PRODUÇÃO DE VAGENS EM PLANTAS DE FEIJOEIRO EM SUBSTRATO ESTERILIZADO E NÃO ESTERILIZADO POR Trichoderma ssp. 1

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1 PRODUÇÃO DE VAGENS EM PLANTAS DE FEIJOEIRO EM SUBSTRATO ESTERILIZADO E NÃO ESTERILIZADO POR Trichoderma ssp. 1 AGUIAR, A. R. de 2 ; KONIG, F. 2 ; GONÇALVES, C. E. P. 2 ; MACHADO, D. F. M. 3 ; SILVA, A. C. F. da 4 1 Trabalho de Pesquisa _Universidade Federal de Santa Maria - UFSM 2 Curso de Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 3 Curso de Pós Graduação em Agrobiologia, Universidade Federal Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 4 Professor (a) da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria RS, Brasil andiagossi@yahoo.com.br RESUMO O objetivo deste trabalho foi selecionar isolados de Trichoderma spp. visando avaliar a influência destes isolados na produção de vagens em plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) cv. carioca. Com os isolados obtidos foi preparado o pó biológico à base de Trichoderma spp., o qual foi utilizado no experimento de produção de vagens. O experimento foi conduzido na ausência e presença do pó biológico da mistura de três isolados de T. viride (IT2, IT3 e IT4) em substrato esterilizado e não esterilizado, totalizando quatro tratamentos. A avaliação constou da contagem do número de vagens por planta. Observou-se que a mistura dos três isolados de T. viride promoveu as maiores porcentagens de produção de vagens por plantas de feijoeiro, em substrato esterilizado. Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, Trichoderma spp., Produção de vagens. 1. INTRODUÇÃO A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) constitui-se na leguminosa mais importante para a alimentação de mais de 500 milhões de pessoas na América Latina e África. O Brasil é o maior produtor, com uma produção anual de dois milhões de toneladas, o que equivale a cerca de 20% da produção mundial de feijão. O feijão é um alimento básico para a população brasileira, constituindo-se em sua principal fonte de proteína vegetal. O consumo anual per capta é de 14 quilogramas. O teor de proteína das sementes varia de 20 a 33%, sendo também um alimento energético. No Brasil, o feijão é produzido basicamente por pequenos produtores. Aproximadamente 80% da produção e da área cultivada encontra-se em propriedades menores que 100 ha. (ARAGÃO et al.,1998). 1

2 Estes pequenos produtores geralmente utilizam baixo nível tecnológico, obtendo produtividade média de 836kg ha -1 na safra 2006/2007 (MAPA, 2007). Essa baixa produtividade ocorre em razão dos seguintes fatores: incidência de doenças e pragas, não utilização de sementes certificadas, falta ou excesso de água e baixa disponibilidade de nutrientes, sobretudo, fósforo (P), devido a sua adsorção nos solos, e nitrogênio (N) que sofre perdas decorrentes de lixiviação e volatilização, devido ao manejo inadequado (FERREIRA et al., 2009). Para atender a demanda do feijão, buscando uma tecnologia compatível com a crescente preocupação ecológica, e que garanta a qualidade nas mais diversas situações de cultivo, o uso de Trichoderma spp. é uma alternativa eficiente e não agressiva ao ambiente e ao homem, além de poder contribuir para o restabelecimento do equilíbrio microbiano do ambiente e a diversidade biológica, caracterizando-se como uma opção aos pequenos produtores. Trichoderma spp. são os fungos mais estudos no Brasil e em outros países da América Latina como agentes de controle biológico e promotores de crescimento vegetal. Isso se deve ao fato de não serem patogênicos, estarem presentes em praticamente todos os tipos de solos com matéria orgânica, sendo facilmente isolados, cultivados e multiplicados, colonizando com eficiência o sistema radicular de diversas plantas (LUCON 2008; MORANDI; BETTIOL, 2009). Linhagens desse fungo antagonista vêm recebendo grande atenção na pesquisa devido à sua versatilidade de ação, através da associação ou não de parasitismo, antibiose e competição; além da sua ação como indutoras de resistência de plantas contra doenças e como promotoras de crescimento vegetal (MELO, 1998; HARMAN, 2000), representando uma alternativa promissora para minimizar o impacto de produtos químicos e a redução de suas doses de aplicação. A promoção de crescimento de plantas pela aplicação de Trichoderma spp. foi inicialmente relacionada ao controle de microrganismos prejudiciais presentes no solo. Posteriormente tem sido relacionada à produção de hormônios ou fatores de crescimento, maior eficiência no uso de alguns nutrientes e aumento da disponibilidade e absorção de nutrientes pela planta. Algumas linhagens aumentam a superfície total do sistema radicular, possibilitando um maior acesso aos elementos minerais. Outras são capazes de solubilizar e disponibilizar para a planta o fósforo, ferro, cobre, manganês e zinco do solo. Também podem melhorar os mecanismos ativos de absorção e aumentar a eficiência da planta para utilizar alguns nutrientes importantes, como o nitrogênio (LUCON, 2009). 2

3 Desde o trabalho pioneiro de Weidling e Fawcett em 1936, sobre o uso de cepas de Trichoderma spp. no controle de doenças causadas em citros por Rhizoctonia solani, estudos têm sido realizados, na tentativa de isolar fungos eficazes na repressão de doenças de plantas causadas por outros fungos. Pesquisas têm sido direcionadas para a promoção do crescimento vegetal e apresentam aumento tanto no crescimento quanto na produtividade de diversas culturas como cravo, crisântemo, pepino, berinjela, ervilha, pimentão, rabanete, tabaco, tomate, alface, cenoura, milho, papoula, algodão, feijão, arroz, grão de bico, eucalipto, entre outras (ALMANÇA, 2005; FILHO et al., 2008; FORTES et al., 2007; HOYOS-CARVAJAL et al., 2009; JYOTSNA et al. 2008; RESENDE et al. 2004). Sob esta perpsectiva, foi realizado este trabalho com o objetivo de selecionar isolados de Trichoderma spp. visando avaliar a influência destes isolados na produção de vagens em plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) cv. carioca. 2. METODOLOGIA Os experimentos foram realizados no Laboratório de Interação Planta- Microrganismos e em casa de vegetação do Departamento de Biologia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), em Santa Maria, Rio Grande do Sul. 2.1 Seleção de isolados de Trichoderma spp. Os isolados de Trichoderma spp. foram obtidos a partir de amostras de 500g de solo, retiradas de uma profundidade de até 10 cm, em área de cultivo de hortaliças, no campus da Universidade Federal de Santa Maria, em Santa Maria, RS, sendo utilizado o método de iscas (GHINI; KIMATI, 1989) modificado por Ethur et al. (2005). A identificação dos isolados selecionados foi feita através de microscópio estereoscópico e óptico, com base na bibliografia especializada (BARNETT; HUNTER, 1998). Oito isolados de Trichoderma spp. que apresentaram maior crescimento radial em cm, em meio BDA (batata, dextrose, ágar), foram utilizados para o teste de cultura pareada in vitro (confrontação direta) para verificar o comportamento antagônico contra um isolado patogênico de Sclerotinia sclerotiorum, pertencente à coleção do Laboratório de Interação Planta-Microrganismos da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS. Na confrontação direta, discos de meio BDA contendo micélio do patógeno e do isolado de Trichoderma spp. foram colocados em lados opostos em placa de Petri. Após sete dias em câmara climatizada a 22ºC foi realizada a avaliação de acordo com a seguinte 3

4 escala de notas, modificada de Bell et al. (1982): 1 Trichoderma spp. cresce e toma de toda placa; 2 Trichoderma spp. cresce e toma de 2/3 da placa; 3 Trichoderma spp. e o patógeno crescem até a metade da placa, nenhum organismo domina o outro; 4 Patógeno cresce e toma de 2/3 da placa e 5 - Patógeno cresce e toma de toda placa. Utilizando-se este critério foram feitas avaliações 7 e 14 dias após os antagonistas terem sido transferidos para a placa de confrontação. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições para cada um dos oito tratamentos com os isolados IT1, IT2, IT3, IT4, IT5, IT6, IT7 e IT Experimento in vivo com Trichoderma spp. A aplicação de Trichoderma spp. foi feita no substrato através do pó biológico preparado com os isolados selecionados. O preparo do pó biológico foi baseado em Ethur (2002). Discos de meios de cultura BDA (batata-dextrose-ágar) contendo micélio e esporos de cada isolado selecionado foram inoculados sobre 50 g de arroz umedecido com 75 ml de água destilada, previamente esterilizados em autoclave a 120 C por 40 min. em sacos de polipropileno de 500 ml. Os sacos contendo o arroz com os discos de BDA foram mantidos em temperatura ambiente por 15 dias, para a colonização do arroz. Após, realizouse a secagem deste material, utilizando-se envelopes de papel em estufa a 40ºC (± 5 ), sendo, então, o arroz triturado em liquidificador e peneirado em peneira de 40 meshes separando-se o pó fino. Depois da produção dos pós dos três isolados selecionados in vitro, IT2, IT3 e IT4, de Trichoderma viride, separadamente, foi determinado o número de UFC s (unidades formadoras de colônia) por grama de pó e então se procedeu a mistura dos mesmos, sendo utilizado a mesma concentração de esporos (10 8 UFC.g -1 ) de cada isolado, formando um mix de pó biológico, o qual foi utilizado no experimento. Para a montagem do experimento utilizou-se substrato Plantmax esterilizado e não esterilizado. A esterilização foi realizada em autoclave (1 hora a 120 C/1 atm por três vezes, com intervalo de 24 horas). A concentração de pó biológico utilizada foi de 1,0 g de pó biológico para 1 Kg de substrato. Foram cultivadas três plantas por repetição em vaso contendo 500g de substrato, em estufa com irrigação controlada e temperatura ambiente (26ºC+2 C). Os tratamentos foram os seguintes: (T1) substrato esterilizado + pó biológico; (T2) substrato não esterilizado + pó biológico; (T3) somente substrato esterilizado; (T4) somente substrato não esterilizado. 4

5 O delineamento experimental foi inteiramente casualizado e cada tratamento com sete repetições. A avaliação foi efetuada por planta no estádio reprodutivo R8 (enchimento das vagens) e constou da contagem do número de vagens por planta. Foi realizada análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para análise dos resultados, os dados em porcentagem foram transformados em arcoseno da raiz quadrada (x/100). 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Seleção de isolados de Trichoderma spp. Os oito isolados selecionados de Trichoderma spp. apresentaram variação nos resultados a partir do teste de confrontação direta in vitro contra S. sclerotiorum em dois diferentes períodos de incubação, 7 e 14 dias. Aos sete dias de incubação nenhum dos isolados mostrou diferenças significativas entre as médias de notas de confrontação, no entanto, aos 14 dias os tratamentos com os isolados IT2, IT3 e IT4 apresentaram os melhores resultados, tomando parte do patógeno com crescimento em mais de 2/3 das placas, sendo estes três isolados selecionados para o experimento in vivo. No confronto direto do agente de biocontrole com o fitopatógeno podem ocorrer ações antagônicas, como antibiose, hiperparasitismo e competição (ETHUR et al., 2005), sendo essas características favoráveis que visam à seleção de isolados de Trichoderma spp. com capacidade de antagonismo in vivo a fitopatógenos e promoção de crescimento de plantas. Os métodos in vitro, além de serem práticos, servem como uma seleção preliminar para avaliar a capacidade antagonista e também indicam o comportamento do microrganismo, com relação a sua capacidade de adaptação, crescimento e reprodução in vitro. 3.2 Experimento in vivo com Trichoderma spp. Observaram-se nos dados obtidos (Tabela 1) que os isolados IT2, IT3 e IT4 de Trichoderma viride, utilizados neste experimento, resultaram num aumento na produção de vagens de feijão cv. carioca em substrato esterilizado, uma vez que o T1 (substrato esterilizado + pó biológico) diferiu estatisticamente dos demais tratamentos avaliados. 5

6 Tabela 1: Médias de produção de vagens por planta de feijoeiro cv.carioca no estádio reprodutivo R8. Tratamentos Média do número de vagens por planta Substrato esterilizado + Pó-biológico 1,678 a Substrato não esterilizado + Pó-biológico 1,140 ab Substrato esterilizado 0,820 b Substrato não esterilizado 1,030 ab Médias seguidas por mesma letra na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de erro. Os tratamentos com aplicação de T. viride, T1 (substrato esterilizado + pó biológico) e T2 (substrato não esterilizado + pó biológico), foram os tratamentos que apresentaram as maiores médias de produção de vagens (1,678 e 1,140, respectivamente), comparados aos tratamentos controle, substratos sem os isolados, esterilizado e não esterilizado (0,820 e 1,030, respectivamente), demonstrando o potencial dos isolados IT2, IT3 e IT4 de T. viride na promoção do crescimento vegetal, avaliado por meio do número de vagens por planta de feijoeiro cv. carioca, independente se o substrato é esterilizado ou não esterilizado. A presença de outros microrganismos naturais benéficos no substrato não esterilizado, podem ter cooperado para o resultado obtido, uma vez que o T4 (substrato não esterilizado) não diferiu estatisticamente do T1 (substrato esterilizado + pó biológico). Conforme Lucon (2009), a rizosfera, região onde o solo e as raízes das plantas entram em contato, apresenta um número elevado de microrganismos que influenciam o crescimento e a produção das plantas, sendo classificados como prejudiciais, benéficos ou neutros. Embora tenha-se usado, neste experimento, substrato comercial, a observação da autora pode ter ocorrido. A promoção de crescimento e aumento da produtividade de plantas ocasionada por microrganismos do solo ocorrem devido à ação de vários fatores ainda pouco esclarecidos, podendo envolver produção de hormônios vegetais, produção de vitaminas ou conversão de materiais a uma forma útil para a planta, absorção e translocação de minerais e controle de patógenos (MELO, 1998). Diversos trabalhos mostram o efeito benéfico de espécies de Trichoderma no desenvolvimento vegetal. Filho et al. (2008) concluíram que o isolado CEN 262 de Trichoderma spp. proporcionou maior índice de desenvolvimento de partes aéreas de mudas de eucalipto. Estudos realizados com Arabidopsis thaliana investigaram o papel da auxina produzida e isolada de Trichoderma spp. na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta em resposta à inoculação de T. virens e T. atroviride 6

7 desenvolvendo um sistema de interação fungo-planta, o qual resultou em características fenotípicas relacionadas com a auxina, como o aumento da produção de biomassa e estimulação do desenvolvimento das raízes laterais (CONTRERAS-CORNEJO, 2009). Algumas linhagens aumentam a superfície total do sistema radicular, possibilitando um maior acesso aos elementos minerais (HARMAN et al., 2004). Outras são capazes de solubilizar e disponibilizar para a planta o fósforo, ferro, cobre, manganês e zinco do solo. Também podem melhorar os mecanismos ativos de absorção, bem como aumentar a eficiência da planta para utilizar alguns nutrientes importantes, como o nitrogênio (ALTOMARE et al., 1999). Existem vários trabalhos envolvendo a interação de diferentes isolados de Trichoderma spp. e culturas agrícolas, a exemplo do milho, feijão, arroz, tomate, pepino, entre outras (ETHUR, 2002; HARMAN et al., 2004; HOYOS-CARVAJAL, 2009; REZENDE et al., 2004). Sob esta perspectiva, os resultados obtidos com os isolados IT2, IT3 e IT4 de T. Viride, neste experimento, mostram o potencial destes na promoção do crescimento vegetal e estimualm a realização de mais pesquisas envolvendo estes agentes biológicos. 4. CONCLUSÃO A mistura dos isolados IT2, IT3 e IT4 de Trichoderma viride, na forma de pó biológico, estimula a produção de vagens de plantas de feijoeiro cv. carioca em substrato esterilizado. REFERÊNCIAS ALMANÇA, M.A.K. Trichoderma sp. no controle de doenças e na promoção do crescimento de plantas de arroz f. Dissertação. (Programa de Pós-Graduação em Fitotecnia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, ALTOMARE, C. et al. Solubilization of phosphates and micronutrients by the plant-growth-promoting and biocontrol fungus Trichoderma harzianum Rifai Applied and Environmental Microbiology. v.65, n.7, p , july ARAGÃO, F. J. L. et al. Feijão transgênico. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Ano 1, n.5, p ,

8 BARNETT, H.L. & HUNTER, B.B. Illustrated genera of imperfect fungi. Minneapolis. Burgess Publishing Company, CONTRERAS-CORNEJO, H.A. et al. Trichoderma virens, a plant beneficial fungus, enhances biomass production and promotes lateral root growth through an auxin-dependent mechanism in Arabidopsis. Plant Physiology. v.149, n.3, p , ETHUR, L. Z. Avaliação de fungos como antagonistas para o biocontrole de Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary em pepineiro cultivado em estufa f. Dissertação (Mestrado no Programa de Pós-Graduação em Agronomia). Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, ETHUR, L.Z. et al. Fungos antagonistas a Sclerotinia sclerotiorum em pepineiro cultivado em estufa. Fitopatologia Brasileira, v.30, n.2, p , FERREIRA, P. A. A. et al. Inoculação com cepas de rizóbio na cultura do feijoeiro. Revista Ciência Rural. v. 39, n. 7, p , FILHO, M.R.C. et al. Avaliação de isolados de Trichoderma na promoção de crescimento, produção de ácido indolacético in vitro e colonização endofítica de mudas de eucalipto. Boletim de pesquisa e desenvolvimento 226. Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, FORTES, F. de O. et al. Promoção de enraizamento de microestacas de um clone de Eucapyptus sp. por Trichoderma spp. Revista Árvore. v.31, n 2, p , GHINI, R.; KIMATI, H. Método de iscas para obtenção de isolados de Trichoderma antagônicos a Botrytis cinerea. Jaguariúna: EMBRAPA-CNPDA, p. (Boletim de Pesquisa, 3). HARMAN, G. E. Myth and dogmas of biocontrol changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease, v.84, p , HARMAN, G.E. et al. Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews Microbiology. v. 2, p , HOYOS-CARVAJAL, L. et al. Growth stimulation in bean (Phaseolus vulgaris L.) by Trichoderma. Biological control. v.51. p , JYOTSNA, A.S. et al. Growth promotion and charcoal rot management in chickpea by Trichoderma harzianum. Journal of Plant Protection Research. v.48, n

9 LUCON, C.M.M. Promoção de crescimento de plantas com o uso de Trichoderma spp Artigo em Hypertexto. Disponível em: Acesso em: 30/7/2011. LUCON, C.M.M. Trichoderma no controle de doenças de plantas causadas por patógenos de solo. n.77, Ago Disponível em: Acesso: 30/07/2011. MELO, I. S. de. Agentes microbianos de controle de fungos fitopatogênicos. In: MELO, I. S. de. AZEVEDO, J. L. de. (editores). Controle biológico. v. 1. Jaguariúna: EMBRAPA, p MINISTERIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, Disponível em: Acesso em: data do acesso: 19/10/2007. MORANDI, M.A.B.; BETTIOL, W. Controle biológico de doenças de plantas no Brasil. In: BETTIOL, W; MORANDI, M.A.B. Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas (editores). Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente. p.07-14, RESENDE, M. de L. et al. Inoculações de sementes de milho utilizando o Trichoderma harzianum como promotor de crescimento. Ciência e Agrotecnologia. v.28, n.4, p ,