SENSIBILIDADE IN VITRO DE Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum, AGENTE CAUSAL DA MANCHA ANGULAR DO ALGODOEIRO, A ANTIBIÓTICOS

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1 SENSIBILIDADE IN VITRO DE Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum, AGENTE CAUSAL DA MANCHA ANGULAR DO ALGODOEIRO, A ANTIBIÓTICOS José O.M. Menten (Esalq -USP / jomenten@esalq.usp.br), Cleci Dezordi (Esalq -USP), Antonio C. Maringoni (Unesp), Sandra C. Vigo-Schultz (Unesp) RESUMO - O objetivo deste trabalho foi a determinação da sensibilidade de cinco isolados de Xanthomonas axonopodis pv malvacearum (Xam) à 67 antibióticos de uso clínico. Isto é justificado pela necessidade do desenvolvimento de meios semi-seletivos para a detecção e identificação do patógeno em sementes e, pela busca de alternativas para o controle químico da mancha angular do algodoeiro, causada pela bactéria. A sensibilidade de Xam aos 67 antibióticos foi determinada através da medição do raio do halo de inibição do crescimento bacteriano produzido por discos contendo os antibióticos em concentrações pré determinadas pelo fabricante OXOID. Antibióticos que permitiram o crescimento de todos os isolados de Xam foram avaliados em concentrações de 0, 5, 10, 15, 20, 30, 50 e 100 mg/l ou ppm. Foram detectados nove antibióticos considerados ineficientes (com potencial de serem utilizados no desenvolvimento de meio semi-seletivo para Xam), 40 antibióticos eficientes (com potencial para controle químico do patógeno) e 18 antibióticos com reações variáveis de acordo com o isolado de Xam. Cefalexina, mesmo em concentração de 100 mg/l ou ppm, não interferiu no crescimento de Xam, sendo o antibiótico mais promissor para o desenvolvimento do meio semi-seletivo. Palavras-chave: doença, patógeno, bactéria, detecção, identificação, meio seletivo. IN VITRO SENSIBILITY OF Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum, CAUSAL AGENT OF COTTON ANGULAR LEAF SPOT TO ANTIBIOTICS RESUMO - The objective of this research was the determination of the sensitivity of Xanthomonas anoxopodis pv. malvacearum (Xam) to antibiotics of clinical use. It is justified by the necessity of semiselective media for the detection and identification of the pathogen in seeds and by the selection of alternatives for cotton leaf spot (Xam) chemical control. The sensibility of Xam to 67 antibiotics was evaluated by measuring the inhibition halo of the bacterial growth produced by discs with predetermined concentrations of the antibiotics, according OXOID. Antibiotics that showed growth of every isolate of Xam were evaluated at 0, 5, 10, 15, 20, 30, 50 and 100 mg/l or ppm. Nine antibiotics were considered inefficients (with potential to be used for the development of semi-selective medium), 40 antibiotics were efficients (with potential for the pathogen chemical control) and 18 antibiotics showed variable reactions according to the Xam isolates. Cefalexin, even at the 100 ppm concentration, allowed the Xam growth, being the most promising antibiotics for a semi-selective medium. Key words: disease, pathogen, bacterium, detection, identification, selective medium.

2 INTRODUÇÃO O algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) é uma das mais antigas espécies vegetais cultivadas no mundo e um das mais importantes, por se constituir na principal fibra têxtil utilizada pelo homem. Entre os fatores que reduzem o rendimento do algodoeiro, destacam-se as doenças com cerca de 15% de perdas. Entre estas, uma das mais importantes é a mancha angular, causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam). O controle da mancha angular do algodoeiro pode ser realizado pelo emprego de cultivares resistentes e rotação de culturas. Também se pode usar o controle químico, através da pulverização com fungicidas cúpricos e estânicos, e sementes livres de inóculo. Antibióticos podem ser pulverizadas nas plantas ou usadas no tratamento de sementes (CIA e SALGADO, 1997). Antibióticos também são importantes no desenvolvimento de meios semi-seletivos para detecção e identificação de bactérias. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade de cinco isolados patogênicos e representativos de Xam a 67 antibióticos de uso clínico, disponíveis no Brasil. Antibióticos ineficientes contra Xam poderão ser incorporados a meios de cultura para o desenvolvimento de meio semiseletivos, desde que inibam o crescimento de bactérias contaminantes que posam mascarar ou prejudicar a detecção e identificação da bactéria-alvo. Antibióticos eficientes contra Xam poderão ser mais estudados para controle químico do patógeno, tanto na pulverização da parte aérea como no tratamento de sementes. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados cinco isolados patogênicos de Xam, obtidos nas principais regiões produtoras do Brasil (MT, GO, MS, SP e PR) e 67 antibióticos de uso clínico disponíveis no comércio nacional (OXOID). Os experimentos foram realizados nos laboratórios da ESALQ/USP, Piracicaba-SP (Dep. Fitopatologia) e da FCA/UNESP, Botucatu-SP (Dep. Defesa Fitossanitária). Experimento 1 (avaliação qualitativa): Em um litro de meio de cultura NA foi incorporado, à temperatura ponto de fusão, culturas previamente crescidas de Xam em nutriente líquido por 24 h/28 C. Sobre meio de cultura NA, foram distribuídos seis discos de papel com antibióticos, nas concentrações de ingrediente ativo no disco pré determinadas pelo fabricante OXOID incubação foi realizada em estufa a 28 C/48 h.. Avaliou-se a sensibilidade dos cinco isolados de Xam, in vitro, aos antibióticos descritos na Tabela 1, por meio da verificação do raio (mm) do halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco de antibiótico. O resultado foi determinado pela comparação dos valores obtidos de tamanho de halo de inibição, com o valor de tabelas internacionais de tamanho de halo de inibição préestabelecida pelo fabricante para diferentes microrganismos (Tab. 1) (NCCLS, 2005). Os isolados de Xam foram considerados resistentes (R) se o raio do halo de inibição do crescimento da bactéria pelo antibiótico foi menor que o limite inferior estabelecido na Tabela 1, sendo o antibiótico considerado ineficiente; os isolados de Xam foram considerados sensíveis (S) se o raio do halo da inibição do antibiótico foi maior que o limite superior estabelecido na Tabela 1, sendo o antibiótico considerado eficiente; os isolados de Xam que exibiram o raio do halo de inibição entre o limite inferior e superior da Tabela 1 foram considerados intermediários (I), sendo os antibióticos também considerados intermediários.

3 Experimento 2 (avaliação quantitativa): Antibióticos, que não inibiram o crescimento de Xam no experimento 1, foram avaliados quanto a sensibilidade dos cinco isolados de Xam, in vitro, nas concentrações 0, 5, 10, 15, 20, 30, 50 e 100 mg/l de ingrediente ativo, previamente diluído e misturado ao meio de cultura NA. A semeadura das suspensões dos isolados de Xam (cultura prévia em NL, por 24 h/28 C) foi pelo método de estrias distribuídas sobre a superfície do meio de cultura. Utilizaram-se quatro repetições, sendo cada placa de Petri uma repetição. A incubação foi realizada em estufa a 28 C/ 96 h.. Após, realizou-se uma avaliação qualitativa, examinando-se a presença (+) ou ausência (-) do crescimento dos isolados em todos os tratamentos. RESULTADOS E DISCUSSÃO Experimento 1: As reações dos isolados de Xam aos 67 antibiótico estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1 - Sensibilidade de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum a antibióticos através da avaliação do raio do halo da inibição, in vitro, em mm. TIPO DE REAÇÃO ANTIBIÓTICO CONC. RESISTENTE SENSÍVEL MT GO MS PR SP Sensib. DISCO (µg) Amikacin 30 <14 >17 27,2 24,2 27,3 23,9 30,6 S Ceforoxime 30 <14 >18 27,2 21,8 26, S Mupirocin 30 < 13 > ,8 3 11,3 R Ofloxacin 5 <12 >16 28,6 30,2 33,6 35,8 31,3 S Sulphamethoxazole 23 <10 > ,8 25, ,2 S Ticarcillin 10 < 16 >23 24,2 20,4 24,4 22,5 25,7 S/I Methicillin 5 < 9 > , ,4 17,2 S Ácido Nalidixic 30 < 13 > ,1 25,5 25,1 S Vancomycin 30 < 14 > ,6 24, ,1 S Ceftazidime 30 < 14 > 20 31,2 32,2 30, ,1 S Netilmycin 30 < 12 > 15 20,2 20,4 20,4 22,1 24,2 S Erythromycin 15 < 13 > 21 24,6 19,6 25,6 21,5 29,2 S Aztreonam 30 < 15 > ,9 26,9 27,3 30,6 S Cephalothin 30 < 14 > 18 23, ,8 3,6 24,2 S/R/ Ciprofloxacin 5 <15 >21 33,3 33, ,1 31,6 S Pefloxacin 5 <15 > ,2 28, ,2 S Sulphamethoxazole 23 <10 >16 29,9 25,9 26,1 25,8 26,3 S Cefaclor 30 <14 >20 20,6 6, ,8 S/R Polymyxin B 300 < 8 >12 17,6 14,4 18,2 16,8 18,1 S Cefepime 30 <14 >18 38,5 31,9 37,9 37,4 36,4 S Pennicillin G 10 < 19 >28 19,9 22,2 13,8 22,5 20 I/R Oxacillin 1 <10 >18 0 2,8 0 2,1 0 R Gentamicina 120 <6 >10 20,5 19,9 21, ,5 S Cefoxitin 30 <14 >18 27,6 26,6 28,2 30,6 31,2 S Clarithromycin 15 <13 > 18 24,9 30, ,2 24,8 S Clindamycin 2 <14 > 19 10,6 8,2 9,7 17,3 13,6 R/I Cefixime 5 <15 > ,2 20,2 23,8 18,4 R Lincomycin 2 <9 > R Nitrofurantoína 300 <14 > S Azithromycin 15 <13 >18 32,5 34,1 31,8 33,4 29,7 S/I Bacitracin 10 <8 >13 12,3 20,2 17,9 13,2 16,5 S Kanamycin 30 <13 >18 26,3 25, ,2 25 S Ampicillin 30 <14 >17 22,9 25, ,7 24,4 S Carbencillin 100 <13 > ,8 27,4 27,4 33,2 S

4 Streptomycin 100 <14 >18 20,5 21,4 18,3 19,7 17,2 S Tobramicina 10 <12 > ,5 17,5 19 S Forazolidona 20 < 10 > ,5 21,5 S Novobiocina 30 <17 > 22 9, ,5 R Netilmicina 30 <12 > ,5 19,5 30,5 S Ácido Pipemidico 2 <12 > S Sulfadiatrim 250 <12 > ,5 15 S/I Fosfomicina 200 <12 > ,5 0 R/I/S Cefotaxima 30 <14 >23 26, ,5 33,5 S Lovefloxacina 5 <13 > S/I Espiramicina 10 <12 > , S Cefadroxil 30 <14 > R/I Neomicina 30 <12 > , S/I Amoxilina 20 <19 > , S/R/I Nitrofurazona 15 <14 >17 18, S/R/I Levofloxacina 5 <13 > S/I Sulfazotrim 15 < 12 > ,5 30 S/I Kanamicina 30 <13 > , ,5 40 S Tianfenicol 30 <12 > 18 27, ,5 35 S Sulbactan + Ampicilina 10 < 11 > S Cefazolina 30 <14 > R Doxiciclina 30 <12 > ,5 S Cefodizima 15 <13 > S/I Estreptomicina 30 <15 >18 21, , S Trimetoprim 23 <10 > R Imipenem 10 <13 > ,5 S Sulfonamida 250 <12 > R Ticarcilina + Ác. 75 <14 >15 26, , S Clavulânico Cefetamet 10 <14 > R/I/S Tetraclina 30 <14 > S Ác.Clavulânico + Amoxilina 20 <13 >18 26, ,5 35 S Cefalexina 30 <14 > R Teicoplanina 30 <10 > R/I/S * R = Resistente; S = Sensível; I = Intermediário. Os resultados mostram que houve variação, quanto à sensibilidade aos antibióticos, entre os cinco isolados comparados. Houve casos de um isolado ser resistente (R), um intermediário (I) e outro sensível (S) ao mesmo antibiótico, como cephalotin, fosfomicina, nitrofurazona, cefetamet e teicoplanina. Também houve casos de alguns isolados serem sensíveis (S) e outros resistentes (R) ao mesmo antibiótico, como o caso de cefaclor e amoxilina. Também houve casos de isolados serem sensíveis (S) e outros intermediários (I) (ticarcilin) e intermediários (I) e resistentes (R) (cefadroxil pennicillin), demonstrando a variação que existe entre isolados quanto a esta característica. Há casos emblemáticos com a reação R dos isolados GO 471 e MS 392 ao antibiótico cefetamet (Tab. 1) (ausência de halo de inibição), enquanto isolado MT 400 foi sensível (S), com raio de halo de inibição de 25 mm. Mostrando ser esta uma evidência da existência de variabilidade entre os diferentes isolados. Havendo necessidade de investigar se há alguma razão para a existência de isolados resistentes em algumas regiões, como o uso deste antibiótico, ou de outros com mecanismo de ação semelhante, que possam estar selecionando linhagens bacterianas resistentes. Os cinco isolados de Xam foram resistentes aos antibióticos lincomycin, nitrofurantoina, cefazolina, tripetoprim, sulfonamida, cefalexina (não apresentaram halo de inibição), mupirocin, oxacelina e novobiocina (Tab. 1). Estes antibióticos têm potencial para serem utilizados em meios semi-seletivos, desde que apresentem outras características interessantes, como eficiência contra bactérias saprofíticas, normalmente associadas com sementes ou outras estruturas nas quais se pretende detectar e identificar Xam, acessibilidade no mercado nacional, preço compatível com o custo

5 das análises de rotina pretendidas, formulação adequada para serem incorporados aos meios de cultura, etc. Experimento 2 - A partir dos resultados obtidos no Experimento 1 (Tab. 1), foram escolhidos os antibióticos para este experimento (Tab. 2). Tabela 2 - Crescimento de cinco isolados de Xathomanas axonopodis pv. malvacearum em diferentes concentrações de alguns antibióticos designados eficientes pelo raio do halo de inibição. ISOLADOS ANTIBIÓTICO CONC. (mg/l) MT 400 GO 471 MS 392 PR 430 SP (*) Nitrofurantoína ± ± ± ± 5* Lincomicina 15* * + + ± + + 5* ± + ± + ± 10* ± ± ± Oxacelina 15* + ± ± ± ± 20* ± * - - ± - 50* - - ± * * Cefalexina 15* * Cefadroxil 15* * ± + ± + + (+) crescimento, ( ± ) interferência negativa no crescimento, ( - ) ausência de crescimento; Só foram incluídos neste experimento antibióticos com possibilidades práticas de serem utilizados em meios semi-seletivos. Assim, produtos como cefazolina, tripetoprim, sulfonamida, mupirocin e novobiocina foram excluidos por apresentarem uma ou mais limitações; foi incluído o

6 antibiótico cefadroxil, apesar de ser intermediário contra os isolados MT 400 e SP397, por suas características interessantes. Observa-se que cefalexina permitiu o crescimento de Xam em todas as concentrações avaliadas (5 a 100 mg/l ou ppm), sendo, portanto, potencial antibiótico para ser adicionado aos meios semi-seletivos. Lincomicina promoveu interferência negativa no crescimento de apenas um isolado (GO471) e cefadroxil de apenas dois isolados (MT 400 e GO 471), na concentração de 100 ppm; quatro isolados apresentaram crescimento negativo quando submetidos a nitrofurantoina na concentração de 100 ppm. Oxcelina mostrou efeito inibidor do crescimento de Xam a partir de 5 ppm, chegando a inibir completamente o crescimento de todos os isolados de Xam na concentração de 100 ppm; portanto este antibiótico não tem potencial para ser utilizado no desenvolvimento de meio-seletivo para detecção e identificação de Xam. Os resultados apresentados na Tabela 1 também mostram que diversos antibióticos têm potencial para serem empregados no controle químico de Xam; dos 67 antibióticos avalidos, 40 foram eficientes contra os cinco isolados do patógeno. A Tabela 2 mostra que oxacelina também foi eficiente. Para se selecionar antibióticos altamente eficiente contra Xam, com potencial de serem utilizados no controle do patógeno, há necessidade de se realizar um experimento semelhante ao 2, com os 40 antibióticos que induziram reações de sensibilidade (S) aos cinco isolados de Xam, preferencialmente aqueles que produziram os maiores halos de inibição. Aqueles que forem eficientes nas menores concentrações, restringindo ou impedindo o crescimento de bactéria, deverão ser submetidos a outras avaliações, como fitotoxicidade e toxicidade ao homem e aos animais, além dos ensaios ecotoxicológicos que permitam verificar a viabilidade prática de sua utilização como produtos fitossanitários. CONCLUSÕES 1. Xanthomonas axonopodis pv malvacearum (Xam) apresenta ampla variação quanto à sensibilidade a antibióticos; 2. Diferentes isolados de Xam podem apresentar reações de sensibilidade distintas frente a diversos antibióticos; 3. Existem antibióticos que, em diversas concentrações, não interferem no crescimento dos cinco isolados de Xam em meio de cultura, podendo ser recomendados para o desenvolvimento de meios semi-seletivos, como cefalexina; 4. Existem muitos antibióticos altamente eficientes contra os cinco isolados de Xam, que devem ser mais estudados para uso como alternativa de controle químico da doença.

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