SELEÇÃO IN VITRO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM POTENCIAL DE ANTAGONISMO A ISOLADOS PATOGÊNICOS DE Fusarium spp. 1

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1 SELEÇÃO IN VITRO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM POTENCIAL DE ANTAGONISMO A ISOLADOS PATOGÊNICOS DE Fusarium spp. 1 LAZAROTTO, Marília 2 ; BOVOLINI, Marciéli Pitorini 3 ; MACIEL, Caciara Gonzatto 4 ; MUNIZ, Marlove Fátima Brião 5 1 Trabalho de Pesquisa _UFSM 2 Curso Doutorado em Engenharia Florestal da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 3 Curso de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 4 Mestre em Engenharia Florestal pela Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 5 Prof. Adjunto do Departamento de Defesa Fitossanitária da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil lilalazarotto@yahoo.com.br RESUMO O biocontrole é uma das alternativas para controle de organismos patogênicos habitantes do solo que podem causar doenças associadas às raízes de plantas hospedeiras. O objetivo deste trabalho foi selecionar, in vitro, potenciais agentes antagonistas do gênero Trichoderma isolados das próprias raízes de Nogueira-pecan (Carya illinoensis) infectadas por Fusarium spp. Para tanto, seis isolados patogênicos de Fusarium spp., obtidos de raízes e flores de plantas Nogueira-pecan, foram utilizados em teste de confronto direto com três isolados de Trichoderma spp. obtidos de raízes de Nogueira-pecan e mais um produto biológico à base de Trichoderma spp. (Agrotrich Plus ). Ao final do teste, realizaram-se avaliações de crescimento micelial de Fusarium spp. e de Trichoderma spp. e avaliação de notas do confronto. Os isolados T 1 e T 2 de Trichoderma spp. apresentaram maior potencial para controle biológico de Fusarium spp. Palavras-chave: Controle biológico; Podridão-radicular, Confronto direto. 1. INTRODUÇÃO O gênero Fusarium pode ocorrer especialmente em locais de climas tropicais e subtropicais, esse fungo é capaz de sobreviver por longos períodos no solo pela formação de estruturas chamadas clamidósporos (MILANESI, 2009). Este se distribui por praticamente o mundo inteiro, causando danos de grande importância em várias culturas, tanto agrícolas quanto florestais ou frutíferas. Por ser um patógeno de solo, sua eliminação, após a instalação na área se torna uma tarefa muito difícil, e medidas de controle químico praticamente inexistem, exceto aquelas preventivas, como o uso de tratamento de sementes ou outros materiais de propagação.

2 Uma alternativa para o controle de patógenos do solo é o controle biológico que pode ser obtido pela manipulação do ambiente e pela introdução de antagonistas, tanto no solo quanto nos órgãos de propagação das plantas (MICHEREFF, 2001). Os microrganismos selecionados no mesmo ambiente onde serão utilizados têm maiores chances de se adaptarem e de serem eficientes, e, neste caso, são conhecidos como microrganismos residentes (GRIGOLETTI JÚNIOR et al., 2001). Para confirmar se determinado microrganismo tem ação antagônica sobre outro, os testes in vitro e in vivo são indispensáveis. Os testes in vitro possuem as vantagens de possibilitarem a análise de um grande número de potenciais antagonistas, permitir o estudo do mecanismo de ação e facilitar a observação das interações antagonista patógeno (MARIANO, 1993). Após a seleção in vitro de potenciais antagonistas para controle biológico de enfermidades em vegetais, pode ser iniciado o estudo do efeito destes em condições in vivo, ou seja, à campo, onde as plantas estão se desenvolvendo. Conforme Maciel (2012), testes de antagonismo in vivo são fundamentais para concretizar os testes em ambiente controlado, sendo o objetivo de aproximar ao máximo possível das condições reais do processo de produção de mudas, como temperatura, umidade, precipitação e insolação, porém nem sempre os resultados de biocontrole in vivo apresentam respostas positivas, já que variações na temperatura, umidade, luz e microflora do solo podem interagir com os microrganismos envolvidos. Estudos anteriores a este identificaram isolados de Fusarium spp. associados à podridão-radicular de Nogueira-pecan [Carya illinoensis (Wangenh.) K. Koch]. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi selecionar, in vitro, potenciais agentes antagonistas do gênero Trichoderma isolados das próprias raízes de C. illinoensis infectadas por Fusarium spp. para que estudos futuros in vivo, possam ser iniciados. 2. METODOLOGIA Inicialmente obtiveram-se as culturas puras de isolados de Trichoderma spp. (antagonista potencial) e de isolados de Fusarium spp. (patógeno). Para tanto, estruturas de ambos os gêneros fúngicos, detectadas em raízes de Nogueira-pecan, foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) conforme recomendado por Alfenas et al. (2007). Após dez dias de crescimento, os isolados crescidos em BDA foram purificados conforme a técnica de cultura monospórica descrita por Fernandes (1993) e incubados por dez dias sob fotoperíodo de 12 horas a 25±3 C para posterior instalação do teste de confrontação direta. Foram testados três isolados de Trichoderma spp. provenientes de isolamento em raízes de plantas de Nogueira-pecan infectadas pelo patógeno do gênero Fusarium mais um

3 produto comercial Agrotrich Plus (à base de Trichoderma spp.) e seis isolados de Fusarium spp. os quais foram patogênicos a Nogueira-pecan em testes anteriores, cujos sintoma principal foi a podridão-de-raízes. Na tabela 1, são apresentadas informações a respeito da origem dos isolados de Fusarium spp. e de Trichoderma spp. utilizados. Tabela 1: Origem dos isolados de Fusarium spp. e Trichoderma spp. utilizados no teste de confrontação direta. Código Gênero Órgão F 3 Fusarium Inflorescência F 5 Fusarium Raízes F 6 Fusarium Inflorescência F 7 Fusarium Inflorescência F 9 Fusarium Raízes F 11 Fusarium Raízes T 1 Trichoderma Raízes T 2 Trichoderma Raízes T 3 Trichoderma Raízes *Agrotrich Plus Trichoderma Produto comercial * Produto biológico à base do fungo Trichoderma spp. na quantidade de 108 UFCs g -1 de produto e farinha de arroz qsp 1,0 kg, na forma de pó seco solúvel altamente concentrado para o tratamento de sementes ou pulverização. A ação antagônica de Trichoderma spp. contra isolados de Fusarium spp. foi testada através do teste de confrontação direta conforme Milanesi (2009) o qual trata-se de um teste realizado in vitro. Um disco de meio de cultura BDA de 12 mm de diâmetro contendo micélio de Fusarium foi transferido para placas de Petri (90 mm de diâmetro), também contendo meio BDA. As placas foram incubadas durante 48 horas a 25 C (± 3 C) com fotoperíodo de 12 horas. Decorrido esse período, um disco de meio de cultura BDA com 12 mm de diâmetro, contendo micélio de Trichoderma spp., foi transferido para a posição oposta ao disco de micélio de Fusarium spp. nas placas de Petri. Após a transferência de ambos os fungos, as placas foram incubadas durante sete dias a 25 C (± 3 C) com fotoperíodo de 12 horas. Para cada confronto, efetuaram-se três repetições, onde cada repetição foi constituída por uma placa de Petri. Ao término do período de incubação, as placas foram avaliadas de acordo com escala proposta por Bell et al. (1982), atribuindo notas que variaram de 1 a 5, conforme segue: 1. Antagonista cresce e ocupa toda a placa. 2. Antagonista cresce e ocupa uma parte do patógeno (2/3 da placa).

4 3. Antagonista e patógeno crescem até a metade da placa (nenhum domina o outro). 4. Patógeno cresce e ocupa uma parte do antagonista (2/3 da placa). 5. Patógeno cresce e ocupa toda a placa. Além da atribuição das notas, o crescimento micelial de cada fungo foi mensurado em mm com auxílio de paquímetro digital. O delineamento experimental utilizado foi completamente casualizado, com três repetições para cada teste realizado em arranjo bifatorial 6 x 4 (isolados de Fusarium spp. x isolados de Trichoderma spp.). A análise da variância e comparação das médias foi realizada pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade pelo programa Sisvar 5.3 (FERREIRA, 2008). 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES Os resultados do teste de confrontação direta são apresentados na tabela 2. Para o isolado F 3, observa-se que não houve diferença estatística para as variáveis crescimento micelial de Fusarium sp. e Trichoderma spp., entretanto, para a escala de notas, o isolado antagonista T 1 foi o que mais impediu o crescimento do patógeno, já que a nota 3 representa uma certa neutraliedade, sendo que o patógeno e o antagonista crescem quase que igualmente na placa. No confronto dos isolados de Trichoderma spp. com F 5 não houve diferença estatística em nenhuma das variáveis e todas as notas observadas foram na escala 2, o que indica maior pressão do antagonista sobre o patógeno, o que pode ser devido a uma menor agressividade no crescimento do patógeno. Para F 6, houve diferença estatística entre todas as variáveis, sendo o menor crescimento de Fusarium sp. observado no confronto com T 2 e neste mesmo tratamento observou-se o maior crescimento de Trichoderma spp. e a menor nota da escala (1,33) o que indica uma forte ação de antagonismo. Para F 7 o isolado de Trichoderma spp. com maior ação antagônica foi T 1, já que no confronto com este isolado obteve-se o menor valor de crescimento micelial de Fusarium sp., maior crescimento micelial de Trichoderma spp. e menor nota na escala. Para F 9, os mesmos resultados observados para F 7 se repetiram, porém para o isolado T 2, isto é, menor valor de crescimento micelial de Fusarium sp., maior crescimento micelial de Trichoderma spp. e menor nota na escala. Por fim, para F 11, não houve diferença estatítica entre as variáveis, porém a maior nota na escala foi observada no confronto com T 3, indicando menor ação antagônica deste isolado.

5 Tabela 2: Resultados referentes às variáveis Crescimento Micelial de Fusarium spp. (CMF), Crescimento Micelial de Trichoderma spp. (CMT) e notas do teste de confrontação direta. Variáveis Fusarium spp. Trichoderma spp. T 1 T 2 T 3 Agrotrich F 3 47,77 Aa 54,15 Aa 56,46 Aa 56,17 Aa F 5 37,96 ABa 33,70 Ca 40,97 Ba 40,09 Ba CMF (mm) F 6 49,26 Aa 13,02 Db 42,42 Ba 38,73 Ba CV (%): F 7 37,96 ABb 49,00 ABab 50,00 ABa 48,49 ABab 12,49 F 9 43,76 ABa 36,33 BCb 40,92 Ba 43,20 Ba F 11 32,53 Ba 39,28 BCa 42,65 Ba 39,72 Ba F 3 42,74 Aa 37,72 Da 37,21 Ba 35,15 Da F 5 53,51 Aa 61,36 Ba 51,45 Aa 53,39 Aa CMT (mm) F 6 40,84 Ac 77,04 Aa 45,63 ABbc 54,04 Ab CV (%): F 7 53,62 Aa 40,67 CDb 38,57 ABb 38,85 CDb 11,38 F 9 47,20 Aab 54,20 Ba 45,19 ABab 42,14 ABCb F 11 48,10 Aa 51,55 BCa 47,39 ABa 51,43 ABa F 3 3 ABb 3,67 Aab 4 Aa 4 Aa F 5 2 Ca 2 Ba 2 Aa 2 Ca Notas F 6 3,67 Aa 1,33 Bc 2,67 Ba 2,00 Cbc CV (%): F 7 2,00 Cb 3,67 Aa 4,00 Ba 4,00 Aa 14,43 F 9 2,67 BCab 2,00 Bb 2,67 Bab 3,00 Ba F 11 2,00 Ca 2,00 Ba 2,67 Ba 2,00 Ca * Médias seguidas por mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste de tukey a 5% de probabilidade de significância. Com os resultados deste estudo, pode-se verificar que para cada isolado de Fusarium sp., em particular, deve ser feita a seleção do seu agente antagonista potencial, considerando que pode haver diferenças de espécies do patógeno e mesmo diferenças intraespecíficas no caso de estudos com a utilização de uma determinada espécie de Fusarium. Todavia, neste estudo, os isolados de Trichoderma sp. T 1 e T 2 foram os que obtiveram melhor desempenho, pois ofereceram pressão antagônica sobre alguns isolados, (T 1 para F 7 e T 2 para F 6 e F 9 ). Portanto, estes isolados podem ser utilizados em estudos futuros para testes in vivo da sua eficiência no controle da podridão-radicular de Nogueirapecan causada por Fusarium spp. Vários estudos atestam o potencial antagônico de Trichoderma spp. a fungos patogênicos, tanto do gênero Fusarium, quanto de outros: Louzada et al. (2009) testaram o potencial antagônico de isolados de Trichoderma spp. e verificaram que 50 isolados inibiram o crescimento micelial de Fusarium solani e pelo teste de pareamento de culturas (notas

6 menores que 3); Martis-Córder e Melo (1998) estudaram a ação in vitro de isolados selvagens de Trichoderma spp. confrontados com Verticillium dahliae, causador de murcha da berinjela e verificaram efeitos positivos do antagonista; e ainda Carvalho et al. (2011) testaram seis isolados de Trichoderma harzianum para controle de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em sementes de feijão, os quais apresentaram resultados promissores nos testes in vitro e, dentre os seis isolados, quatro reduziram de 31 a 51 % a incidência do patógeno. 5. CONCLUSÃO Embora haja necessidade de teste inicial in vitro para seleção de antagonista para cada isolado patogênico de Fusarium spp., os isolados T 1 e T 2 de Trichoderma sp. oriundos de raízes de Nogueira-pecan infectadas por Fusarium spp. apresentaram maior potencial para controle biológico deste patógeno, já que foram eficientes no antagonismo de Fusarium spp. Posteriormente a este estudo, é possível a realização de testes in vivo com o uso destes isolados para controle da podridão-radicular de Nogueira-pecan causada por Fusarium spp. REFERÊNCIAS ALFENAS, A.C. et al. Isolamento de fungos fitopatogênicos. In :ALFENAS, A.C.; MAFIA, R.G. (Eds.). Métodos em fitopatologia. Editora: UFV, Viçosa, p BELL, D. K.; WELLS, H. D.; MARKHAM, C. R. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology, [S.l.], v. 72, n. 4, p , CARVALHO, D. D. C. et al. Controle de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli in vitro e em sementes, e promoção do crescimento inicial do feijoeiro comum por Trichoderma harzianum. Tropical Plant Pathology, Brasília, v. 36, n. 1, p , FERNANDES, M.R. Manual para laboratório de fitopatologia. Passo Fundo RS: EMATER CNPT, p. FERREIRA, D.F. SISVAR: um programa para análises estatísticas e ensino de estatística. Revista Symposium, v.6, p.36-41, GRIGOLETTI JÚNIOR, A.; SANTOS, A.F.; AUER, C.G. Perspectivas do uso do controle biológico contra doenças florestais. Floresta, Curitiba, n.30, (1/2), 2000.

7 LOUZADA, G.A.S. et al. Potencial antagônico de Trichoderma spp. originários de diferentes agroecossistemas contra Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium solani. Biota Neotropica, v. 9, n. 3, p MACIEL, C.G. Fusarium sambucinum associado a sementes de Pinus elliottii: patogenicidade, morfologia, filogenia molecular e controle. 94 f Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal) Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, MARIANO, R. de L. R. Métodos de seleção in vitro para o controle biológico de patógenos de plantas. In: FERNANDES, J. M. C.; PRESTES, A. M.; PICININI, E. C. Passo Fundo: Revisão Anual de Patologia de Plantas, 1993, v.1, p p. MARTIS-CORDER, M. P.; MELO, I. Antagonismo in vitro de Trichoderma spp. sobre Verticillium dahliae KLEB. Scientia Agricola, São Paulo, v. 55, n.1, p. 1-7, MICHEREFF, S. J. Fundamentos de Fitopatologia. Recife: Universidade Federal Rural de Pernambuco, p. MILANESI, P.M. Caracterização, toxicidade e patogenicidade de Fusarium spp. em genótipos de soja em sistema plantio direto p. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2009.