UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA ALESSANDRA ALVES MARTINS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA ALESSANDRA ALVES MARTINS HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO 2 Uberlândia MG Agosto

2 ALESSANDRA ALVES MARTINS HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Agronomia, da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção do grau de Engenheiro Agrônomo. Orientadora: Nilvanira Donizete Tebaldi Uberlândia MG Agosto 2014

3 ALESSANDRA ALVES MARTINS HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Agronomia, da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção do grau de Engenheiro Agrônomo. Aprovado pela Banca Examinadora em 01 de agosto de Profª. Drª. Maria Amelia dos Santos Membro da Banca Eng. Agr. Lara Caroline Borges M. Mota Membro da Banca Profª. Drª. Nilvanira Donizete Tebaldi Orientadora

4 RESUMO A cultura do milho (Zea mays) tem grande importância econômica e social, sendo usado em algumas regiões, como fonte energética única para a alimentação humana. A incidência e severidade de patógenos são os principais fatores limitantes de produção da cultura. A mancha branca do milho, causada pela bactéria Pantoea ananatis, é uma doença que afeta a cultura gerando uma perda média de 60% na produção de grãos. As plantas infestantes podem ser hospedeiras alternativas da bactéria, atuando como fonte de inóculo e facilitando o crescimento e sobrevivência do patógeno. O presente trabalho tem como objetivo avaliar possíveis hospedeiros alternativos da bactéria Pantoea ananatis entre plantas invasoras da cultura do milho. As plantas infestantes, capim braquiária (Urochloa decumbens), capim colchão (Digitaria horizontalis), capim colonião (Panicum maximum), capim carrapicho (Cenchrus echinatus), caruru (Amaranthus deflexus) e guanxuma (Malvastrum coromandelianum), e as plantas cultivadas, café (Coffea arábica) e milho, foram inoculadas com isolados de P.ananatis provenientes de café (UFU D3 e UFU D27) e de milho (UFU B13), na concentração de 10 8 UFC ml -1, quando as plantas apresentavam de duas a três folhas. As plantas foram mantidas em câmara úmida 24 horas antes e após a inoculação, sendo que esta foi realizada via aspersão, aplicando em ambas as páginas da folha. As plantas foram avaliadas aos 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias, quanto a incidência e severidade da doença através de uma escala de nota. As plantas com sintomas de mancha branca tiveram a bactéria isolada. Conclui-se que as plantas de capim braquiária, capim colchão, capim colonião, capim carrapicho e caruru foram hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis, com exceção da guanxuma. Palavras-chave: diagnose, mancha-branca, etiologia.

5 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA MATERIAL E MÉTODOS Obtenção do inóculo e preparo de suspensão bacteriana Avaliação de hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos RESULTADOS E DISCUSSÃO Avaliação dos genótipos de Pantoea ananatis em hospedeiros alternativos Índice de doença da mancha branca CONCLUSÃO REFERÊNCIAS APÊNDICE A... 26

6 1. INTRODUÇÃO O Brasil é um dos maiores produtores de milho (Zea mays L.) do mundo, ocupando a terceira posição no ranking, sendo superado pelos Estados Unidos e a China. As maiores regiões produtoras são o Sul do país, com cerca de 37,2% da produção nacional, e o Centro-Oeste, com 30,6% (CONAB, 2013). O estado do Paraná é o maior produtor (22,5%), seguido pelos estados do Mato Grosso (13,4%) e o estado de Minas Gerais (11,5%). A cultura do milho apresenta extrema importância econômica, pois é caracterizada pelas diversas formas de sua utilização, abrangendo desde alimentação animal até as indústrias de alta tecnologia. O uso do milho em grão para alimentação animal representa a maior parte do consumo deste cereal, sendo destinado de 60 a 80% da produção no Brasil para esta atividade (EMBRAPA, 2000). Além da importância econômica, o cultivo do milho está relacionado diretamente ao aspecto social, pois grande parte de sua produção é destinada à subsistência. Segundo o IBGE (2012), mais da metade dos produtores de milho consomem a produção na própria propriedade, sendo que em algumas regiões brasileiras, como o semiárido nordestino, o milho é usado como fonte energética exclusiva na alimentação humana. A necessidade de uma produção intensa da cultura do milho, exige que sejam feitas semeaduras antecipadas sob irrigação, semeaduras na safra de verão e safrinha (PEREIRA et al., 2005). Com isso, houve uma modificação na dinâmica populacional dos patógenos que prejudicam a cultura do milho, tendo um aumento na incidência e na severidade de doenças nas regiões produtoras da cultura (LANZA, 2009). Segundo Gonçalves (2012), as principais doenças foliares que afetam a cultura do milho são a cercosporiose, ferrugem polissora, ferrugem comum, ferrugem tropical ou ferrugem branca, helmintosporiose, mancha de diplodia e a mancha branca do milho. A mancha branca, causada pela bactéria Pantoea ananatis (Serrano 1928) Mergaert et al., 1993 destaca-se como uma das mais importantes doenças que atacam a cultura do milho. A doença encontra-se distribuída em praticamente todas as regiões produtoras de milho do país, sendo que as perdas provocadas por esta podem ultrapassar 60% da 5

7 produção (FERNANDES; OLIVEIRA, 2000). Os sintomas iniciam-se pelo aparecimento de lesões foliares aquosas com formato circular, do tipo anasarca, de coloração verde-claro que depois se tornam necróticas de cor palha. Em ataques mais severos há coalescência de lesões (FERNANDES; OLIVEIRA, 2000). A bactéria Pantoea ananatis apresenta diversos hospedeiros como o melão, cebola (WALCOTT et al., 2002), arroz (TABEI et al., 1988), tomate e pode sobreviver em folhas de plantas daninhas (GONÇALVES et al., 2010), dificultando assim o seu controle. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo verificar hospedeiros alternativos da bactéria Pantoea ananatis entre plantas invasoras da cultura do milho. 6

8 2. REVISÃO DE LITERATURA A cultura do milho (Zea mays L.) é um dos cereais mais produzidos no mundo, devido à importância na cadeia alimentar (LANZA, 2009). Segundo a CONAB (2013), no Brasil a produção de milho apresentou um acréscimo de 8,8% em relação ao ano de 2012, tendo assim a produção de ,9 mil toneladas. Além disso, em 2012 o Brasil exportou, aproximadamente, 20 milhões de toneladas de milho, alcançando a segunda posição mundial em exportação. Os principais mercados de destino das exportações foram a China, Estados Unidos e Argentina (CONAB; ABRAMILHO, 2012). A produção de milho tem se caracterizado pela divisão de duas épocas de plantio conhecidas como safra e safrinha, sendo o período de safra feito durante o período chuvoso e a safrinha entre os meses de janeiro e abril. A safrinha apresenta menor produção, pois o plantio é realizado em uma época com condições climáticas desfavoráveis ao crescimento da cultura do milho (EMBRAPA, 2006). O cultivo intenso da cultura do milho em diversas áreas do Brasil tem aumentado a incidência de doenças, pois, segundo Lanza (2009), a expansão da fronteira agrícola, plantio de safra e safrinha, aumento no uso de sistemas de irrigação, ausência de rotação de cultura e uso de materiais suscetíveis tem causado mudanças na dinâmica populacional dos patógenos. Com isso, há um aumento expressivo na incidência e severidade de patógenos que prejudicam a cultura do milho, sendo estes muitas vezes considerados como o principal fator limitante de produção no milho. A mancha branca do milho destaca-se como sendo uma das mais importantes doenças que afetam a cultura, sendo esta encontrada e disseminada em praticamente todas as regiões onde o milho é cultivado (FERNANDES; OLIVEIRA, 1997; FANTIN, 1994). A doença antes de 1990 não apresentava grande importância, pois geralmente, só aparecia no final do ciclo da cultura. Mas a mancha branca tem afetado plantas mais jovens, podendo levá-las à seca prematura e gerar uma perda de cerca de 60% na produção de grãos (BALMER; PEREIRA, 1987; GODOY et al. 2001). A bactéria Pantoea ananatis é o agente causal da mancha branca do milho. No entanto, inicialmente acreditava-se que a doença era causada por um fungo ascomiceto 7

9 Phaeosphaeria maydis (FANTIM, 1994), assim como por outros fungos obtidos em sua lesão. Através de testes de patogenicidade e reisolamento do patógeno proveniente de lesões produzidas por inoculação artificial em casa de vegetação, Paccola-Meirelles et al. (2001) comprovaram que a bactéria é realmente o agente causal da mancha branca do milho. Pantoea ananatis é uma bactéria gram negativa, não esporulante, com respiração do tipo anaeróbica facultativa, ou seja, é uma bactéria fermentativa (GONÇALVES, 2012). Os sintomas da mancha branca caracterizam-se pela presença inicial de anasarcas circulares, aquosas e verde-claro que com o tempo tornam-se lesões necróticas, sendo que estas se iniciam na ponta da folha progredindo para a base, e variam de tamanho de acordo com o nível de resistência do material utilizado (LANZA, 2009; PACCOLA- MEIRELLES et al., 2002). Em ataques severos, a bactéria pode causar sintomas na palha da espiga, seca prematura das folhas e redução no tamanho e peso dos grãos (OLIVEIRA et al. 2004). Segundo Rocha e Paccola-Meirelles (2008), P. ananatis é uma bactéria epifítica, com propriedades de nucleação do gelo que é um fenômeno onde há a formação de cristais de gelo no conteúdo celular, levando ao rompimento e extravasamento deste, sendo uma propriedade que pode ajudar a esclarecer o progresso do sintoma da doença desde de lesões anasarcas, com aspecto encharcadas até o tecido vegetal necrótico com coloração palha. A população da bactéria aumenta á medida que o milho atinge a fase de pré-florescimento. Além disso, a bactéria Pantoea ananatis apresenta um mecanismo conhecido como quorum sensing, que permite uma comunicação intercelular, permitindo a percepção da densidade populacional entre as bactérias. Este mecanismo influencia na sobrevivência, patogenicidade, virulência, produção de antibióticos, mobilidade das bactérias na planta. Estas emitem sinais que permitem reconhecer o tamanho da população e, caso esta seja diminuta, as bactérias passam a se agrupar, agindo como único individuo (SAUER, 2010). As condições favoráveis para o desenvolvimento da doença são de umidade relativa alta, com cerca de 60%, e temperaturas amenas, em torno de 14ºC, principalmente em épocas chuvosas (FANTIM, 1994). O cultivo do milho no Brasil é realizado muitas vezes em épocas chuvosas, propiciando condições ideais para o desenvolvimento da doença (FERNANDES; OLIVEIRA, 1997). 8

10 A bactéria é disseminada pela ação de agentes bióticos, como homem, animais, insetos, e por abióticos, como chuva, ventos e enxurradas. Quanto à sobrevivência, P.ananatis é um micro-organismo que reside epifiticamente nas folhas, podendo causar injúrias em seu hospedeiro (MENDES et al. 2011). Segundo Fernandes e Oliveira (2000), o inóculo primário da bactéria pode ter origem nos restos culturais do milho, o que dificulta o seu controle, pois ao realizar a semeadura direta o potencial do inóculo poderá aumentar, sujeitando as lavouras de milho à ocorrência da doença com maior severidade. A P. ananatis causa doenças em diversas culturas como melão, cebola, aveia e tomate (WEELLS et al., 1987; WATANABE et al., 1996; GITAITIS et al., 1997; AZAD et al., 2000; COTHER et al., 2004). Na África do Sul, a bactéria foi identificada causando seca dos ponteiros e manchas foliares em eucalipto (COUTINHO et al., 2002). Além destas culturas, foram encontradas lesões de P. ananatis em folhas de capim-colchão, uma erva daninha que é muito comum em lavouras de milho. Segundo Rocha e Paccola- Meirelles (2008), estas lesões apresentam uma variabilidade morfológica semelhante à variabilidade descrita para diferentes genótipos de milho. Sendo assim, acredita-se que esta erva daninha é um hospedeiro alternativo com alto potencial para que a bactéria se desenvolva nas áreas de plantio do milho. Os hospedeiros alternativos podem favorecer a sobrevivência da bactéria e atuam como fonte de inóculo, tendo assim um papel fundamental no desenvolvimento de doenças. O manejo integrado de doenças inclui a eliminação de hospedeiros alternativos do patógeno em áreas produtivas como um dos métodos de controle (NECHET et al., 2009). As plantas daninhas, além de ser um dos fatores que mais afetam a agricultura, competindo diretamente com a cultura por nutrientes, água e luz, se caracterizam como um hospedeiro alternativo com grande potencial de crescimento para o patógeno (LEITÃO FILHO, 1972). Bactérias com ampla gama de hospedeiros são de difícil controle, como é o caso de P. ananatis e Ralstonia solanacearum (YABUUCHI et al., 1995; LOPES et al., 1994). 9

11 3. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido em Casa de Vegetação e no Laboratório de Bacteriologia Vegetal do Instituto de Ciências Agrárias (ICIAG) da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) no ano de Obtenção do inóculo e preparo de suspensão bacteriana Os isolados bacterianos de Pantoea ananatis utilizados no experimento, foram provenientes de plantas de café (UFU D3 e UFU D27) originários de Romaria e Indianópolis MG e de plantas de milho (UFU B13), originários de Planaltina de Goiás GO, pertencentes à coleção de trabalho do Laboratório de Bacteriologia Vegetal do ICIAG/ UFU. Estes isolados foram cultivados em meio 523 (KADO & HESKETT, 1970). A suspensão bacteriana foi preparada em solução de NaCl 0,85%, sendo ajustada em espectrofotômetro para OD 600 =0,3, correspondendo a aproximadamente 1x10 8 UFC ml -1 (MIRANDA, 2004) Avaliação de hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis O experimento foi conduzido em casa de vegetação onde foi feita a semeadura de milho, o uso de mudas de café variedade Mundo Novo e seis espécies de plantas invasoras (Tabela 1) em vasos de 500 ml. As mudas das plantas invasoras foram coletadas nas entrelinhas de cafezais, na Fazenda Glória, com exceção do capim colonião e capim carrapicho que foram coletadas as sementes, sendo transplantadas para vasos em casa de vegetação. Após seis meses do plantio, quando estas plantas estavam vigorosas e contendo de 2 a 3 folhas foi realizada a inoculação. A temperatura da casa de vegetação foi mensurando. Foram utilizados dois isolados de P. ananatis provenientes do café e um isolado proveniente do milho para inoculação da bactéria nas plantas, descritos anteriormente. 10

12 Tabela 1. Espécies de plantas utilizadas como hospedeiras de Pantoea ananatis. Nome Comum Café mundo novo Capim braquiária Capim colchão Capim colonião Capim carrapicho Caruru Guanxuma Milho *Fonte: Lorenzi, (1990). Nome científico* Coffea arabica L Urochloa decumbens Digitaria horizontalis Panicum maximum Cenchrus echinatus Amaranthus deflexus Malvastrum coromandelianum Zea mays As plantas foram mantidas em câmara úmida 24 horas antes e após a inoculação da bactéria. A inoculação foi feita por aspersão utilizando uma bombinha manual (100 ml) e o inóculo aplicado em ambas as páginas da folha. O experimento foi realizado em esquema fatorial 8x3x4, onde foram utilizadas oito espécies de plantas, inoculadas com três isolados de P. ananatis e quatro repetições. As plantas foram avaliadas aos 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias após a inoculação quanto ao aparecimento de sintomas. Foram avaliadas a incidência e severidade da doença através de uma escala de notas, onde: - 0= planta sem sintomas; - 1= até 25% da área da folha apresentando manchas; - 2= 25% a 50% da área da folha com manchas; - 3= mais de 50% da área da folha com manchas; - 4= planta apresentando desfolha e seca. Para ponderar a severidade da doença, foi aplicado o índice de McKinney (1923), descrito pela seguinte fórmula: ID (%) = ((f.v)/(n.x)). 100 Em que: ID = Índice de doença; f = Número de plantas com determinada nota; v = Nota observada; n = Número total de plantas avaliadas; x = Grau máximo de infecção. 11

13 Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância através do teste de Tukey, a 0,05 de significância, e os dados transformados em x+0,5, por meio do programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008) Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos Das plantas doentes com sintomas de mancha branca foi feito isolamento da bactéria em meio de cultura 523 e os isolados caracterizados cultural e bioquimicamente pelos testes de Gram em KOH 3%, oxidação ou fermentação da glicose e YDC Isolamento em meio 523 O isolamento da bactéria Pantoea ananatis foi feito a partir de lesões jovens (tipo anasarca), em meio de cultura 523. Folhas coletadas foram lavadas e cortadas em fragmentos de 0,5x 0,5cm desinfectadas com álcool etílico 70%, hipoclorito de sódio 2%, lavadas em água destilada esterilizada (PACCOLA-MEIRELLES et al.,2001) e colocadas sobre o meio de cultura 523 e incubadas a 28ºC por cerca de 3 dias Teste KOH O teste da reação ao hidróxido de potássio (KOH) é usado para confirmar se a bactéria é Gram positiva ou negativa. O teste verifica a capacidade da parede bacteriana da amostra em resistir à ação de lise provocada pelo contato com KOH (OLIVEIRA, 2000). Colocada uma gota de KOH 3% em uma lâmina para microscopia, coletou-se parte de uma colônia presente em cultura na placa de meio 523 e colocou esta em contato com a gota de KOH. Após dissolver a alíquota, levantasse-se a alça de repicagem seguidas vezes por 30 segundos, observando se houve a lise da célula (Gram negativa) formando um fio viscoso (BRASIL, 2010; OLIVEIRA, 2000) Oxidação ou fermentação da glicose O teste da oxidação ou fermentação da glicose (O/F) em meio Ágar Hugh & Leifson permite determinar o uso da via oxidativa ou fermentativa da glicose. Em meio 12

14 composto de 10g de dextrose e 1 ml de glicerol autoclavado, foi semeada a bactéria oriunda de uma cultura com 24 a 48 horas de idade, com uma alça de platina aberta, fazendo uma perfuração do meio pela alça, para que fosse feita a inoculação. Os tudo são direcionados à incubadora, à temperatura de 28 ºC, mantendo estes de 1 a 3 dias na mesma Teste em meio YDC Para confirmação de que o isolado coletado dos hospedeiros utilizados trata-se de Pantoea ananatis, foram realizados isolamentos destas em meio YDC. No caso desta bactéria, as colônias formadas devem ser de coloração amarela e com aspecto liso. Os isolados foram repicados, fazendo estrias simples sobre o meio e após 48 horas em estufa à 28ºC, observou-se o crescimento da colônia. 13

15 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Avaliação de hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis Após 21 dias da inoculação foram observados os sintomas da mancha branca em café, capim braquiária, capim carrapicho, capim colchão, capim colonião, caruru e milho, inoculados com os isolados UFU B13, UFU D3 e UFU D27 de Pantoea ananatis (Tabela 2). Nas plantas de guanxuma não foram observados sintomas da doença. Tabela 2 Sintomas da mancha branca observados em diferentes hospedeiros, com diferentes isolados de Pantoea ananatis. Uberlândia, MG, Hospedeiros Isolados UFU B13 UFU D3 UFU D27 Café Capim braquiária Capim carrapicho Capim colchão Capim colonião Caruru Guanxuma Milho (+) Sintomas observados; (-) Ausência de sintomas. Das plantas com sintomas, os isolados bacterianos, que apresentaram colônias amarelas brilhante com aspecto liso, com bordos regulares no meio 523, lise celular no teste KOH, formando fio viscoso (Gram negativas), anaeróbica estrita e colônias amarelas em YDC, foram considerados Pantoea ananatis (APÊNDICE A). Segundo Lanza (2009), as colônias de Pantoea ananatis apresentam aspecto liso, com colônias convexas e coloração amarela brilhante com bordos regulares. As plantas de milho apresentaram sintomas característicos de mancha branca três dias após a inoculação, com lesões inicialmente amareladas e circulares, tornando-se necróticas (Figura 1A). Aos 21 dias após a inoculação, as manchas se mostravam com aspecto palha, em diferentes tamanhos. 14

16 Nas folhas de plantas de café (Figura 1B), os sintomas foram observados a partir de 3 dias após a inoculação até o 18º dia, como sintomas iniciais de pequenas pontuações amarelas, seguidas de elevações na face superior da folha. O capim braquiária (Figura 1C) e capim colonião (Figura 1D) apresentaram sintomas três dias após inoculação; capim colchão (Figura 1E) e capim carrapicho (Figura 1F) apresentaram sintomas da mancha branca aos 6 e 9 dias após a inoculação, respectivamente. Estes quatro capins apresentaram sintomas similares ao descrito para as plantas de milho. O hospedeiro caruru (Figura 1G) apresentou sintomas de mancha branca, porém estes não se mostraram com os sintomas característicos da doença observados na cultura do milho. Os sintomas apareceram seis dias após a inoculação, sendo pequenas pontuações translúcidas, que se tornam brancas, com aspecto leitoso, com o passar do tempo. Diferente dos demais hospedeiros, a guanxuma não apresentou sintomas com a inoculação dos diferentes isolados de Pantoea ananatis. Figura 1. Sintomas da mancha branca, causada por Pantoea ananatis, em plantas de milho (A), café (B), capim braquiária (C), capim colonião (D), capim colchão (E), capim carrapicho (F) e caruru (G). 15

17 Gonçalves et al., (2010) isolaram a bactéria Pantoea ananatis de pequenas lesões foliares em capim colchão, planta típica nos campos de produção de milho; e realizaram o teste de patogenicidade reproduzindo sintomas semelhantes aos causados na cultura do milho quando inoculados em capim colchão, sob condições controladas em casa de vegetação. Em condições de temperatura ideal, cerca de 15ºC e câmara úmida por 24 horas, houve maior incidência da doença. Segundo Gonçalves (2012), o capim colchão é uma das plantas mais comuns nas lavouras de milho quando em sucessão com o próprio milho safrinha ou culturas em plantio direto, sendo um hospedeiro preocupante da bactéria. Além disso, Silva et al. (2010) verificaram que os isolados de Pantoea ananatis obtidos de plantas de capim colchão foram patogênicos à diferentes híbridos de milho, concluindo que o capim colchão é uma fonte de inóculo para a ocorrência de mancha branca no milho. Orozco (2004) inoculou Ralstonia solanacearum in vitro em diversas plantas infestantes como o mastruz maria pretinha (Solanum americanum), beldroega (Portulaca oleracea L.), caruru (Amaranthus spp.), amendoim-bravo (Euphorbia heterophylla L.), picão-preto (Bidens pilosa L.), capim colchão (Digitaria horizontalis). Com exceção do capim colchão, todas as plantas infestantes mostraram potencial de hospedeiro da bactéria, sendo que as raízes da maioria destas permitiram a colonização de R. solanacearum, favorecendo a sobrevivência da bactéria com ou sem manifestação de sintomas. Além de plantas infestantes, o sorgo (Sorghum bicolor) também, é hospedeiro de Pantoea ananatis (Silva et al., 2010). Isolados provenientes de milho e de capim colchão foram inoculados em plantas de sorgo em casa de vegetação, gerando manchas avermelhadas no limbo foliar que progrediram para lesões necróticas com bordos vermelhos. Plantas de sorgo foram coletadas em campo, apresentando sintomas semelhantes aos obtidos na inoculação artificial e, quando isoladas, tiveram crescimento de colônias amarelas, confirmadas como P. ananatis. Outras culturas de maior importância econômica também são consideradas hospedeiras de P.ananatis. Em cebola (Allium cepa L.), a bactéria é transmitida por tripes, causando podridão central e infectando naturalmente as sementes de cebolas. Verificou-se também que a bactéria pode sobreviver e colonizar a superfície de plantas 16

18 infestantes nos campos de produção de cebola, especialmente em áreas onde é utilizada a rotação de culturas com a cultura do milho (GITAITIS et al., 2002). No Japão, a bactéria foi encontrada na cultura melão, gerando podridão interna, caracterizada por odor forte e coloração marrom ao redor da placenta dos frutos cultivados em estufas comerciais (WEELLS et al., 1987). Além disso, segundo Gonçalves (2012), outras espécies do gênero Pantoea foram identificadas causando doenças tanto em milho, como em outras espécies cultivadas. A bactéria Pantoea citrea foi identificada como agente da doença rosa do abacaxi, formando compostos que tornam a coloração da polpa, suco e frutos rosa e marrom avermelhada (CHA et al. 1997). Já a P. agglomerans foi relatada no México como causadora de murchas vasculares e crestamento foliar no milho e sorgo e, nos Estados Unidos, como causadora de podridão de bulbos e crestamento foliar em cebola (EDENS et al., 2006) Índice de doença da mancha branca Para o índice de doença da mancha branca do milho (Tabela 3), o isolado UFU D3, proveniente de plantas de café, foi o mais patogênico em relação aos hospedeiros analisados. Os hospedeiros, capim colchão e capim colonião (26,56%) apresentaram os maiores índices de doença, seguido pelas plantas de milho (23,44%). O isolado D3 de Pantoea ananatis mostrou mais agressivo que os demais, sendo patogênico há um maior número de hospedeiros, desenvolvendo-se em café, capim braquiária, capim colchão, capim colonião e milho. Apesar do isolado UFU D3 ter apresentado maior índice de doença, este não foi patogênico a todos os hospedeiros. Capim carrapicho e caruru foram identificados como hospedeiros, porém foram infectados apenas pelo isolado UFU B13. Diante disto, é importante a utilização de diferentes isolados, provenientes de culturas distintas para a inoculação de plantas. Cada isolado atua diferentemente no hospedeiro, devido à sua diversidade genética. Os diferentes isolados bacterianos utilizados proporcionaram diferentes resultados aos hospedeiros. A restrição de utilizar apenas um isolado poderia gerar falsos resultados, desconsiderando a espécie como hospedeiro alternativo da bactéria Pantoea ananatis. 17

19 Tabela 3. Índice de doença da mancha branca do milho, causada por Pantoea ananatis em diferentes hospedeiros com diferentes isolados. Uberlândia, MG, Hospedeiro Isolado Índice de doença (%) Café UFU D3 17,19 a Capim braquiária UFU D3 21,88 a UFU D27 9,38 b Capim carrapicho UFU B13 3,13 b Capim colchão UFU D3 26,56 a Capim colonião UFU D3 26,56 a Caruru UFU B13 6,25 b Milho UFU B13 12,50 a UFU D3 23,44 a Média dos Isolados UFU B13 UFU D3 UFU D27 CV(%) 61,84 2,73 B 14,45 A 1,17 B Médias seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 0,05 de significância. Segundo Gonçalves et al. (2010) os isolados bacterianos utilizados em testes de agressividade, devem ser selecionados a partir do estudo de variabilidade genética do patógeno, tendo assim, uma maior representatividade do quanto este é suscetível ao mesmo em diferentes ambientes de cultivo. Uma das formas de analisar a variabilidade genética de patógenos é o uso de marcadores moleculares. Nakatani (2009) analisando a variabilidade genética de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae observou uma variabilidade na agressividade de diferentes isolados em relação ao maracujá azedo, recomendando o uso de isolados mais agressivos pelo fato 18

20 de que assim é proporcionado maior rigor na seleção de genótipos resistentes e suscetíveis. Conhecendo os hospedeiros alternativos de mancha branca é possível evitar rotações de culturas e aumentar o cuidado com a eliminação de plantas infestantes, impedindo que estas sejam uma fonte de inóculo primário para a próxima estação de cultivo da cultura hospedeira (NASCIMENTO et al., 2004; SIKIROU; WYDRA, 2004). 19

21 5. CONCLUSÕES Plantas de café, capim braquiária, capim colchão, capim colonião, capim carrapicho e caruru foram hospedeiras alternativas de Pantoea ananatis, enquanto que guanxuma não comportou-se como hospedeira da bactéria. 20

22 REFERÊNCIAS ABRAMILHO- Associação Brasileira dos produtores de milho. Acesso em 07 de janeiro de AZAD, H. R.; HOLMES, G. J.; COOKSEY, D. A. A new leaf blotch disease of sudangrass caused by Pantoea ananas e Pantoea stewartii. Plant Disease, 84: , Disponível em BALMER, E.; PEREIRA, O.A.P. Doenças do milho. In: PATERNIANI, E.; VIÉGAS, G.P. Melhoramento e Produção do milho. 2ªed. Campinas: Fundação Cargil, v.2, p ,1987. BRASIL. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde - Modulo IV: Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos, Anvisa/Ministério da saúde, 1ª edição, 2010c. CHA, J. S.; PUJOL, C.; DUCUSIN, A. R.; ACION, E. A.; HUBBARD, C. H.; KADO, C. I. Studies on Pantoea citrea, the Casual Agente of Pink Disease of Pineapple. Journal of Phytopathology, Berlin, v. 145, p , Disponível em: CONAB Companhia Nacional de Abastecimento. Importação e Exportação: Exportação algodão e milho. Dezembro, CONAB- Companhia Nacional de Abastecimento. Acompanhamento de safra brasileira: grãos, nono levantamento, julho 2013 / Companhia Nacional de Abastecimento. Brasília: Conab, COTHER, E. J.; REINKE, R.;MCKENZIE, C.; LANOISELET, V. M.; NOBLE, D. H. An unusual stem necrosis of rice caused by Pantoea ananas and the first record of this pathogen on rice in Australia. Australian Plant Pathology, 33: , Disponível em: COUTINHO, T.A.; PREISING, O.; MERGAERT, J. CNOCKAERT, M.C.; RIEDEL, K-H.; SWINGS, J.; WINGFIELD, M.J. Bacterial blight and dieback of Eucalyptus species, hybrids and clones in South Africa. Plant Disease 86: 20-25, Disponível em: EDENS, D. g.; GITAITIS, R. D.; First Report of Pantoea agglomerans Causing a Leaf Blight and Buld Rot of Onions in Georgia. Plant Disease, Saint Paul, v.90, p. 1551,

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25 Doenças. In: ZILLI, J.E., VILARINHO, A.A., ALVES, J.M.A (Eds.). In: ZILLI, J. E.,VILARINHO,A.A., ALVES, J.M.A. (Org.). A cultura do feijão-caupi na Amazônia Brasileira, led. BoaVista: Embrapa Roraima, v. 1, p OLIVEIRA, E. de.; FERNANDES, F.T.; CASELA, C.R.; PINTO, N.F.J.A. & FERREIRA, A.S. Diagnose e controle de doenças na cultura do milho. In: Galvão, J.C.C. & Miranda, G.V. (Eds.) Tecnologias de produção de milho. Viçosa- MG: Universidade Federal de Viçosa, pg , OLIVEIRA, S. J. Microbiologia Veterinária, Guia Bacteriológico Prático. Canoas: ULBRA, 2ª Edição, OROZCO M., E.F., TAKATSU, A. & UESUGI, C.H. Colonização de raízes de plantas daninhas cultivadas in vitro e em vasos por Ralstonia solanacearum, biovares 1, 2 e 3. Fitopatologia Brasileira 29: Disponível em: PACCOLA-MEIRELLES, L. D.; FERREIRA, A. S.; MEIRELLES, W. F.; MARRIEL, I. E. & CASELA, C. R Detection of a bacterium associated with a leaf spot disease of maize in Brazil. J. of Phytopath. 149(5): PACCOLA-MEIRELLES, L. D.; MEIRELLES, W. F.; PARENTONI, S. N.; MARRIEL, I. E.; FERREIRA, A. S. & CASELA, C. R Reaction of maize inbred lines to a bacterium, Pantoea ananas, isolated from Phaeosphaeria leaf spot lesions. Crop Breeding and Applied Biotechnology 2(4): PEREIRA, O. A. P.; CARVALHO, R. V.; CAMARGO, L. E. A. Doenças do milho. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. E. A. Manual de Fitopatologia. São Paulo: Ceres, p v. 2. ROCHA, K. R.; PACCOLA-MEIRELLES. L. D. Fatores envolvidos na reprodução da doença Mancha Branca do Milho. In: Encontro de Bolsista do Programa de Apoio a Ações Afirmativas para Inclusão Social, 2008, Universidade Estadual de Londrina/ Centros de Ciências Biológicas, Anais do III Encontro de Bolsistas do Programa de Apoio a Ações Afirmativas para Inclusão Social. UEL-PR, CD-ROM, SAUER, A. V. Monitoramento e caracterização da população epifítica de Pantoea ananatis, agente causal da mancha branca do milho. Londrina, f: Il. Disponível em: SILVA, D. D.; COSTA, R. V.; COTA, L. V.; PARREIRA, D.F.; LANA, U. G. P.; FERREIRA, P. NOLASCO, A. A. R.; SOUZA, I. R. P.; MARRIEL, I. E. Inoculação cruzada de isolados de Pantoea ananatis de milho e capim colchão. XLIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia.Agosto, SILVA, D. D.; COSTA, R. V.; COTA, L. V.; PARREIRA, D.F.; LANA, U. G. P.; FERREIRA, P. NOLASCO, A. A. R.; SOUZA, I. R. P.; MARRIEL, I. E. Primeiro 24

26 relato da patogenicidade de Pantoea ananatis em sorgo (Sorghum bicolor) no Brasil. XLIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia.Agosto, SIKIROU, R., WYDRA, K. Persistence of Xanthomonas axonopodis pv. vignicola in wceds and crop debris and identification of Sphenostylis stenocarpa as a potential new host. European Journal of Plant Pathology, v. 1 10, p , TABEI, H., AZEGAMI, K., FUKUDA, T. Infection site of rice grain with Erwinia herbicola, the causal agent of bacterial palea browning of rice, 1988 Ann. Phytopathol. Soc. Japan 54: Disponível em WALCOTT, R.R.; GITAITIS, R.D.; CASTRO, A.C.; SANDERS, F.H.; DIAZ-PEREZ, J.C. Natural infestation of onion seed by Pantoea ananatis, causal agent of center rot. Plant Disease, v.86, p , Disponível em: WATANABE, K.; KAWAKITA, H.; SATO, M. Epiphytic bacterium, Erwinia ananas, commonly isolated from rice plants and brown planthoppers (Nilaparvata lugens) in hopperburn patches. Applied Entomology and Zoology, 31: , WELLS, J. M.; SHENG, W. S.; CEPONIS, M. J.; CHEN, T. A. Isolation and characterization of strains of Erwinia ananas from honeydew melons. Phytopathology, 77: , YABUUCHI, E.; KOSAKO, Y.; YANO, I.; HOTTA, H.; NISHIUCHI, Y. Transfer of two Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia gen. nov.: proposal of Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff, 1973) comb. nov., Ralstonia solanacearum (Smith 1896) comb. nov. and Ralstonia eutropha (Davis 1969) comb. nov. Microbiology Immunology, Tokyo, v. 39, n. 11, p ,

27 APÊNDICE A 1. ISOLAMENTO EM MEIO 523 Figura 2: Isolamento das lesões e repicagem de colônias típicas. 2. TESTE KOH Bactérias Gram-negativas, como Pantoea ananatis formam o fio viscoso e são consideradas positivas no teste, pois sua parede bacteriana não é resistente a solução de KOH 3% ocorrendo então lise celular (FIGURA 3). O DNA da bactéria entra em contato com o reagente, formando o material viscoso evidenciado pela formação do fio. Bactérias Gram-positivas não formam o fio viscoso e são consideradas negativas no teste, pois sua parede é resistente à ação do reagente, não ocorrendo assim a lise celular e seu material genético não é exposto ao KOH 3% (Oliveira, 2000). Figura 3: Teste KOH positivo. 26

28 3. OXIDAÇÃO OU FERMENTAÇÃO DA GLICOSE Pantoea ananatis é uma bactéria fermentativa. Sendo assim, nos tubos onde houve crescimento bacteriano, houve a produção de ácido a partir da glicose, reduzindo o ph e fazendo com que o meio adquira coloração amarela, indicando um resultado positivo para o teste. Os tubos que mantiveram a coloração original do preparo da mistura foram considerados como amostras com bactérias oxidativas e formam descartados. Figura 4: Realização do teste oxidativo/fermentativo, com resultados positivos e negativos, respectivamente. 4. TESTE EM MEIO YDC Após 48 horas em estufa observou-se a formação de colônias amarelas de todos os isolados utilizados (FIGURA 5), indicando que estes são provenientes da bactéria Pantoea ananatis. Figura 5: Colônias formadas em meio YDC. 27