O SERVIÇO DE HEMOTERAPIA (BANCO DE SANGUE)
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- Martín Aragão Oliveira
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1 Triagem Sorológica -Controle de Qualidade CBM - Araras, novembro, 2014 Amadeo Sáez-Alquezar O SERVIÇO DE HEMOTERAPIA (BANCO DE SANGUE) Corresponde a um sistema onde se realizam processos de alta complexidade. Desde a seleção de doadores, até o uso de um hemo-componente no ato da transfusão. 1
2 Voluntários altruístas não remunerados Voluntários de reposição Doadores Remunerados CQE ecqi TRIAGEM SOROLÓGICA NAT Banco de Sangue - Setores CQI Candidato a doador Triagem clínica APTO Extração do sangue Fracionamento * Quarentena CQI INAPTO SAIDA CQE ecqi TESTES IMUNOHEMATO DESCARTE NÃO HEMOCOMPONENTES LIBERADOS PRODUÇÃO HEMODERIVADOS SIM ARMAZENAR CQI TRANSFUSÃO DOAÇÃO DE SANGUE CANDIDATO A DOADOR RECEPÇÃO / CADASTRO TRIAGEM CLÍNICA E HEMATOLÓGICA COLETA DO SANGUE PROCESSAMENTO / FRACIONAMENTO ANÁLISE DO SANGUE LABORATÓRIO DE IMUNOHEMATOLOGIA LABORATÓRIO DE SOROLOGIA E NAT 2
3 PROCEDIMENTOS PARA ASSEGURAR A QUALIDADE Sistema de Gestão da Qualidade Boas Práticas no laboratório Controle de qualidade Certificações Acreditações CONTROLE DE QUALIDADE EM SOROLOGIA Controle de Qualidade Interno Soros Controle Interno (baixa reatividade) Soros controle de 3ª opinião Avaliação de kits Antes do Uso Lote a lote Controle de Qualidade Externo Programas de Avaliação Externa da Qualidade PEECS 3
4 Sistema de Garantia da Qualidade Doador Pré-Analítica Analítica Pós-Analítica Resultado Controle de Qualidade Interno Controle de Qualidade Externo Triagem Sorológica Temas relacionados Normas nacionais / Internacionais Seleção de doadores Estratégias de triagem Características dos testes sorológicos Algoritmos de confirmação Testes de biologia molecular Procedimentos de controle de qualidade 4
5 TRIAGEM EM DOADORES DE SANGUE Características dos testes sorológicos para triagem em doadores de sangue Os testes usados na triagem sorológica de doadores de sangue são Qualitativos. Detectam se o parâmetro (Ac ou Ag) investigado está presente ou ausente Cada Teste tem seu valor de corte (cutoff) O índice: valor de leitura / Cutoff, define se a amostra é reagente ou não-reagente. A maioria dos laboratórios adota a zona cinza que corresponde a uma % ao redor do valor de corte, onde os resultados são considerados indeterminados 5
6 VALORES DE CORTE PARA OS TESTES SOROLÓGICOS Testes para o Diagnóstico de Doenças Infecciosas Transmissíveis por Transfusão SÉCULO XX Antes dos anos 90 Testes pouco sensíveis e pouco específicos Anti-HIVde 1ª e 2ª geração Ag HBs com baixa especificidade Anti-HBc como marcador indireto para HNANB Muitos testes in house Principalmente para Chagas Muitos testes com leitura visual (subjetiva) HAI, RFC, IFI Poucos laboratórios fazendo testes ELISA A maioria dos procedimentos manuais 6
7 Testes para o Diagnóstico de Doenças Infecciosas Transmissíveis por Transfusão SÉCULO XX Anos 90 Melhoria da sensibilidade e especificidade dos testes e detecção de novos parâmetros Anti-HIV(3ª G) Anti-HCV(1ª G, 2ª G, 3ª G) Anti-HTLV(1ª G, 2ª G) A maioria dos laboratórios fazendo Imunoensaios (ELISA, MEIA, ELFA..) Inicio dos equipamentos automatizados para grandes rotinas La maioria dos testes: kits comerciais Testes para o Diagnóstico de Doenças Infecciosas Transmissíveis por Transfusão SÉCULO XXI Inicio Predominam os imuno ensaios (ELISA) Equipamentos automatizados para atender às grandes rotinas Os testes in house pouco recomendados Se recomenda o uso de testes NAT em paralelo com a triagem sorológica Se recomenda a adoção de procedimentos de controle de qualidade interno e externo 7
8 Testes para o Diagnóstico de Doenças Infecciosas Transmissíveis por Transfusão CENARIO ATUAL Principais alternativas: ELISA (Enzyme linked immunossorbent assay) CLIA (Quimioluminiscência) Equipamentos automatizados Rotinas grandes ou medias Pontos de interesse: Diminuição do período de janela imunológica Testes NAT em paralelo com a triagem sorológica Confirmação dos resultados dos testes sorológicos Gestão da Qualidade e Controle de Qualidade Fatores que fazem a diferença Características dos testes sorológicos Sensibilidade / Especificidade Desenho dos Kits diagnósticos Período de janela mais curto Testes de 4ª G (Ag/Ac) e NAT em paralelo Desempenho das plataformas com testes ELISA e CLIA Aplicação em rotinas medias Aplicação em rotinas grandes Tempo de reação Facilidade e robustez dos equipamentos 8
9 Conjunto de fatores que representam a performance Testes Sorológicos Características e Desempenho Plataformas ELISA/CLIA Aplicação e Desempenho ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay ou Ensaio Imunoenzimático Desenvolvido inicialmente por Engwall& Perlmanna Suécia e por Weemen& Schuurse na Holanda. Um dos reagentes (Ag ou Ac) está imobilizado numa fase sólida, em quanto o outro pode estar ligado a uma enzima, preservando-se a atividade enzimática e a atividade imunológica do anticorpo ou do antígeno. Detecta quantidades extremamente baixas de antígenos ou de anticorpos com elevada precisão. Engvall E, Perlman P (1971). "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G". Immunochemistry 8 (9):
10 Testes ELISA Plataformas ELISA 10
11 Quimiluminescência CLIA Produção de luz por uma reação química (*) Reação de óxido-redução Derivados do isoluminol(h 2 O 2 + catalizador) 1976 Ésteres de acridina(naoh+ H 2 O 2 ) 1978 H 2 O 2 agente oxidante NaOHaltera o ph para que ocorra a reação de oxidação (*): A partir de um estímulo elétrico = Eletro Quimioliminescência(eCLIA) Plataformas CLIA 11
12 CLIA -ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Assay BIO-FLASH Chagas 12
13 ELISA x CLIA ELISA CLIA Suporte Microplaca Partícula magnética Possibilidades Sensibilidade Especificidade Semelhante Semelhante Acesso aleatorio Velocidade Opções Pequeno porte Grande porte Pequeno porte Grande porte Equipamentos Abertos / Fechados Fechados Tendência nos próximos anos Diminuição, principalmente en grandes rotinas Aumentar 13
14 Fatores que fazem a diferença Características dos testes sorológicos Sensibilidade / Especificidade Características dos Kits diagnósticos Período de janela mais curto Testes de 4ª G (Ag/Ac) e NAT em paralelo Desempenho das plataformas com Testes ELISA e CLIA Aplicação em rotinas medias Aplicação em rotinas grandes Tempo de reação Equipamentos robustos e fáceis de usar DESEMPENHO 14
15 Painéis de Soros para Procedimentos de Controle de Qualidade Soros Controle Interno (SCI) Baixa Reatividade (DO/CO: 2,0 4,5) Painéis de Performance Avaliação lote a lote Painéis ou Multipainéis Para uso na Avaliação Externa Padrões de Referência WHO Amostras Positivas e Negativas muito bem caracterizadas AVALIAÇÃO EXTERNA (PAEQS) 15
16 Programas de Avaliação Externa da Qualidade em Sorologia (PAEQS) Os testes de Triagem Sorológica são QUALITATIVOS Possíveis falhas nos procedimentos internos dos Laboratórios Participantes poderão dar origem a: Resultados Falsos Reagentes Resultados Falsos Não-Reagentes Caracterização das amostras que serão usadas nos PAEQS Deve levar em consideração: As estratégias de triagem usadas na região As características dos testes utilizados pelos Laboratórios Participantes O uso de testes complementares para assegurar a reatividade das amostras positivas 16
17 Caracterização das amostras Exemplo 1: anti-hiv diferentes testes ELISA 17
18 Caracterização das amostras Amostras Ag HBs Anti-HBc Anti-HBs Ag HBs(+) Anti-HBc(+) Exemplo 2 Ag HBs Anti-HBc 18
19 Caracterização das amostras Exemplo 3 Chagas 19
20 Caracterização das amostras AGENTE TESTES CARACTERISTICAS Nº (mínimo) HIV ELISA - CLIA Anti-HIV 1+2+ O Ag / Ac HTLV ELISA - CLIA Anti-HTLV1+2 (3ª/4ªG) 2 HBV HCV SÍFILIS T.cruzi ELISA - CLIA ELISA - CLIA VDRL / RPR TPHA ELISA ELISA CLIA HAI Ag HBs Anti- HBc Anti-HCV Ag/ Ac Não treponêmico Treponêmico Treponêmico Rec/ Lys Testes complementares para a caracterização das amostras reagentes AGENTE HIV HTLV HBV HCV T.pallidum T.cruzi CONFIRMATÓRIO WB / IB WB / IB Neutralização IB WB TESA blot 20
21 Critério de Avaliação para os Laboratórios Participantes dos PAEQs(por parâmetro) B Resultados Corretos Sem RFR nem RFNR I* Resultados Falsos Reagentes I** I** Resultados Falsos Não Reagentes I: Insatisfatório Problemas detectados durante o desenvolvimento dos PAEQS Contaminação das amostras (pré-analítica) Erros na transcrição de resultados(analítica y pós-analítica) Falhas de sensibilidade ou especificidade dos testes utilizados (pré-analítica e analítica) Procedimentos inadequados do CQI (analítica) Conservação inadequada das amostras (analítica e pré-analítica) 21
22 Programas de Avaliação Externa da Qualidade em Sorologia (PEECS) RESPONSABILIDADES CENTRO ORGANIZADOR LABORATÓRIOS PARTICIPANTES 22
23 PCQES - Conteúdo do Relatório Final Caracterização do Multipainel (IMPORTANTE) Estratégias usadas pelos LPs Resultados Falsos reagentes Falsos Não Reagentes Número, % e distribuição por metodologia, por parâmetro e por marca comercial dos kits usados. Desenvolvimento dos PCQES - Recomendações Evitar o uso de papel entre o Centro Organizador e os laboratórios Participantes Intercambio de informações pelo site Relatório Final (PDF) à disposição no site Consultas ao Centro Organizador Telefone 23
24 Frequência de Erros durante o processo analítico Paciente Pré-Analítica Analítica Pós-Analítica Resultado Frequência de Erros observados durante o processo analítico Mais de 80% dos problemas são gerados antes e após a fase analítica, mas existem evidências científicas que indicam que os erros analíticos são causa importante de problemas que originam riscos e danos para os pacientes (*) Mesmo que os erros analíticos sejam menos frequentes devemos destacar que podem ser considerados os mais transcendentais porque acabam sendo a causa de mais de 50% dos erros na atenção dos médicos para os pacientes, doadores de sangue e receptores de transfusão 24
25 Garantia da Qualidade AVALIAÇÃO DA QUALIDADE 25
26 AVALIAÇÃO EXTERNA DA QUALIDADE Multipainel para PCCES - Painel Cego 26
27 DESENVOLVIMENTO DE PEECS NA AMÉRICA LATINA E NO CARIBE Evolução dos PAEQS I II Iniciamos o desenvolvimento dos Programas de Avaliação Externa para sorologia porque não existia nenhum procedimento semelhante que pudesse atender às necessidades dos Bancos de sangue no Brasil e na AL. Inicialmente os programas foram desenvolvidos no Brasil junto ao Ministério da Saúde e também junto à Organização Pan-americana americana da Saúde (OPAS) para Laboratórios de Referência em todos os países da América Latina. 27
28 Evolução dos PAEQS III Nos programas iniciais eram enviadas 24 amostras de soro duas vezes por ano.. Em cada envio os laboratórios participantes processavam as amostras e enviavam os resultados para o CO, que fazia uma avaliação do desempenho. IV No Brasil passamos a enviar 24 amostras de soro três vezes por ano RFR e RFNR (%) Referentes à triagem Sorológica, nos PAEQS desenvolvidos para Bancos de Sangue no Brasil* ( ) Amostras positivas RFNR (N) RFNR (%) Amostras negativas RFR (N) RFR (%) HIV , ,61 HTLV , ,19 AgHBs , ,68 Anti-HBc , ,17 HCV , ,55 T.cruzi , ,22 Sífilis , ,25 28
29 Evolução dos PAEQS 2010 A partir de 2010, pelo PNCQ passamos a enviar 20 amostras a cada três meses (4 vezes por ano) 2011 A partir de 2011 passamos a enviar 18 amostras liofilizadas numeradas de 1 a 18,, a cada três meses. Evolução dos PAEQS Atualmente Os laboratórios processam 6 amostras por mês e enviam os resultados para avaliação pelo site do PNCQ Dessa forma conseguimos que os laboratórios de sorologia em bancos de sangue pudessem ter uma Avaliação Externa do desempenho todos os meses. 29
30 PAEQS para a Triagem Sorológica Amostras para o Controle de Qualidade Externo Liofilizadas 30
31 Avaliação mensal On Line PNCQ Brasil
32 RFR e RFNR observados em 29 PEEC (PNCQ) com avaliação mensal em Serviços de Hemoterapia do Brasil (Maio/2011 até Setembro/2013)) PAEQS para Chagas usando amostras de soro liofilizadas Para países não-endêmicos em colaboração com a OMS Espanha (1) Itália (2)... Até36 32
33 Desenvolvido na Costa Rica - PNCQ 17 Bancos de Sangue ( ) Considerações sobre os PAEQS Documentar e investigar as causas das não conformidades: RFR e/ou RFNR Revisão de todas as etapas do processo Participação de toda a equipe do LP Aplicar as ferramentas da qualidade Documentar as causas encontradas Adotar medidas corretivas preventivas Melhor quando a frequência é mensal 33
34 CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Controle de Qualidade Interno Rodada analítica De acordo com o Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) a Corrida Analítica é o intervalo de tempo em que se realiza uma serie de medições de maneira estável em termos de precisão e exatidão Podem ocorrer efeitos adversos que deverão ser detectados de forma adequada O número, a frequência e os níveis dos controles depende do número e da magnitude da Corrida Analítica Fluxo continuo ou lotes Testes manuais ou automatizados 34
35 Controle de Qualidade Interno A validação do Programa Interno de Controle de Qualidade é responsabilidade do laboratório Critérios de Aceitação É importante que cada Laboratório estabeleça Critérios Mínimos de Aceitação e os incorpore em seu Sistema de Gestão da Qualidade. Soros Controle Interno (SCI) de baixa reatividade para monitorar as corridas diárias no laboratório DO: densidade ótica ou valor de leitura URL em CLIA 35
36 Soros Controle Interno (SCI) Soros Controle Interno (SCI) 36
37 SCI - Soros Liofilizados PNCQ A PARTIR DE 2015 Preparo de amostras individuais para cada parâmetro Aplicação dos SCI na Rotina Diária 37
38 1ª Etapa Verificação Inicial SCI Ajustes por diluição A diluição é obrigatória para ajustar os SCI. As variações de reatividade que se observam com diferentes testes obriga à diluição. Quando se prepara um SCI para uma metodologia específica, mesmo assim poderão ocorrer variações nas trocas de lotes dos reagentes 38
39 Diluições recomendadas para preparar SCI individuais Parâmetros Diluições Anti-HIV 1/10-1/10 2 até 1/10 8 Anti-HTLV 1/10 1/20 1/50 1/100-1/200 Ag HBs 1/10-1/10 2 até 1/10 8 Anti-HBc (core) 1/2 1/5-1/10 até 1/100 Anti-HCV 1/10 1/50 1/100 1/200 Chagas 1/2 1/5 1/10 1/20 Sífilis (ELISA) 1/5 1/10 1/20 1/50 até 1/500 Sífilis (VDRL/RPR) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Amostra de Soro anti-hiv positivo Diluições com diferentes Kits Amostra ELISA 1 ELISA 2 ELISA 3 WB Dil: 1/... DO/CO DO/CO DO/CO Resultado 1 >12,8 >23,5 19, >12,8 23,2 18, >12,8 22,7 8, >12,8 20,2 0, >12,8 13,3 0, >12,8 8,0 0, ,9 3,1 0, ,2 1,4 0, ,5 0,8 0,0 CQE CQI 39
40 2ª Etapa Aplicação do SCI Distribuição Normal 40
41 Calibração do SCI Exclusão de valores extremos (outliers outliers) 41
42 Calibração do SCI Calibração do SCI 42
43 3ª Etapa - Gráfico de Levey-Jennings Serve para reportar os valores sucessivos do controle. Limites de decisão : ± 1 DP, ± 2 DP y ± 3 DP Gráfico de Levey-Jennings SCI positivo 43
44 Gráfico de Levey-Jennings SCI positivo y negativo SCI Conservação das alíquotas Conservação em alíquotas para uso diário Conservação: -20º C Alíquotas para uso semanal no são recomendadas Cuidados especiais com SCI Ag HBs+ 44
45 Uso diário do SCI Uso diário do SCI 45
46 Uso diário do SCI 46
47 Uso diário do SCI Regras de Westgard 47
48 Aplicação do SCI 4ª Etapa -Regras e Análise dos resultados 48
49 AÇÕES Soros Controle de 3ª opinião 49
50 Considerações sobre o uso dos SCI Controle de Qualidade Considerações Finais 50
51 Avaliação de Kits Antes do uso e Controle Lote a Lote Painel de soros com 20 amostras* Amostras Positivas N = 7 Amostras Negativas N = 4 Amostras Heterólogas N = 9 Todas as amostras são analisadas para todos os testes usados na triagem sorológica de doadores de sangue + anti-hbs. Testes confirmatórios são realizados nas amostras positivas (*): PAINEL DE PERFORMANCE - PNCQ Painel de Performance AgHBs-PNCQ AgHBs A-HBs Anti-HBc ELISA Neutr. ELISA ELISA Muestras BMérieux Murex Dade B DiaSorin BMerieux BMerieux BMerieux Murex Dade 1 >50 >30 >50 >50 (+) 0,6 0 0,1 0 2 >50 >30 >50 >50 (+) 0,5 0 0, ,3 22,1 35,6 15,1 (+) 0,3 0,1 0,1 0,1 4 44,3 >30 >50 >50 (+) 0,4 0,3 0,2 0,5 5 26,3 >30 >50 39,1 (+) 0,3 0,8 0,1 0,5 6 44,2 >30 >50 >50 (+) 0,4 0 0, ,9 13,3 29,5 10,7 (+) 0,3 0 0, Neg Neg Neg Neg Negativas Neg Neg Neg Neg Sífilis Neg Neg Neg Neg Chagas Neg Neg Neg Neg HCV Neg Neg Neg Neg HIV 20 Neg Neg Neg Neg HTLV 51
52 Painel de Performance: Anti-HIV - PNCQ anti-hiv ELISA Muestras BMérieux1+2+"O" Bmérieux AgAc Wiener Murex AgAc 1 22,9 17,3 11,3 10,7 2 21,8 18,3 5,2 11,9 3 17,1 24,2 13,5 9,7 4 > 23,7 18,6 12, > 23,7 21,5 10,3 11,6 6 > 23, ,4 13,8 7 > 23,7 21,3 11, ,4 0,3 0,6 0,4 9 0,4 0,3 0,4 0,4 10 0,3 0,3 0,3 0,4 11 0,3 0,5 0,4 0,3 12 0,4 0,3 0,3 0,3 13 0,6 0,3 0,3 0,4 14 0,5 0,3 0,4 0,3 15 0,6 0,3 0,3 0,3 16 0,6 0,3 0,4 0,3 17 0,6 0,3 0,3 0,3 18 0,4 0,3 0,6 0,3 19 0,5 0,4 0,3 0,4 WB Genelabs Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Sífilis Chagas HCV HTLV HBs Ag Avaliação lote a lote (Arquivo) Marca: Data: Lote nº : Amostras DO CO Lote # 0001 Avaliação Lote a Lote - Anti-HCV KIT: DO/CO DO CO DO/CO Lote # 0002 DO CO Lote # 0003 DO/CO 52
53 PNCQ Programa Nacional de Controle de Qualidade Sociedade Brasileira de Análises Clínicas Muito Obrigado Perguntas? 53
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