ATIVIDADE ANTAGÔNICA in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. CONTRA ISOLADOS DE Sclerotinia sclerotiorum 1

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1 ATIVIDADE ANTAGÔNICA in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. CONTRA ISOLADOS DE Sclerotinia sclerotiorum 1 SANTOS, Ricardo Feliciano dos 2 ; HECKLER, Leise Inês 3 ; SILVA, Gerarda Beatriz Pinto 3 ; SCHEEREN, Laura Engroff 2 ; FÍNGER, Geísa 4 ; MULLER, Jucéli 2 ;DURIGON, Miria Rosa 2 ; BLUME, Elena 5. ¹ Trabalho de Pesquisa UFSM ² Mestrando em Agronomia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil ³ Curso de Agronomia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 4 Engenheira Agrônoma, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 5 Professora Associada de Fitopatologia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil ricardoijui@hotmail.com; leiseheckler@hotmail.com; gerardabeatriz@hotmail.com; lauraescheeren@hotmail.com; gefinger@hotmail.com; juceli.muller@yahoo.com.br; midurigon@hotmail.com; elenablu@gmail.com. RESUMO Com esse trabalho objetivou-se avaliar o potencial antagônico in vitro de isolados de Trichoderma spp. contra isolados de Sclerotinia sclerotiorum utilizando duas escalas para avaliação em laboratório, no município de Santa Maria/RS. Foram testados quatro isolado de Trichoderma spp. obtidos da micoteca do Laboratório de Fitopatologia, sendo eles: T1.15 (Trichoderma. sp.) T15.1 (T. koningiopsi), T17 (T. aureoviride) e ETSR20 (T. harzianum). Para a verificação da capacidade antagônica foram utilizados cinco isolados de Sclerotinia sclerotiorum, oriundos de diferentes culturas: feijão, cenoura, alface e soja. Para o confronto direto com isolado S. sclerotiorum obtido a partir de alface e feijão houve interação significativa, sendo que o isolado T17 se mostrou mais eficaz nesse teste. As duas escalas podem ser utilizadas para os teste de confronto direto para os diferentes isolados de S. sclerotiorum. Palavras-chave: Controle biológico; Mofo-branco; Patógeno; Manejo agroecológico. 1. INTRODUÇÃO Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary é um fungo de ampla ocorrência em todo o mundo, tendo como hospedeiras plantas de 278 gêneros e 408 espécies (BOLTON et al., 2006). Patógeno habitante de solo que causa a doença conhecida como mofo branco e cujos sintomas se caracterizam pela podridão úmida coberta por micélio branco algodonoso na superfície do solo e/ou do tecido do hospedeiro produzindo eventualmente estruturas de 1

2 resistência denominadas de escleródios (CARDOSO, 1990) que asseguram a presença do patógeno por períodos de pelo menos seis a oito anos (COOK et al., 1975; ADAMS; AYES, 1979; BIANCHINI et al, 2005) até mais de 11 anos (BOLTON et al., 2006) dificultando o controle por meio de rotação de culturas. Na maioria das culturas não há disponibilidade de cultivares resistentes e o controle químico nem sempre apresenta alta eficiência. O patógeno causa perdas significativas na produtividade em várias culturas. Em alface na Colômbia as perdas chegaram entre 20 a 70% (GIL, 2009) enquanto na Califórnia (USA) estimaram-se perdas de em torno de 60% (HAO; SUBBARAO, 2005). Cerca de 80% de plantas de salsinha, 80% de coentro e 70% de cenoura Peru inoculadas com S. sclerotiorum morreram até 10 dias após inoculação (REIS, NASCIMENTO, 2011). Homechin (1982) determinou que as perdas da produção de soja em lavouras comerciais nos municípios de Castro, Ponta Grossa, Palmeira e Guarapuava, no estado do Paraná, variaram de 70 a 92% para o rendimento, 5,6 a 39,2% para o peso de 100 sementes e 20 a 90% para porcentagem de plantas infectadas. A incidência do mofo branco é favorecida pela alta densidade de plantio, períodos prolongados de precipitação, elevada umidade do ar e temperaturas amenas (PURDY, 1979). Uma estratégia para o controle desse patógeno é o uso do controle biológico, sendo espécies do gênero Trichoderma amplamente utilizadas na agricultura, uma vez que são capazes de atuarem como agentes de controle de doenças de várias plantas cultivadas, promotores de crescimento e indutores de resistência de plantas a doenças (MOHAMED; HAGGAG, 2006; FORTES et al., 2007). Sua ação como biocontrolador foi demonstrada pela primeira vez em 1932, por Weindling, que surgeriu seu uso no controle de doenças (SPIEGEL; CHET, 1998). Fatores como temperatura, umidade, nutrientes, tipo de solo, microbiota, aeração, ph e teor de matéria orgânica influenciam na sobrevivência de Trichoderma no solo ou substrato (HOWELL, 2003). Algumas linhagens desses fungos vêm recebendo grande atenção da pesquisa, também, por sua versatilidade de ação. Essas são capazes de produzir enzimas que degradam paredes celulares de outros fungos e produzem também substâncias antifúngicas (antibióticos), apresentam diversidade de estratégias de sobrevivência que as tornam altamente competitivas no ambiente e extraordinária capacidade de proliferação na rizosfera (RESENDE et al., 2004). Trichoderma pode atuar, via de regra, por meio de um ou da associação dos seguintes mecanismos: parasitismo, antibiose, competição (MELO, 1998) e indução de resistência (LUCON, 2009). Diante do exposto o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antagônico in vitro de isolados de Trichoderma spp. contra isolados de Sclerotinia sclerotiorum utilizando duas escalas para avaliação. 2

3 2. MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fitopatologia do Departamento de Ciências Rurais da Universidade Federal de Santa Maria/RS. Foram testados quatro isolado de Trichoderma spp. obtidos da micoteca do mesmo laboratório, sendo eles: T1.15 (T. harzianum) T15.1 (T. koningiopsi), T17 (T. aureoviride) e ETSR20 (T. harzianum). E para a verificação da capacidade antagônica foram utilizados cinco isolados de Sclerotinia sclerotiorum, oriundos de diferentes culturas: feijão (obtido da ESALQ), dois isolados de cenoura (obtidos de Santa Maria-RS), alface (distrito de Arroio Grande/Santa Maria-RS) e soja (Ijuí-RS). Para o teste de antagonismo, um disco de 10 mm de diâmetro contendo micélio do patógeno, com seis dias de idade foi colocado a uma distância de 0,5 cm da extremidade da placa de Petri, contendo meio BDA. Foram incubadas por 48 h a 20 ± 2 ºC, com fotoperíodo de 12 h. Decorrido esse período, foi acrescentado mais um disco de 10 mm de diâmetro, desta vez contendo micélio de Trichoderma spp. na extremidade oposta da placa (ETHUR, 2006). As placas foram incubadas em câmara de crescimento a 20 ± 2 ºC, com fotoperíodo de 12h, por sete dias. Para a validação do teste, foram adotadas duas escalas de notas: uma seguindo a escala de Bell et al. (1982) que baseia-se na observação visual, atribuindo notas de 1 a 5 (1. antagonista cresce e ocupa toda a placa; 5. patógeno cresce e ocupa toda a placa) e outra seguindo a escala de Rodrigues (2010), onde as placas são sobrepostas em um croqui, que atribui notas variando de 1 a 7, conforme a figura 1. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições, os dados foram submetidos à análise de variância e quando constatado efeito significativo, realizou-se comparação das médias através do teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade. As análises foram realizadas pelo programa computacional Sistema para Análise de Variância SISVAR (FERREIRA, 2003). 3

4 Figura 1: Escala de Rodrigues, RESULTADOS E DISCUSSÃO O teste de antagonismo in vitro no controle de S. sclerotioum obtido a partir de plantas sintomáticas de soja avaliado pela escala de Bell não apresentou diferença estatística significativa. Segundo a escala de Rodrigues apenas o isolado T1.15 diferiu dos demais, sendo o pior isolado para o biocontrole do patógeno (Tabela 1). Menezes (2007) avaliando o potencial antagônico de 100 isolados de Trichoderma spp., obteve três isolados que se destacaram no teste de confrontação direta, sendo que o isolado UFSMT16, obtido de amostras de solo de parcelas com sintomas de murcha em crisântemo, foi um dos melhores. Tabela 1. Médias das notas do teste de confrontação direta obtidas pelos isolados de Trichoderma spp. contra isolados de Sclerotinia sclerotiorum utilizando a escala de Bell et al. (1982) e Rodrigues (Rod) (2010). Santa Maria, RS S. sclerotinia Trichoderma spp. Soja Cenoura 1 Cenoura 2 Alface Feijão Bell ns Rod Bell ns Rod ns Bell Rod ns Bell Rod Bell Rod T1.15 2,50 5,50 b * 2,66 5,83 3,33 a 5,66 3,33 a 5,50 b 3,16 a 5,83 b T17 1,66 7,00 a 2,83 6,16 2,50 b 6,33 3,00 ab 5,83 b 2,00 b 6,66 a T15.1 1,83 7,00 a 2,83 6,33 2,83 ab 6,00 2,50 ab 6,50 2,50 ab 6,50 ab ab ETRS20 2,16 6,83 a 2,83 6,16 2,66 ab 6,33 2,00 b 7,00 a 2,33 ab 6,50 ab CV (%) 35,49 11,93 13,67 7,15 17,65 7,35 24,54 11,29 24,77 7,97 * Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. ns Não significativo pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. 4

5 Selecionando isolados de Trichoderma spp. para o controle de Sclerotium rolfsii Sacc. em soja, Lohmann et al. (2007) observaram que os isolados do antagonista (I, II e III), oriundos de três amostras de solo coletados em diferentes áreas, apresentaram efeito controlador sobre o patógeno, provocando menor incidência de damping off em plântulas de soja. Além disso, a contagem de esporos dos isolados de Trichoderma spp. I e II mostrou maior quantidade de conídios quando comparada ao isolado III. Para o isolado Cenoura 1 não houve diferença estatística significativa para ambas as escalas utilizadas. Porém, para o isolado Cenoura 2 segundo a escala de Bell o melhor resultado de controle in vitro em números absolutos foi o isolado T17 (T. aureoviride) que não diferiu dos isolados T 15.1 (T. koningiopsi) e ETRS 20 (T. harzianum). Para o isolado de feijoeiro de S. sclerotiorum o antagonista T17 apresentou a nota 2 (antagonista cresce e ocupa uma parte do patógeno (2/3 da placa)) sendo a melhor média mas, não diferiu do isolado T15.1 e ETRS 20 segundo a escala de Bell. Segundo Patrício et al. (2001), os isolados fúngicos selecionados por pareamento de culturas, em laboratório, apresentaram comportamento variável quando adicionados ao solo, no controle de Rhizoctonia solani. 4. CONCLUSÕES As duas escalas podem ser utilizadas no teste de confrontação direta de isolados de Trichoderma spp. contra isolados de S. sclerotiorum. A escala de Rodrigues (2010) é mais precisa que a escala de Bell et al. (1982) uma vez que neste ensaio sempre apresentou coeficiente de variação sempre mais baixo. Isolados de Trichoderma spp. apresentam diferentes capacidades antagônicas a S. sclerotiorum. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, P.B.; AYERS, W.A. Ecology of Sclerotinia species. Phytopathology, Saint Paul, v. 69, p , BELL, D. K. et al. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology, v. 72, p BIANCHINI, A.; MARINGONI, A.C.; CARNEIRO, S.M.T.P.G. Doenças do feijoeiro. In: Kimati, H., et al. Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Agronômica Ceres, v. 2, cap. 37, p

6 BOLTON, M. D.; THOMMA, B. P. H. J.; NELSON, B. D. Sclerotinia clerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology, v.7, p.1-16, CARDOSO, J. E. Doenças do feijoeiro causadas por patógenos de solo. Goiânia: EMBRAPA- CNPAF, 1990, 30p. (Comunicado Técnico 30). COOK, G. E., STEADMAN, J.R., BOOSALIS, M.G. Survival of Whetzelinia sclerotiorum and initial infection of dry edible benas in western Nebraska. Phytopathology, v. 65, p , ETHUR, L.Z. Dinâmica populacional e ação de Trichoderma no controle de fusariose em mudas de tomateiro e pepineiro f. Tese (Doutorado em Agronomia) Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, FERREIRA, D. F. Sisvar versão 4.3 (Build 45). Lavras: DEX/UFLA, FORTES, F.O., et al. Promoção de enraizamento de microestacas de um clone de Eucalyptus sp. por Trichoderma spp. Revista Árvore, v. 31, p , GIL, R. et al. Combined efficacy assessment of soil solarization and bio-fungicides for management of Sclerotinia spp. in lettuce (Lactuca sativa L.). Agronomía Colombiana, v. 27, p , HAO, J. J.. SUBBARAO, K. V. Comparative analyses of lettuce drop epidemics caused by Sclerotinia minor and S. sclerotiorum. Plant Disease, v. 89, p HOMECHIN, M. Determinação de perdas da produção de soja, devido a incidência do fungo Sclerotinia sclerotiorum. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, XV, 1982, São Paulo. Resumos... São Paulo: Sociedade Brasileira de Fitopatologia, p HOWELL, C.R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant disease: the history and evolution of current concepts. Plant disease, v. 87, p. 4-19, LOHMANN, T. R. et al. Seleção de isolados de Trichoderma spp. para controle de Sclerotium rolfsii em soja. Revista Brasileira de Agroecologia Resumos do V Congresso Brasileiro de Agroecologia, v. 2, p LUCON, C. M. M. et.al. Bioprospecção de isolados de Trichoderma spp. para o controle de Rhizoctonia solani na produção de mudas de pepino. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 44, p ,

7 MELO, I. S. Agentes microbianos de controle de fungos fitopatogênicos. In: MELO, I. S. de; AZEVEDO, J. L. de. Controle Biológico. Jaguariúna: EMBRAPA, p MENEZES, J. P. Caracterização populacional e molecular, e seleção de Trichoderma spp. para biocontrole de Fusarium sp. em crisântemo f. Tese de Doutorado (Programa de Pós- Graduação em Agronomia). Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, MOHAMED, H. A. L. A.; HAGGAG, W. M. Biocontrol potential of salinity tolerant mutants of Trichoderma harzianum against Fusarium oxysporum. Brazilian Journal Microbiology, v. 37, p , 2006 PATRICIO, F. R. A. et al. Seleção de isolados de Trichoderma spp. antagônicos a aphanidermatum e Rhizoctonia solani. Summa Phytopathologica, v.27, p , Pythium PURDY, L. H. Sclerotinia sclerotiorum: history, diseases and symptomatology, host range, geographie distribution, and impact. Phytopathology, v. 69, p , REIS, A; NASCIMENTO, W. M. New apiaceous hosts of Sclerotinia sclerotiorum in the Cerrado region of Brazil. Horticultura Brasileira, v. 29, p , RESENDE, M. L. et al. Inoculação de sementes de milho utilizando o Trichoderma harzianum como promotor de crescimento. Ciência Agrotécnica, v. 28, p , RODRIGUES, J. Trichoderma spp. associado a níveis de adubação NPK no patossistema Sclerotinia sclerotiorum f. Dissertação de Mestrado (Programa de Pós-Graduação em Agronomia). Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, SPIEGEL, Y.; CHET, I. Evaluation of Trichoderma spp. as a biocontrole agent against soilborne fungi and plant-parasitic nematodes in Israel. Integrated Pest Management Review, v. 3, p ,