem consequências negativas nomeadamente no setor alimentar, farmacêutico e cosmético. Um método convencional é a extração Soxhlet com solventes orgânicos, principalmente acetona. Alguns dos problemas desse método incluem o tempo excessivo e a alta temperatura requerida para remover o solvente remanescente no produto (CAMPOS et al., 2005; MEZZOMO et al., 2013). Uma das alternativas as técnicas convencionais de extração esta técnica eh o processo de extração com fluido supercrítico (ESC). A ESC é uma técnica de separação a altas pressões em que o solvente é um fluido se encontra em estado termodinâmico supercrítico. Neste estado, fluidos supercríticos exibem propriedades físico-químicas intermediárias às de um líquido e um gás, o que aumenta sua eficácia como solvente. Além disso, o poder de dissolução de compostos de interesse no fluido pode ser regulado através do controle da pressão e da temperatura (BRUNNER, 1994). Assim, o presente trabalho objetivou avaliar a extração de astaxantina a partir de Haematococus pluvialis, utilizando diferentes sistemas de extração a baixa e alta pressão. 2. MATERIAL E MÉTODOS. 2.1 Obtenção e preparo da matéria-prima. A microalga Haematococcus pluvialis, matéria-prima utilizada para o emprego das diferentes técnicas de extração, foi fornecida pela Brastax Tecnologias Sustentáveis de Saneamento com Microalgas (Itajaí/SC). A matéria-prima foi armazenada com proteção de luz e oxigênio na temperatura e -18 o C até sua utilização nos procedimentos descritos a seguir. 2.2 Sistemas de extração a alta e baixa pressão. A fim de extrair com maior eficiência a astaxantina e/ou compostos antioxidantes de H. pluvialis, foram aplicados os seguintes sistemas de:

3 - Extração Supercrítica (ESC): O equipamento de ESC utilizado consiste de um reservatório de dióxido de carbono (CO 2 ), uma bomba de alta pressão, banhos termostáticos para garantir o CO 2 no estado líquido na entrada da bomba e para definir a temperatura de extração, além de sistema de despressurização (válvulas do tipo agulha com aquecimento), coletor do soluto, manômetros de controle de pressão em diversos pontos e medidor da vazão de solvente. O procedimento de operação detalhado é descrito na literatura da área (CAMPOS et al., 2005; MEZZOMO et al., 2013). Os experimentos de ESC foram realizados na vazão de 0,4 kg CO2 /h e condições de pressão e temperatura de 260 ± 4 bar e 60,0 ± 0,2 o C, durante 3 horas, empregando 10 g de microalga e com: a) CO 2 puro (99,9 %, 60 bar, White Martins); b) CO % (m/m) etanol (P.A., Neon); c) CO % (m/m) acetona (P.A., Vetec). A fim de garantir a máxima remoção de solvente, a mistura soluto + solvente foi submetida à evaporação rápida (sob vácuo com aquecimento reduzido). As ESC foram realizadas em, no mínimo, duplicata. - Soxhlet com acetona e etanol: A técnica de Soxhlet caracteriza-se pelo emprego de solventes orgânicos em um extrator acoplado na extremidade inferior a um balão de 250 ml e na extremidade superior a um condensador (CAMPOS et al., 2005). Para cada extração, 5 g de microalga foram envolvidas em papel filtro, formando um cartucho que inserido no extrator, e 150 ml de solvente (etanol, P.A. Neon, e acetona, P.A. Vetec) foram adicionados ao balão e aquecidos até ebulição e, com o aquecimento/resfriamento se fez o refluxo do solvente por 8 horas com proteção de luz. Após a extração, a mistura soluto + solvente foi submetida à evaporação (sob vácuo com aquecimento reduzido) para a concentração do extrato e eliminação do solvente. As extrações Soxhlet foram realizados em, no mínimo, duplicata. - A frio: As extrações a frio foram realizadas utilizando os solventes acetona (P.A., Vetec) e etanol (P.A., Neon). O procedimento, descrito por Passos et al. (2006), consiste em adicionar 100 ml de solvente a 1 g de microalga, agitar vigorosamente em vortex (1 min, duas vezes). A mistura é então centrifugada e o sobrenadante coletado. À fase sólida são adicionados novamente 100 ml de solvente e a mistura é novamente agitada, centrifugada e separadas as fases, por duas vezes (totalizando 300 ml de solvente). Após a extração, a mistura soluto + solvente foi submetida a evaporação (sob vácuo com aquecimento reduzido) para a concentração do extrato e eliminação do solvente. Os extratos foram acondicionados em frascos com proteção de luz e, após cada procedimento de extração, submetidos a troca de atmosfera com uso de nitrogênio gasoso (99,9 %, White Martins), a fim de reduzir a oxidação dos compostos-alvo. Os frascos foram fechados hermeticamente e armazenados a -18 o C até o momento das análises de conteúdo de astaxantina e potencial antioxidante (procedimentos descritos nos próximos subitens). O rendimento de extrato foi calculado pela razão entre a massa de extrato obtida e a massa de microalga utilizada, em percentual. 2.5 Quantificação do teor de astaxantina dos extratos. A quantificação de astaxantina foi realizada em espectrofotômetro (Genesys 10Vis, Spectronic Unicam) fazendo uso de curva analítica de astaxantina, conforme descrito por Camargo (2010). 2.6 Determinação do potencial antioxidante dos extratos.

4 O potencial antioxidante dos extratos de H. pluvialis foi avaliado por duas metodologias, a saber: 1) Método de descoloração do β-caroteno/ácido linoleico: O método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação oxidativa do ácido linoleico. A taxa de descoloração da solução de β- caroteno é determinada pela medida entre a diferença da leitura espectrofotométrica inicial a 470 nm e após 120 minutos (MATTHÄUS, 2002). 2) Método ABTS: A atividade antioxidante dos extratos é avaliada de acordo com a metodologia descrita por Re et al. (1999). O radical monocátion pré-formado ABTS + [2,2 - azino-bis-(3-etil-benzotiazolina-6-ácido sulfônico)] é gerado pela oxidação química do ABTS, e é reduzido na presença de antioxidante doador de hidrogênio. Utiliza-se o Trolox, vitamina E sintética (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico), como antioxidante referência, o qual é preparado em etanol e estocado como solução padrão em curva analítica. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 3.1 Sistemas de extração e rendimento em extrato. A Figura 1 apresenta os rendimentos em extrato para todos os sistemas extrativos aplicados a H. pluvialis. Figura 1 Rendimento em extrato (g extrato /g microalga, %) de H. pluvialis pelos sistemas de extração a baixa e alta pressão As ESC proporcionaram os menores rendimentos em extrato (de 1,2 ± 0,1 % a 7,2 ± 0,2 %) quando comparados aos sistemas de extração a baixa pressão. A literatura indica (PASSOS et al., 2006; WANG et al., 2012) que para extrair eficientemente astaxantina, principal carotenoide produzido pela H. pluvialis, devem ser aplicadas pressões acima de 350 bar. Ainda, como observado na Figura 1, o rendimento aumentou expressivamente com a aplicação de etanol e acetona, sendo que o etanol promoveu os maiores rendimentos também na ESC. Os resultados apresentados na Figura 2 indicam que os rendimentos mais elevados foram obtidos na Soxhlet, alcançando valores de até 16 ± 2 % utilizando etanol como solvente. A temperatura de operação, o reciclo de solvente e as interações solventes-componentes da H. pluvialis podem ter contribuído para a maior dissolução e, consequentemente, maiores rendimentos. Na

5 Soxhlet, o solvente é utilizado em sua temperatura de ebulição e nesta condição a tensão superficial e viscosidade do solvente são muito reduzidas quando comparadas a uma temperatura inferior. Assim, o solvente pode alcançar os espaços da matriz que contém solutos com maior facilidade, solubilizando uma maior quantidade e variedade de solutos (MARKON et al., 2007). 3.2 Teor de astaxantina total dos extratos. A Figura 2 apresenta o teor de astaxantina total dos extratos obtidos pelos diferentes sistemas extrativos. O teor de astaxantina total foi superior quando se utilizou acetona (como solvente, nas extrações a baixa pressão, ou como cossolvente na ESC), mesmo não apresentando os maiores rendimentos em extrato (resultados da subseção 3.1). O maior teor de astaxantina total foi apresentado pelo extrato de H. pluvialis obtido por Soxhlet com acetona (329 ± 5 mg astaxantina /g extrato ), demonstrando a seletividade da acetona para a concentração deste carotenoide. Figura 2 Teor de astaxantina total (µg astaxantina /g extrato ) de extratos de H. pluvialis obtidos pelos sistemas de extração a baixa e alta pressão 3.3 Potencial antioxidante dos extratos. Os resultados de potencial antioxidante pelo método do β-caroteno/ácido linoleico estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1 Potencial antioxidante (PA), determinados pelos métodos β-caroteno/ácido linoleico e radical ABTS, dos extratos de H. pluvialis obtidos por extração supercrítica (ESC) e a baixa pressão Sistema de extração PA sist. β-carot./ác.linol. (%) PA ABTS (µmol Trolox /g extrato ) ESC CO 2 puro 109,42 ± 0, ± 9 ESC CO 2 + Acetona 109,04 ± 0, ± 43 ESC CO 2 + Etanol 108,31 ± 1, ± 16 Soxhlet Acetona 109,98 ± 0, ± 27 Soxhlet Etanol 110,12 ± 0, ± 13 A frio Acetona 105,43 ± 1, ± 45 A frio - Etanol 108,21 ± 2, ± 9 Os valores de potencial antioxidante determinados pelo método do β-caroteno/ác. linoleico (PA sist.β-carot./ác.linol. ) não variaram expressivamente entre os diferentes tipos de extratos, com valores entre 105,43 ± 1,72 % e 110,12 ± 0,97 %. Estes valores estão muito próximos ao do antioxidante

6 comercial hidroxitolueno butilado (BHT) (113 ± 7 %), determinado por Benelli et al. (2010), indicando o alto potencial antioxidante dos extratos de H. pluvialis. Os resultados de PA ABTS, assim como os de PA β-carot./ác.linol., foram promissores, chegando a 646 ± 45 µg Trolox /g extrato. Os extratos apresentaram valores de PA ABTS diferentes dentre as tecnologias de extração empregadas, ao contrário do que aconteceu para PA β-carot./ác.linol.. Nos extratos obtidos por ESC, a mistura CO 2 + etanol proporcionou o melhor potencial antioxidante pelo método do ABTS (521 ± 16 µg Trolox /g extrato ), com aumento expressivo em comparação ao uso de CO 2 puro e CO 2 + acetona. 4. CONCLUSÕES. Os resultados do presente trabalho indicam que a ESC com CO 2 puro a 260 bar foi pouco eficiente para extração de astaxantina quando comparada aos sistemas extrativos a baixa pressão. Em contrapartida, tanto rendimento em extrato como teor de astaxantina total foram incrementados com o uso de acetona como cossolvente. Os sistemas a baixa pressão, em especial o Soxhlet com acetona, promovem maiores rendimentos em extrato e conteúdo de astaxantina total. Assim, os extratos de H. pluvialis se mostraram potenciais para uso como corante, em especial o obtido por Soxhlet com acetona, e/ou como agente antioxidante, com destaque para os extratos obtidos por extração a frio com acetona e por ESC com CO 2 + etanol. 5. AGRADECIMENTOS. A empresa Brastax Tecnologia em Microalgas por ceder a matéria-prima, e a CAPES (PNPD proc. nr / ) pela bolsa de pós-doutorado. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Alga Tecnologies. Disponível em: (2009). Brunner, G. (1994). Gas extraction: an introduction to fundamentals of supercritical fluids and the application to separation process. v.4. Darmstadt: Steinkopff. Camargo, A. P. S. (2010). Extração supercrítica de astaxantina e lipídeos ricos em ácidos graxos w-3 a partir de resíduos de camarão-rosa (Farfantepenaeus paulensis). Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas, Campinas. Campos, L. M. A. S., Michielin, E. M. Z., Danielski, L., Ferreira, S. R. S. (2005). Experimetal Data and Modeling the Supercritical Fluid Extraction of Marigold (Calendula officinalis) Oleoresin. Journal of Supercritical Fluids, 34(2), Johnson, E. A., An, G. H. (1991). Astaxanthin from microbial sources. Critical Review on Biotechnology, 11, Matthäus, B. (2002). Antioxidant activity of extracts obtained from residues of different oilseeds. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 50, Mezzomo, N., Martínez, J., Maraschin, M., Ferreira, S. R. S. (2013). Pink shrimp (P. brasiliensis and P. paulensis) residue: Supercritical extraction of carotenoid fraction. Journal of Supercritical Fluids, 74, Panfantihon-Kulhmann, M. P., Millamena, O., Chern, Y. (1998). Effect of dietary astaxanthin and vitamin A on the reproductive performance of Penaeus monodon broodstock. Aquatic Living Resources, 11(6), Passos, R., Beirão, L., Palavra, A., Mendes, R., Nobre, B., Gouveia,L. (2006). Astaxanthin from the yeast Phaffia rhodozyma. Supercritical carbon dioxide and organic solvents extraction. Journal of Food Technology, 4(1), Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical decolourization assay. Free Radical Biology & Medicine, 26, Shimidzu, N., Goto, M., Miki, W. (1996). Carotenoids as singlet oxygen quenchers in marine organisms. Fisheries Science, 62/1,

7 Wang, L., Yang, B., Yan, B., Yao, X. (2012). Supercritical fluid extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis and its antioxidant potential in sunflower oil. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 13,