HIDRÓLISE PROTEICA DE TILÁPIA DO NILO

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1 HIDRÓLISE PROTEICA DE TILÁPIA DO NILO O.L.G.S Nunes 1, A. Signor 2, M.L. Fiorese 3, J.K. Finkler 4, T.E. Savoldi 5, C.A. Fonseca 6 1- Grupo de Estudos de Manejo na Aquicultura Universidade Estadual do Oeste do Paraná Campus de Toledo CEP: Toledo PR Brasil, Telefone: 14 (45) (ortencianunes@yahoo.com.br) 2- Grupo de Estudos de Manejo na Aquicultura Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de Toledo CEP: Toledo PR Brasil, Telefone: 14 (45) Engenharia Química - Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de Toledo CEP: Toledo PR Brasil, Telefone: 14 (45) Grupo de Estudos de Manejo na Aquicultura Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de Toledo CEP: Toledo PR Brasil, Telefone: 14 (45) Engenharia Química - Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de Toledo CEP: Toledo PR Brasil, Telefone: 14 (45) Química - Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de Toledo CEP: Toledo PR Brasil, Telefone: 14 (45) RESUMO o estudo teve por objetivo avaliar condições de ph, temperatura e concentração da enzima Alcalase na hidrólise de corte em V, resultante do processamento de tilápia do Nilo. Foi estabelecido um planejamento experimental fatorial 2 3 com duplicata no ponto central, considerando os valores de ph 7,5, 8,5 e 9,5, temperatura 55, 65 e 75 C e concentração enzima-substrato (ES) (0,05, 0,15 e 0,25% (p.p -1 )). Amostras foram retiradas nos intervalos de 30 e 60 minutos de hidrólise e avaliadas quanto à proteína solúvel. Os resultados mostraram que apenas o fator ph teve influência significativa no teor de proteína solúvel dos hidrolisados, porém, de modo negativo, ou seja, valores de ph mais baixos promovem uma hidrólise melhor. ABSTRACT the study aimed to evaluate conditions of ph, temperature and concentration of Alcalase enzyme in court "V" hydrolysis, resulting from Nile tilapia processing. A factorial experimental design 2 3 with duplicate in the center point has been established, considering the ph values 7.5, 8.5 and 9.5, temperature 55, 65 and 75 C and concentration of enzyme-substrate (ES) (0.05, 0.15 to 0.25% (w.w -1 )). Samples were taken at 30 and 60 minutes of hydrolysis and assessed for soluble protein. The results showed that only the ph factor had a significant influence on the amount of soluble protein hydrolysates however negatively, lower ph values promote better hydrolysis. PALAVRAS-CHAVE: hidrolisado; pescado; proteína solúvel. KEYWORDS: hydrolysate; fish; soluble protein. 1. INTRODUÇÃO O pescado se apresenta como um alimento importante pois constitui-se como fonte de nutrientes indispensáveis, alimento que reduz o risco de doenças crônicas e nutriente que serve de base para a formulação de alimentos funcionais (MENEGASSI, 2011). A indústria pesqueira gera um volume de resíduos superior a 60%, em média, o que torna um sério problema ambiental. Durante a filetagem da tilápia, em torno de 67% são subprodutos como vísceras, cabeça, ossos, pele, aparas e escamas que, normalmente, são destinados à produção de ração

2 animal, farinha de peixe, adubos ou descartados sem utilização e considerados uma importante fonte de minerais, proteínas e gordura (BOSCOLO e FEIDEN, 2007). O desenvolvimento de tecnologias de processamento como a hidrólise enzimática, é uma das melhores alternativas para transformar esses descartes em valor de negócio. Várias enzimas são usadas para hidrolisar as proteínas de pescado e podem ser de origem vegetal, animal ou microbiana. Destacam-se papaína, bromelina pepsina, tripsina, proteases do peixe, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase e Protamex (BATISTA, 2011). A hidrólise provoca alterações nas propriedades das proteínas como diminuição do peso molecular, aumento do número de grupos ionizáveis e aumento da exposição de grupos hidrofóbicos (HE et al, 2013). O produto obtido consiste em peptídeos de diferentes tamanhos e aminoácidos livres (KRISTINSSON e RASCO, 2000). Apresenta vantagens como solubilidade, capacidade emulsionante com o óleo e dispersibilidade, quando comparado à proteína intacta, propriedades importantes para formulações alimentícias (HE et al, 2013). O processo enzimático é brando, seletivo aos substratos e possibilita o controle das condições como temperatura e ph (GUADIX et al., 2000). A produção dos hidrolisados proteicos vem aumentando nos últimos anos com a seu uso em meio de cultura bacteriano, ração para crescimento de peixes, formulação de hambúrgueres, massas, produção de flavour de pescado, suplemento nutricional em bebidas, preparação de sopas e molhos e alimentos específicos para crianças, adolescentes e idosos (BATISTA, 2011). É uma alternativa interessante para o aproveitamento dos coprodutos, com produção de moléculas de alto valor biológico e solução para o problema dos resíduos gerados. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Matéria-prima A matéria-prima utilizada para a hidrólise foi aparas ou cortes em V, originários do processo de filetagem da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), obtidos em um frigorífico do município de Toledo/PR. O material fresco foi moído e armazenado em embalagens próprias para alimentos a -18 C até o momento do preparo dos hidrolisados. 2.2 Hidrólise Enzimática A hidrólise foi realizada empregando-se a enzima endopeptidase Alcalase 2.4 L FG EC ( ) (Bacillus licheniformis), gentilmente cedida pela empresa Novozymes Latin America Ltda. A hidrólise foi conduzida em reator experimental de vidro borossilicato, encamisado com banho termostático acoplado e controle online dos parâmetros: ph, agitação e temperatura. Amostras foram coletadas nos intervalos de 30 e 60 minutos de hidrólise. Em seguida, fez-se a inativação da enzima em temperatura de 90 o C durante 20 minutos. Os produtos da hidrólise foram acondicionados em recipientes e estocados em freezer para posterior avaliação de proteína solúvel. 2.3 Planejamento Experimental Para a realização dos ensaios foi utilizado um planejamento experimental fatorial 2 3 com duplicata no ponto central cujas variáveis foram ph, temperatura ( C) e concentração enzimasubstrato (ES) (0,05, 0,15 e 0,25% (p.p -1 )). Os valores reais e codificados são apresentados na Tabela 1.

3 Tabela 1 - Níveis reais e codificados das variáveis estudadas no planejamento fatorial 2³. Variáveis Níveis ph 7,5 8,5 9,5 Temperatura ( C) Concentração enzima-substrato (%) 0,05 0,15 0, Determinação da Concentração de Proteína Solúvel A concentração de proteína solúvel foi avaliada pelo método de Lowry et al. (1951) que utiliza a albumina de soro bovino (BSA) como padrão. A porcentagem de proteína solúvel (g/100 ml) foi calculada a partir da densidade ótica em espectrofotômetro em 660 nm. 2.5 Análise Estatística do Planejamento Experimental A metodologia de superfície de resposta, e a análise de variância (ANOVA) foram utilizadas para avaliar os resultados obtidos pelo planejamento estatístico fracionado 2 3, a partir do software STATISTICA TM, versão 7.0 (Statsoft, Inc.). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Tabela 2 apresenta os resultados de porcentagem de proteína solúvel obtidas para as diferentes condições de hidrólise avaliadas nos tempos de 30 e 60 minutos. Tabela 2 - Porcentagem de proteína solúvel após 30 e 60 minutos de hidrólise com enzima Alcalase Ensaio ph Temperatura ( C) Concentração enzima-substrato (%) (p.p -1 ) Proteína solúvel (%) 30 min Proteína solúvel (%) 60 min 1 7,5 55 0,05 5,55 5,55 2 7,5 55 0,25 1,72 2,19 3 7,5 75 0,05 3,75 3,54 4 7,5 75 0,25 4,17 3,96 5 9,5 55 0,05 2,80 2,70 6 9,5 55 0,25 2,73 2,57 7 9,5 75 0,05 2,93 2,27 8 9,5 75 0,25 2,93 2,97 9 8,5 65 0,15 3,90 3, ,5 65 0,15 3,93 4,25 No ensaio 1, onde se tem as condições mais brandas de ph e temperatura e a menor concentração enzimática, os valores de proteína solúvel foram os maiores e iguais para os dois intervalos de tempo avaliados. Esse resultado é favorável em processos industriais onde, o consumo de energia e a finalidade de aplicação do produto, definem a melhor forma de condução do processo. Portanto, hidrolisados proteicos aplicados como ingredientes devem preservar as características dos alimentos, não desnaturando o seu conteúdo.

4 As Tabelas 3 e 4 apresentam a análise de variância (ANOVA) para 30 e 60 minutos de hidrólise e a estimativa dos efeitos principais e de interação das variáveis utilizadas no planejamento experimental fracionado 2 3. A Figura 1(a) e (b) apresenta os Gráficos de Pareto para os mesmos tempos de hidrólise avaliados. Tabela 3 - Análise de variância para o planejamento fatorial completo 2 3 com 30 minutos de hidrólise. SQ GL QM F p-valor (1) Enzima 0, , , , (2) Temp 0, , , , (3) ph 2, , , , Error 2, , Total SQ 5, R 2 = 53,76% Tabela 4 - Análise de variância para o planejamento fatorial completo 2 3 com 60 minutos de hidrólise. SQ GL QM F p-valor (1) Enzima 1, , , , (2) Temp 2, , , , (3) ph 10, , , , Error 4, ,71504 Total SS 16, R 2 = 73,32% Figura 1 - Gráficos de Pareto obtidos para 30 minutos de hidrólise (a) e para 60 minutos de hidrólise (b). Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: prot30 3 factors at two levels; MS Residual=, DV: prot30 Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: prot60 3 factors at two levels; MS Residual=, DV: prot60 (3)ph -2,5166 (3)ph -3,84152 (1)enzima -, (2)temp -1,82795 (2)temp -, (1)enzima 1, p=,05 p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) (a) Standardized Effect Estimate (Absolute Value) (b) Verifica-se nas Tabelas 3 e 4 e Figura 1 (a) e (b) que a variável ph é a única que influencia, e de forma negativa, na hidrólise dos cortes em V de tilápia do Nilo, em ambos os tempos avaliados (30 e 60 min.), indicando que valores menores, como ph 7,5 proporcionaram resultados melhores de hidrólise. As Figuras 2 e 3 (a), (b) e (c) apresentam as superfícies de resposta geradas a partir da análise estatística dos resultados para a proteína solúvel. Analisando as Figuras, verifica-se que apesar da temperatura não ter apresentado influência significativa dentro das faixas avaliadas, é possível perceber que a temperatura assim, como o ph tem influência negativa, e portanto, menores valores de

5 temperatura promovem maior concentração de proteína solúvel. Em relação à concentração de enzima, a informação diverge para os diferentes tempos avaliados. Diante disso, constata-se a necessidade de um estudo mais aprofundado, com novas faixas a serem testadas, para verificar a influência desses parâmetros no tempo de hidrólise e obtenção de hidrolisados proteicos. Figura 2 - Superfícies de resposta: (a) Temperatura x Conc. enzima; (b) ph x Temperatura e (c) Conc. enzima x ph para o planejamento experimental com 30 minutos de hidrólise. (a) (b) (c) Figura 3 - Superfícies de resposta: (a) Temperatura x Conc. enzima; (b) ph x Conc. enzima; (c) Temperatura x ph; para o planejamento experimental com 60 minutos de hidrólise. (a) (b)

6 (c) 4. CONCLUSÕES Avaliando os resultados, conclui-se que, condições brandas de ph e Temperatura de hidrólise de corte em V de tilápia do Nilo, com destaque ao ph próximo da neutralidade, promoveram maior teor proteico de hidrolisado com enzima Alcalase. Em relação ao tempo de hidrólise, não houve diferença entre os intervalos avaliados para a melhor condição obtida, entretanto, em termos de aplicação em um processo industrial, 30 minutos favorece sua utilização, pois promove um menor consumo de energia, e uma produtividade mais rápida e elevada. 5. AGRADECIMENTOS À CAPES pela concessão da bolsa de pós-doutorado à primeira autora. Às empresas Tilápia Brazilian Fischeries Pescados e Peixes pelo fornecimento da matéria-prima e à Novozymes pelo fornecimento da enzima Alcalase. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Batista I. (2011). Hidrolisados proteicos de pescado. Ed. Alex Augusto Gonçalves. In Tecnologia do Pescado. Ciência, Tecnologia, Inovação e Legislação. Editora Atheneu, São Paulo, Brasil, p Boscolo, W.R. & Feiden, A. (2007). Industrialização de tilápias. Toledo: GFM Gráfica & Editora. 117p. Guadix, A.; Guadix, E.M.; Páez-Dueñas, M.P.; González-Tello, P.; Camacho, F. (2000). Procesos tecnológicos y métodos de controle la hidrólisis de proteínas. Archivos Pharmaceutica. v. 41, p He, S.; Franco, C.; zhang, W. (2013). Functions, applications and production of protein hydrolysates from fish processing co-products (FPCP). Food Research International Kristinsson, H.G.; & Rasco, B.A. (2000). Biochemical and Functional Properties of Atlantic Salmon (Salmo salar) Muscle Proteins Hydrolyzed with Various Alkaline Proteases. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 48, p Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J.; J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagente. Biol. Chem. 193, p Menegassi, M. (2011). Aspectos nutricionais do pescado. Ed. Alex Augusto Gonçalves. In Tecnologia do Pescado. Ciência, Tecnologia, Inovação e Legislação. Editora Atheneu, São Paulo, Brasil, p