Graduandos em Engenharia de Alimentos, LTAPPN, FZEA, USP.

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1 INFLUÊNCIA DA PRESENÇA DE COSSOLVENTE NA EXTRAÇÃO SUPERCRÍTICA DA POLPA DO PEQUI (CARYOCAR BRASILIENSE CAMB.) WALISSON JUNIO MARTINS DA SILVA 1, LUISA TROILES ROMERO 2, FERNANDO TORRES MACHADO 2, ALESSANDRA LOPES DE OLIVEIRA 3 1 Pós-graduando em Engenharia de Alimentos. Laboratório de tecnologia à Alta Pressão e Produtos Naturais (LTAPPN), Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), Universidade de São Paulo (USP). 2 Graduandos em Engenharia de Alimentos, LTAPPN, FZEA, USP. 3 Docente, LTAPPN, FZEA, USP. RESUMO: O pequi (Caryocar brasiliense, Camb.) fruto típico do Cerrado brasileiro pode ser considerado boa fonte de compostos antioxidantes, pois é rico em polifenóis e carotenoides. O estudo da obtenção de extratos pelo emprego de inovação tecnológica, por exemplo, a extração supercrítica com ou sem emprego de cossolvente visa o conhecimento da composição do extrato para a verificação da disponibilidade de nutrientes e compostos bioativos. Na comparação dos extratos obtidos da polpa de pequi pelo emprego de CO 2 supercrítico sem e com etanol ou óleo de palma como cossolvente constatou-se que o uso do etanol contribuiu para maior rendimento, fenólicos totais e maior atividade antioxidante, sendo, portanto a presença deste cossolvente desejável para a extração supercrítica desta matriz. Palavras-chave: Pequi, Etanol, Fluído Supercrítico. INTRODUÇÃO O Cerrado se destaca pela riqueza de sua flora e fauna na sua vasta extensão territorial. Os frutos das espécies nativas desse bioma além de valores nutricionais e medicinais apresentam atrativos sensoriais como cor, sabor, aromas peculiares (RODRIGUES et al., 2013). Diversos estudos têm comprovado o alto valor nutricional do pequi, fruto presente no Cerrado. É altamente calórico, rico em lipídios, proteínas, fibras, carboidratos simples, além de teores expressivos de carotenoides, polifenóis e vitamina C, sendo superior a diversas frutas, amplamente, difundidas no mercado (GONÇALVES et al, 2010). O consumo e o uso do pequi ainda estão muito restritos à população regional, onde é explorado de forma extrativista. Na época da safra, o pequi se torna a principal fonte de renda e alimento de muitas famílias, entretanto, ocorre grande perda de frutos, devido a sua alta perecibilidade e, principalmente, à falta de métodos adequados de conservação (VILAS BOAS et al. 2012). Dente as alternativas para aumentar a utilização desses frutos, inclui-se a extração do óleo, matéria-prima, por exemplo, para a indústria de cosméticos, de alimentos ou nutracêutico. No estudo de otimização e escolha do processo de extração mais adequado para obter substâncias bioativas, deve-se levar em conta a qualidade do produto final, pois muitos consumidores estão cada vez mais desejando produtos provenientes de tecnologias que prezam pela sustentabilidade. Diante disto, há a necessidade de emprego de métodos que propiciem além de maiores rendimentos e ao mesmo tempo maiores teores de compostos bioativos extraídos, isenção de resíduos de solventes já que são cada vez maiores as restrições ambientais e de saúde pública, em relação a resíduos de solventes orgânicos. Estes fatores são os principais estímulos ao desenvolvimento de tecnologias mais limpas, evidenciando a importância da otimização do processo de extração de produtos naturais utilizando inovação tecnológica (ALBUQUERQUE, 2008).

2 No âmbito da produção de alimentos, a extração utilizando o dióxido de carbono (CO 2 ) é muito bem aceita já que também é solvente considerado como seguro (GRAS, Generally Reconized as Safe). Os extratos sem resíduos de solventes podem ser facilmente obtidos com CO 2 supercrítico e após a extração, não é necessário aplicar calor para vaporizar o solvente, porque ele é eliminado espontaneamente como gás quando a pressão diminui no decorrer da extração. A principal desvantagem de CO 2 supercrítico é a sua capacidade limitada para extrair compostos polares. O emprego de cossolvente como o etanol, por exemplo, modifica a polaridade do CO 2 supercrítico e pode propiciar a extração destes compostos, o emprego do etanol também se justifica por ser GRAS (REGLERO, SE- ORANS, IBÁ-EZ, 2005). Fluidos supercríticos são bastante atrativos para o processamento de produtos ricos em compostos bioativos, devido a características como possibilidade de direcionar a separação alterando temperatura e/ou pressão e cossolvente(s), com isso, possibilitando o maior poder de solubilização do fluído e deste modo melhorar o rendimento da extração. Outra vantagem desta tecnologia refere-se ao emprego de baixas temperaturas no processo, o que propicia maior teor de substâncias que poderiam ter instabilidade térmica fato comum nas técnicas de extração feitas sob baixa pressão e na presença de luz e oxigênio (OLIVEIRA et al., 2013; MORAES et al., 2013). O objetivo deste trabalho foi comparar a influência da presença de cossolventes no rendimento, teor de polifenóis, carotenoides totais e na atividade antioxidante de extratos oleosos obtidos da polpa de pequi utilizando a extração supercrítica tendo o CO 2 como solvente. MATERIAL E MÉTODOS Os frutos (pequis) foram provenientes do município de Mirabela, na região norte de Minas Gerais (latitude: 16º 15' 46" S, longitude: 44º 09' 52" W, altitude: 800 m, área: 723,3 Km 2, temperatura média é 21.8 C e média anual de pluviosidade é de mm).os frutos foram lavados em água corrente com detergente neutro e em seguida sanitizados em solução de hipoclorito de sódio 300 ppm, por 15 min. Os frutos foram descascados e despolpados manualmente. A polpa foi seca à 40 o C durante 19 h em bandejas de aço inox perfuradas em estufa com circulação de ar forçada (Fanem 515, São Paulo, BR). A polpa seca foi acondicionada em embalagens plásticas impermeáveis ao vapor d água e, antecipando a extração, foi triturada em processador Walita twist (São Paulo, BR), e em seguida peneirada em peneira com diâmetro de 0,84 mm. Assim a granulometria das partículas do fruto utilizado nos processos de extração apresentava diâmetro inferior a 0,84 mm. A uniformização das partículas em tamanhos pequenos foi feita para possibilitar maior uniformidade e, portanto, controle na difusividade do solvente durante a extração. As extrações supercríticas foram feitas com duração de 3 h, massa de 15 g de polpa seca e triturada, vazão de CO 2 a 5 g/min, pressão de 300 bar e temperatura de 58 C, utilizando uma proporção de 10% de cossolvente. Três foram as extrações, na primeira foi utilizado 90:10 (%m/m) respectivamente de CO 2 e etanol, misturados no próprio sistema de extração. Na segunda 1,5 g ou 10% de óleo de palma foi homogeneizado na polpa antes de ser submetida à extração com CO 2 supercrítico e a terceira extração foi feita sem o uso de cossolvente. DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS O conteúdo de fenólicos totais (CFT) foi analisado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau utilizando ácido gálico como padrão de referência, segundo a metodologia utilizada por Correia et al, (2011) com modificações. Em tubo de ensaio foram pipetadas diluições do extrato em meio etanólico, adicionados 1 ml do reagente Folin-Ciocalteau diluídos em água (1:9), agitado e mantido por 5 min para reagir. Em seguida foram

3 adicionados 2 ml de carbonato de sódio (10 v%) e novamente agitados os tubos, que foram mantidos por 30 min. para reagir. A fração contendo os polifenóis foi colhida e diluída em água. A leitura em espectrofotômetro (Bioespectro SP22, São Paulo, BR) foi feita à 765nm. Os resultados foram expressos em µg de equivalentes ácido gálico-eag/g de extrato baseados numa curva de calibração. QUANTIFICAÇÃO DOS CAROTENOIDES A concentração de carotenoides (CC) foi determinada por análise espectrofotométrica, conforme metodologia descrita por Higby (1962). Para a realização da análise do teor de carotenoides nas amostras, 200 µl de óleo foram dissolvidos em 800 µl de hexano. Deste volume, foram retirados 50 µl e resuspendidos em µl de hexano. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro UV-Vis (Bioespectro SP22, São Paulo, BR) em 450 nm, e os resultados expressos em mg de carotenoides totais por 100 g, foram calculados segundo a equação 1. Onde, A 450 = absorbância em 450 nm; L = largura da cubeta (cm); e W = quociente entre a massa da amostra original (g) e o volume final da diluição (ml). ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DO RADICAL ABTS + (2,2' AZINO-BIS(3- ETILBENZOTIAZOLINA-6-ÁCIDO SULFÔNICO) Para a determinação da atividade antioxidante pelo método do radical ABTS + foi utilizada a metodologia descrita por RE et al. (1999). Inicialmente, foi formado o radical ABTS +, a partir da reação de 7 mm de ABTS com 2,45 mm de persulfato de potássio, os quais foram incubados à temperatura ambiente e na ausência de luz, por 16 h. Transcorrido esse tempo, a solução foi diluída em etanol até a obtenção de uma solução com absorbância de 0,70 (± 0,10). Para realizar as análises, foram adicionados 100 µl da amostra diluída 1:10 em etanol a 3000 µl da solução contendo o radical e determinada a absorbância em espectrofotômetro (Biospectro SP 22, BR) a 734 nm, após 10 min de reação. Como solução-padrão, utilizou-se o antioxidante sintético Trolox nas concentrações de 100; 200; 400; 800 e e 2000 µm em etanol. As leituras foram realizadas em triplicata, e os resultados expressos em mm de Trolox por grama de óleo. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1 estão representados os rendimentos, o conteúdo de fenólicos totais (CFT), a proporção de carotenoides nos extratos e a atividade antioxidante. O maior rendimento (62%) foi obtido quando etanol foi utilizado como cossolvente ou modificador de polaridade, valor maior do que o encontrado por Ribeiro et al., (2012) que obteve rendimento de 60,53%. Quando se empregou somente o CO 2 em estado supercrítico o rendimento de aproximadamente 42% não diferiu daquele obtido quando óleo de palma foi empregado como cossolvente. Quando etanol foi empregado como cossolvente o rendimento foi consideravelmente maior (Tabela 1). Este comportamento pode ser associado à polaridade do cossolvente, pois o óleo de palma por ser apolar não influencia consideravelmente na classe dos compostos extraídos, no entanto, a polaridade do etanol modificou a do CO 2 de forma a extrair também os compostos polares presentes na polpa de pequi. [1]

4 Tabela 1. Rendimento, concentração de carotenoides, fenólicos totais e atividade antioxidante obtidos nas extrações supercríticas. Tipo de extração Carotenoides Rendimento Fenólicos Totais ABTS + Totais (%) (µg EAG/g)* (μmtrolox/g)* (mg/100g)* Sem cossolvente 41,86 58,94 ± 5,34 b* 16,34 ± 0,84 a 461,36 ± 22,83 b Com óleo de palma 42,53 65,09 ± 2,18 b 16,16 ± 0,11 a 623,07 ±06,41 b Com etanol 62,00 97,57 ± 0,77 a 14,38 ± 0,06 b 864,21 ± 22,78 a Óleo de palma** 103,22±6,13 a 599,21 ± 09,31 b * Médias de Tukey com letras diferentes nas colunas diferem (p<0,05) entre si. ** Este óleo foi avaliado visando observar sua possível influência no extrato obtido. A quantidade de fenólicos totais (CFT) foi significativamente maior para os extratos obtidos quando etanol foi usado como cossolvente indicando que, como esperado, muitos compostos fenólicos têm características polares o que propicia uma maior atividade antioxidante (Tabela 1). A concentração de compostos fenólicos nos extratos obtidos quando empregou-se óleo de palma como cossolvente, não diferiu significativamente do extrato obtido quando CO 2 foi empregado. O mesmo comportamento ocorreu para o conteúdo de carotenoides totais, cujos resultados não diferiram significativamente entre os extratos obtidos com CO 2 supercrítico ou CO 2 supercrítico com óleo de palma como cossolvente (Tabela 1). Entretanto, para estas extrações a concentração de carotenoides obtida quando etanol foi usado como modificador de polaridade foi inferior. Este comportamento também era esperado já que os carotenoides normalmente são extraídos associados aos compostos apolares. O óleo de palma utilizado além de refinado, não continha antioxidante sintético adicionado, mesmo assim foi encontrada significativa quantidade de polifenóis os quais quando comparados aos extratos obtidos não contribuíram para maior atividade antioxidante deste e nem para o extrato oleoso da polpa de pequi que o continha (Tabela 1). A influência positiva do etanol como cossolvente na atividade antioxidante dos extratos pode ser visualizada na Figura 1, sendo a correlação entre atividade antioxidante e fenólicos totais equivalente a 0,96. Figura 1. Atividade antioxidante dos extratos do óleo de palma. Diante da possibilidade de obter extratos com alto rendimento utilizando solvente GRAS, mais condições de extração supercríticas foram avaliadas e ao extrair a amostra nas condições de 350 bar, 55 C utilizando 15% de etanol, obteve-se 27,63 mg/100 g de carotenoides totais, indicando que o aumento destas variáveis contribuiu para a maior extração destes compostos.

5 CONCLUSÃO Na comparação das condições de extração empregadas, no que se refere ao emprego de cossolventes, já que as condições de P, T e vazão foram mantidas constantes, constatou-se que o emprego de etanol possibilitou maior extração de compostos fenólicos de maior polaridade o que refletiu em uma maior atividade antioxidante. A extração destes compostos influenciou o rendimento, o qual também foi superior. Desta maneira, o emprego de etanol como cossolvente no processo de extração supercrítica é vantajoso na obtenção de extratos ricos em compostos fenólicos, mas não quando o objetivo for obter extratos ricos em carotenoides. REFERÊNCIAS ALBUQUERQUE, C.L.C. Extração Supercrítica de Matrizes Vegetais Oleaginosas:rendimento global, cinética de extração, composição química e atividade antioxidante. 2008, 120f. Dissertação, Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, CORREIA, A. A. S.; GONZAGA, M. L. C.; AQUINO, A. C.; SOUZA, P. H. M.; FIGUEIREDO, R. W.; MAIA, G. A. Caracterização química e físicoquímica da polpa do noni (Morinda citrifolia) cultivado no estado do Ceará. Alimentos e Nutrição, v. 22, n. 4, p , out./dez GONÇALVES, G. A. S. ; VILAS BOAS, E. V. B. ; RESENDE, J. V. ; MACHADO, A. L. L. ; VILAS BOAS, B. M.. Qualidade do pequi submetido ao cozimento após congelamento por diferentes métodos e tempos de armazenamento. Revista Ceres, v. 57, n.5, p , Higby, W. K. A. A simplified method for determination of some the carotenoid distribuition in natural and carotene fortified orange juice. Journal of Food Science, v. 27, p , MORAES, M. N. ; ZABOT, G. L. ; PRADO, J. M. ; MEIRELES, M. A. A. Obtaining antioxidants from botanic matrices applying novel extraction techniques. Food and Public Health, v. 3, p , OLIVEIRA, A.L. ; POZZA, L.N.L. ; SANTOS, D.N. ; KAMIMURA, E.S. ; VICENTE, E. ; CABRAL, F.A..Supercritical extraction of coumarin from guaco (Mikania laevigata and Mikania glomerata) for pharmaceutical applications. The Journal of Supercritical Fluids, v. 83, p , RE, R., PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, PANNALA A, YANG M, RICE-EVANS C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, v. 26, n. 9/10, p , REGLERO G, SE-ORANS FJ, IBÁ-EZ E.. Supercritical fluid extraction: an alternative to isolating natural food preservatives, in BARBOSA-CÁNOVAS GV, TAPIA MS, CANO MP. (Ed.). Novel food procesing technologies, CRC Press, New York, p , RIBEIRO, M. C. ; VILAS BOAS, E. V. B. ; RIUL, T. R. ; PANTOJA, L. ; MARINHO, H. A. ; SANTOS, A. S. Influence of the extraction method and storage time on the physicochemical properties and carotenoid levels of pequi (Caryocar brasiliense Camb.) oil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 32, n.2, p , RODRIGUES, M. L. ; SOUZA, A.R.M ; LIMA, J.C.R. ; MOURA, C. J. ; GERALDINE, R. M.. Cinética da degradação de carotenoides e da alteração de cor do azeite de pequi submetido ao aquecimento em temperatura de fritura. Ciência Rural, v. 43, p , VILAS BOAS, B. M. ; GONÇALVES, G. A. S. ; ALVES, J. A. ; VALÉRIO, J. M. ; ALVES, T.C. ; RODRIGUES, J. L. ; PICCOLI, R. H. ; VILAS BOAS, E. V. B.. Qualidade de pequis fatiados e inteiros submetidos ao congelamento. Ciência Rural, v. 42, p , AGRADECIMENTOS: Á Capes e ao Banco Santander pelas bolsas concedidas e a Agropalma pelo fornecimento do óleo de palma. Autor a ser contatado: alelopes@usp.br