DÉBORA CATTARUZZI RODINI

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1 DÉBORA CATTARUZZI RODINI Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi) São Paulo 2008

2 DÉBORA CATTARUZZI RODINI Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi) Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária Departamento: Reprodução Animal Área de concentração: Reprodução Animal Orientador: Prof. Dr. Cláudio Alvarenga de Oliveira São Paulo 2008

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5 FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome do autor: RODINI, Débora Cattaruzzi Título: Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi) Data: / / Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária Banca Examinadora Prof. Dr. Assinatura: Instituição: Julgamento: Prof. Dr. Assinatura: Instituição: Julgamento: Prof. Dr. Assinatura: Instituição: Julgamento: Prof. Dr. Assinatura: Instituição: Julgamento: Prof. Dr. Assinatura: Instituição: Julgamento:

6 À minha família maravilhosa! Minha mãe Zélia, meu pai Valdir, minha irmã Mônica, muito obrigada por tudo que vocês sempre fizeram e fazem por mim! Amo muito vocês!!!!! Ao meu marido, melhor amigo e agora papai, Luís! Obrigada por tornar minha vida ainda mais feliz!!!! TE AMO! À minha pequena Maria Fernanda!

7 Agradeço, Ao meu orientador Prof. Dr. Cláudio Alvarenga de Oliveira pelos ensinamentos e orientação. Obrigada pela confiança. Ao Prof. Dr. Marcelo ABV Guimarães pelos ensinamentos desde a graduação, incentivo e ótimos conselhos! À Dra. Priscila Viau Furtado, uma grande amiga que sempre me incentivou! Sua colaboração foi essencial para a realização deste trabalho, sempre com competência e entusiasmo! Obrigada também por ceder as amostras de onça pintada para a realização deste projeto. À CAPES pelo apoio através da bolsa de doutorado concedida durante o período de realização deste trabalho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio científico e financeiro. À M.V. M.S. Patrícia E. B. Berbare por ceder as amostras de gato mourisco para uso neste trabalho. Ao Prof. Dr. Juan Carlos Illera e Prof a. Dr a. Gema Silván, da Universidade Complutense de Madrid que nos receberam para o treinamento técnico em enzimaimunoensaio. Às minhas super amigas Thays e Andrezza! Às amigas e anjos Lilian e Flaviana, vocês são muito especiais e nossos momentos de rejuvenescimento inesquecíveis! Aos veterinários Sady e Mariana do Zoológico Municipal de Piracicaba por permitir e apoiar a realização do desafio de ACTH.

8 À Cecília Pessuti, bióloga chefe do Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros, Sorocaba por permitir e apoiar a realização do desafio de ACTH. A toda minha família Cattaruzzi que sempre me apóia e me incentiva! A minha sogra Francisca! A todos os amigos da pós-graduação, especialmente Rodrigo, Marie, Manuela, Cristiane, Lilian K, Cláudia, Tatiana, Marina, e Suzana. Em especial as amigas que ajudaram muito no processamento das amostras deste trabalho Lilian K e Clarissa. Ao MV MS Marcílio Nichi pelo indispensável auxílio nas análises estatísticas. Às secretárias e funcionários do Departamento de Reprodução Animal e da pós-graduação, especialmente Thaís, Harumi, Alice e Dna Silvia. Aos funcionários da biblioteca da FMVZ/USP.

9 RESUMO RODINI, D. C. Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi). Analytical profile of progestins during puberty and ovarian cyclicity in jaguar (Panthera onca); gestation and lactation in jaguarondi (Puma yagouaroundi) f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, O presente estudo teve como objetivo utilizar a técnica de enzimaimunoensaio (EIE) com o Ac monoclonal CL425 na dosagem de metabólitos de progestinas fecais para caracterizar o perfil no início da atividade ovariana e durante o ciclo estral em onça pintada (Panthera onca) e durante a gestação e lactação em gato mourisco (Puma yagouaroundi). Foram estudadas três fêmeas de onça pintada em fases distintas (pré-puberes n=2 e adulta n=1) e três fêmeas de gato mourisco em duas fases distintas (gestantes n=2 e lactantes n=3). O protocolo empregado no EIE foi validado para a mensuração de progestinas em fezes de onça pintada e gato mourisco (r=0,98, p=0,0078; r=0,97, p=0,0130, respectivamente). Observou-se que os animais pré-puberes apresentaram início da produção de progesterona nos meses de setembro e novembro. As elevações das progestinas fecais na fêmea adulta de onça pintada não se sustentaram, indicando que não ocorreu ovulação espontânea nessa espécie. Houve diferença significativa entre as concentrações médias de progestinas fecais (p<0,001) dos animais pré-púberes e adultos no grupo das fêmeas de onça pintada. No grupo das fêmeas de gato mourisco, não foi possível diferenciar as concentrações de progestinas fecais durante a gestação e lactação.obtivemos correlação entre as concentrações de progestinas fecais medida pelos métodos de radioimunoensaio (RIE) e enzimaimunoensaio (r=0,98, p<0,0001). Palavras-chave: Metabólitos. Esteróides. Enzimaimunoensaio. Felidae

10 ABSTRACT RODINI, D. C. Analytical profile of progestins during puberty and ovarian cyclicity in jaguar (Panthera onca); gestation and lactation in jaguarondi (Puma yagouaroundi). Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi) f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, The present study had as objective to use the technique of enzyme immunoassay (EIA) with monoclonal antibody CL425 in the dosage of faecal progestin to characterize the profile during ovarian activity beginning and estral cycle in jaguar (Panthera onca) and gestation and lactation in jaguarondi (Puma yagouaroundi). Three female jaguars were studied in distinct phases (pre-pubertal n=2 and adult n=1) and three female jaguarondi were studied during two distinct phases (gestation n=2 and lactation n=3). The EIA used was validated for faecal progestin measurement in jaguar and jaguarondi (r=0,98, p=0,0078; r=0,97, p=0,0130, respectively). The beginning of progesterone production for pre-pubertal animals was in September and November. Elevations of progestin in the adult jaguar were not supported, showing that there was not spontaneous ovulation for this specie. There was significant difference between medium progestin concentrations (p<0,001) of pre-pubertal and adult jaguars. It was not possible to identify different progestin concentrations during gestation and lactation in female jaguarondi. The faecal progestin profiles measured by radioimmunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (EIA) corresponded well and were positively correlated (r=0,98, p<0,0001). Key words: Metabolites. Steroids. Enzyme immunoassay. Felidae

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Aspectos Biológicos e Reprodutivos dos Felinos Selvagens Métodos não invasivos Metodologias Analíticas Radioimunoensaio Enzimaimunoensaio Progestinas OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS Onça Pintada Amostras - Onça Pintada Gato Mourisco Amostras Gato Mourisco Preparação das Amostras Transformação das Concentrações Determinadas por EIE Dosagens Hormonais Procedimento Enzimaimunoensaio Teste de Titulação Descrição do Enzimaimunoensaio Controle de Qualidade Validação Desafio de ACTH em Gato Mourisco Análise dos Resultados RESULTADOS E DISCUSSÃO Parâmetros de Qualidade dos Ensaios Hormonais Teste de Titulação Validação Validação Fisiológica Perfis Hormonais Gato Mourisco Avaliação da estabilidade dos metabólitos de progesterona Perfis Hormonais Onça Pintada CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 64

12 INTRODUÇÃO

13 12 1 INTRODUÇÃO Importantes avanços têm sido obtidos na expansão do conhecimento a cerca da reprodução de felinos selvagens, inicialmente através de estudos comparativos com gatos domésticos como modelos para espécies de felinos ameaçados e também através de pesquisas utilizando análises endócrinas, coletas periódicas de sêmen ou laparoscopia em espécies não domésticas. Em especial, o uso da análise de metabólitos de hormônios fecais como uma ferramenta de monitoramento não invasivo para se acessar os aspectos reprodutivos e atividade adrenocortical tem revolucionado a pesquisa com espécies ameaçadas (BROWN et al., 1996; BROWN; WILDT, 1997; GRAHAM; BROWN, 1997). A utilização de métodos não invasivos de mensuração de esteróides fecais para se acessar o perfil endócrino de um animal se iniciou no final da década de 70 em trabalho desenvolvido em pássaros (CZEKALA; LASLEY, 1977) e na década de 80 em estudos com mamíferos (MOSTL, 1984), e tem se estabelecido durante as duas últimas décadas em diversas espécies (PALME, 2005; SCHWARZENBERGER, 2007). Atualmente estas técnicas são amplamente utilizadas e suas vantagens são bem conhecidas, eliminando a necessidade de contenção física ou química do animal para um acompanhamento hormonal longitudinal (JOHNSON; GAY, 1981; CLARKE; DOUGHTON, 1983; FULLER et al., 1984; BROWN, 2006). Os estudos reprodutivos em espécies ameaçadas são de grande valia, pois geram conhecimentos que poderão ser aplicados em programas de reprodução natural e assistidos, com o intuito de maximizar a reprodução e manter a população estável e geneticamente viável (BAMBERG et al., 1991; LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; SCHWARZENBERGER et al., 1996).

14 13 Durante as duas últimas décadas, o monitoramento dos metabólitos de estrógenos e progestinas nas fezes permitiu a caracterização efetiva do ciclo estral, prenhez e padrões sazonais da reprodução de várias espécies de felinos (BROWN et al.,1994, 1995, 1996, 1997, 2006; MOREIRA et al., 2001; VIAU et al., 2005; GRAHAM et al., 2006). No entanto, para muitas espécies ainda é necessário o desenvolvimento de novos trabalhos, gerando maior compreensão a respeito da fisiologia reprodutiva destes animais. Viau (2003) e Berbare (2004) trabalhando respectivamente com onça pintada e gato mourisco observaram oscilações das progestinas que não se sustentaram, não sendo possível estabelecer correlações com possíveis eventos biológicos. Na gestação de gato mourisco as progestinas comportaram-se de maneira diferente do relatado para gato doméstico e outros felinos, com níveis considerados basais durante a gestação, apresentando elevação destes níveis no período da lactação (BERBARE, 2004). O presente estudo utilizou a técnica de enzimaimunoensaio na dosagem de progestinas fecais em fezes de gato mourisco e onça pintada, buscando elucidar conflitos relacionados ao perfil deste hormônio nas diferentes fases do ciclo reprodutivo.

15 14 REVISÃO DE LITERATURA

16 15 2 REVISÃO DE LITERATURA A revisão de literatura foi redigida em quatro tópicos visando facilitar a leitura. 2.1 Aspectos Biológicos e Reprodutivos dos Felinos Selvagens A América Latina é composta por 21 países divididos em América do Norte, Central e do Sul, compondo uma vasta área de aproximadamente km 2. Dentro desta vasta região existem 10 espécies de felinos selvagens onça pintada (Panthera onca), onça parda (Puma concolor), jaguatirica (Leopardus pardalis), gato maracajá (Leopardus wiedii), gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus), gato-do mato-grande (Oncifelis geoffroyi), gato palheiro (Oncifelis colocolo), gato mourisco (Puma yagouaroundi), gato dos andes (Leopardus jacobitus) e gato kodkod (Oncifelis guigna), a maioria destas espécies encontra-se ameaçada devido à extinção de todo ou parte do seu habitat natural. A conservação destes felinos, contudo, é um grande desafio frente ao crescimento da população humana, ao aumento do consumo de recursos, além de outras pressões sociais exercidas nos habitats e em populações selvagens (SWANSON; BROWN, 2004). No Brasil temos oito espécies: Puma yagouaroundi (Gato mourisco), Leopardus wiedii (Gato maracajá), Leopardus pardalis (Jaguatirica), Leopardus tigrinus (Gato-do-mato-pequeno), Oncifelis colocolo (Gato palheiro), Oncifelis geoffroyi (Gato-do-mato-grande), Panthera onca (Onça pintada) e Puma concolor (Onça parda) (OLIVEIRA, 1994). O declínio da população de felinos está principalmente relacionado à acelerada destruição dos habitats e a caça. Um importante aspecto na preservação

17 16 destas espécies está relacionado ao aumento de programas de reprodução de zoológicos e parques, nos quais as populações são especialmente manejadas para que se mantenham linhagens genéticas e biodiversidade. Embora, algumas espécies de felinos em cativeiro apresentem sucesso reprodutivo, outras apresentam dificuldades em se reproduzir. Geralmente os resultados são dificultados pela falta de informações a respeito da fisiologia das espécies (WILDT et al., 1986). Assim é extremamente importante que se desenvolvam estudos espécieespecíficos para avaliar precisamente a função endócrina e condições reprodutivas em populações de felinos não domésticos (BRISTOL-GOULD; WOODURUFF, 2006). A onça pintada é o maior felino das Américas, único representante atual do gênero Panthera no Novo Mundo (GONYEA, 1976). Atualmente, ela pode ser considerada quase extinta nos Estados Unidos, El Salvador, Uruguai, terras baixas do México e regiões desenvolvidas do Brasil (SANDERSON et al., 2002). A destruição de habitats associada à perseguição, faz com que a espécie esteja classificada como vulnerável à extinção pela IUCN (União Internacional para Conservação da Natureza) (IUCN, 2002), e encontre-se na categoria dos animais vulneráveis da Lista das Espécies Ameaçadas de Extinção da Fauna Brasileira (BIODIVERSITAS, 2006). Com base em observações comportamentais, alguns autores sugerem que a maturidade sexual ocorra entre 24 e 30 meses para fêmeas, e entre 36 e 40 meses para machos (WILDT et al., 1979; MONDOLFI; HOOGESTEIJN, 1986; RABINOWITZ; NOTTINGHAM, 1986). Em estudo da função ovariana de fêmeas mantidas em cativeiro por meio de métodos não invasivos constatou-se que o início

18 17 da puberdade começa por volta dos 20 meses e o estro pode ocorrer durante 7 a 15 dias e o inter-estro de 28 a 31 dias (VIAU, 2003). A gestação dura de 90 a 112 dias (EWER, 1973; RODRIGUES; AURICCHIO, 1994) e geralmente nascem dois filhotes (SEYMOUR, 1989). A amamentação finda entre 5 6 meses, permanecendo com a mãe ainda por mais ou menos dois anos. Uma fêmea pode produzir de 4 a 8 filhotes durante a vida, considerando uma longevidade em vida livre de 11 anos, a idade da primeira cria de três a três anos e meio e a produção de 1 a 2 filhotes a cada ano (OLIVEIRA, 1994). O gato mourisco (Puma yagouaroundi) tem uma distribuição geográfica semelhante aos outros felinos Neotropicais, sendo encontrado do sul do Texas, ao leste e oeste do Mexico, através do vale do Peru, do sul do Brasil e Paraguai até as cidades de Buenos Aires e Rio Negro na Argentina (CABRERA, 1957; GUGGISBERG, 1975; HALL, 1981; TEWES; SCHMIDLY, 1987). O gato mourisco é considerado o felino com mais características do ecossistema de cerrado e o pequeno felino com a maior flexibilidade de habitat (OLIVEIRA, 1994). Dentro do grupo dos felinos Neotropicais, somente as jaguatiricas (Leopardus pardalis) são maiores que o gato mourisco. Este felino está classificado globalmente como Apêndice II e como Apêndice I desde 1987 na América Central e do Norte (CITES, 2005); foi também classificado como vulnerável (OLIVEIRA, 1994; IUCN, 2002). Segundo Mellen (1993) o ciclo estral tem duração de dias. A gestação dura de 70 a 75 dias, nascendo em média 1,83 fihotes (MELLEN, 1993).

19 Métodos não invasivos Os métodos convencionais para obtenção de dados sobre o perfil endócrino em animais domésticos baseiam-se na análise de amostras de sangue coletadas seqüencialmente. Esta abordagem é impossível para a maioria das espécies selvagens, devido às dificuldades de manejo e a susceptibilidade destas espécies ao estresse. Em comparação com esses métodos mais tradicionais de análise de hormônios esteróides no sangue, os métodos não invasivos, como as dosagens hormonais de metabólitos excretados em urina e fezes são alternativas importantes (BAMBERG et al., 1991; LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; BROWN et al., 1994; DENHARD et al., 2001; GRAHAM et al., 2001; ZIEGLER, 2005). Apresentando como principal vantagem o fato de não introduzir variáveis que podem alterar os resultados das dosagens (SCHWARZENBERGER, 2007). A análise de metabólitos fecais de progesterona tem sido utilizada com sucesso para monitoramento da função do corpo lúteo e gestação, puberdade e sazonalidade em uma vasta lista de espécies animais incluindo primatas (WASSER et al., 1988; WASSER et al., 1991; HEISTERMANN et al., 1993; SHIDELER et al., 1993; WASSER et al., 1993; WASSER et al., 1994; STAVISKY et al., 1995; ZIEGLER et al., 1996); espécies bovinas (KIRKPATRICK et al., 1993; SCHWARZENBERGER et al., 1996); rinocerontes (SCHWARZENBERGER et al., 1996) e felídeos (CZEKALA et al., 1994; BROWN et al., 1994; BROWN et al., 1995; GRAHAM et al., 1997; BORQUE et al., 2005). Segundo Brown et al. (1994), a caracterização da normalidade endócrina é essencial para que se tenha sucesso reprodutivo, identificando-se quais indivíduos

20 19 apresentam problemas relativos à fertilidade, e determinando-se o tipo de técnica em reprodução assistida que melhor se aplica a cada espécie. É importante lembrar que o metabolismo e excreção de esteróides diferem entre espécies e desta maneira os métodos não invasivos devem ser rigorosamente validados para cada espécie antes de sua utilização (PALME, 2005). Animais mantidos em cativeiro são ideais para a realização deste tipo de pesquisa, pois permitem uma coleta regular de amostras, facilitando a validação da técnica. Uma vez estabelecidas, análises não-invasivas de hormônios podem ser usadas em estudos que investiguem efeitos sociais e ecológicos dos animais de vida livre (LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; KIRKPATRICK et al., 1993; MONFORT, 2003; SCHWARZENBERGER, 2007). 2.3 Metodologias Analíticas Radioimunoensaio Os princípios do radioimunoensaio (RIE) foram estabelecidos em 1960 por Solomon Berson e Rosalyn Yalow, em Nova York, e por Roger Elkins, em Londres. Os pesquisadores americanos chamaram o método de radioimunoensaio e o inglês de análise de saturação. Ambos os métodos se baseiam no uso de um agente ligante específico e de hormônios radioativos como traçadores, para medir a concentração de substâncias até então não mensuráveis pelos métodos bioquímicos disponíveis (THORELL; LARSON, 1978). Segundo os princípios desses métodos, uma quantidade fixa de hormônio radioativo compete com o hormônio a ser medido (idêntico ao radioativo) por um

21 20 número limitado (saturado) de sítios de ligação de um agente ligante de alta afinidade e especificidade pelo hormônio em questão. A concentração de um determinado hormônio pode ser determinada em amostras de fluídos e extratos biológicos (THORELL; LARSON, 1978). A maioria dos conjuntos diagnósticos comerciais disponíveis no mercado foi desenvolvida para avaliação quantitativa de hormônios no soro humano, os anticorpos de alta especificidade desses kits comerciais não são em sua maioria tão eficientes na detecção dos metabólitos por apresentarem baixa porcentagem de reação-cruzada com os principais metabólitos encontrados nos extratos de outras matrizes biológicas. O conjunto diagnóstico comercial para dosagem de progesterona tem apenas 12,4% de reação cruzada com seus metabólitos segundo protocolo fornecido pelo fabricante (Siemens Los Angeles, CA, USA). O RIE utiliza material radioativo o que requer licenças especiais junto aos órgãos reguladores como a Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN). São gerados rejeitos radioativos que devem permanecer armazenados no laboratório por um período de no mínimo 60 dias para o decaimento da meia vida do 125 I, para que depois possam ser descartados como lixo hospitalar. O elevado custo por amostra dosada, chega a custar em média 80% mais se comparado com outras metodologias imunométricas, como o Elisa e a Quimiluminescência. Com o desenvolvimento de programas de responsabilidade ambiental, alternativas a esse método radioativo foram desenvolvidas para a quantificação hormonal em soro humano, como o enzimaimunoensaio (EIE), a quimiluminescência e a espectometria de massa. Para uso veterinário o radioimunoensaio ainda é utilizado para quantificação de hormônios, embora os trabalhos publicados recentemente apontem para uma substituição gradativa dessa metodologia, com

22 21 grande destaque para os projetos com animais silvestres (BORQUE et al., 2005; PEREIRA et al., 2006; SONGSASEN et al., 2006; PETTITT et al., 2007) Enzimaimunoensaio As enzimas são os marcadores mais utilizados na atualidade, com as vantagens de não apresentarem riscos associados à exposição de radioisótopos, bem como a possibilidade da amplificação catalítica e da associação com outros marcadores, como por exemplo, os quimioluminescentes e fluorescentes, resultando em ensaios de baixo limite de detecção (TSUJI, 1989; JOHANNSSON, 1991). O exemplo significativo de enzimaimunoensaios (EIE) heterogêneo é o método que emprega anticorpos imobilizados em placa de poliestireno com número variável de poços de ensaio. Em protocolo clássico o método é realizado em 8 etapas: 1-ativação da placa, 2-lavagem, 3-imobilização dos anticorpos, 4-lavagem, 5-incubação, 6-lavagem,7-adição de substrato cromogênico e 8-leitura óptica dos poços. Este sistema de placas possibilita a realização do ensaio de maneira com que garanta a uniformidade de todas as etapas tanto para amostras e referências, condição essencial para confiabilidade dos dados. Outro ponto muito importante é que devido à alta sensibilidade do método, o mesmo é feito em micro escala o que o torna bastante econômico dado à reduzida quantidade de reagentes utilizados, além da rapidez do método. (JOHANNSSON, 1991; ZIEGLER, 2005). Os resultados apresentados por Graham et al. (2001) e por Moreira (2001) demonstram que o EIE é uma alternativa prática e econômica ao RIE para o monitoramento não invasivo da função ovariana via análise de progestinas e

23 22 estrógenos de amostras fecais de espécies não domésticas em cativeiro ou em vida livre. Esse imunoensaio pode ser implementado com um custo mínimo de equipamentos e com um custo baixo por análise. Acrescentam-se ainda outras vantagens sobre o procedimento convencional de RIE; essas são: maior sensibilidade, menos trabalho e economia de tempo, uso mais econômico do anticorpo e utilização de equipamento de menor custo (MOREIRA, 2001). Esse sistema de análise pode operar tanto de forma competitiva ou não competitiva. Na versão competitiva, antígenos marcados com enzimas competem com antígenos livres (analito) por número limitado de anticorpos imobilizados. Atualmente utilizam-se, tanto para ensaios competitivos, quanto não-competitivos, sistemas que fazem, além de leitura automatizada dos diferentes poços, diluições em série e réplicas das amostras (JOHANNSSON, 1991). A maioria dos EIE utiliza anticorpos específicos para hormônios esteróides não metabolizados ou conjugados de esteróides metabolizados, o que os torna mais aplicáveis para a mensuração de hormônios esteróides circulantes no sangue ou metabólitos conjugados na urina, respectivamente. Entretanto, fezes são mais fáceis de coletar do que soro ou urina, sendo a análise de esteróides fecais o método preferencial para o monitoramento não invasivo da função ovariana em animais selvagens de cativeiro ou de vida livre (LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; MUNRO et al., 1991; CZEKALA et al., 1994). Para o desenvolvimento de ensaios espécie-específicos, a determinação da maioria dos metabólitos de hormônios fecais através de estudos de radiometabolismo (PALME et al., 1996, 2005) ou a identificação dos metabólitos de esteróides fecais via espectometria de massa seriam as possibilidades analíticas. No entanto, essas técnicas são de difícil aplicação na maioria das espécies selvagens e

24 23 a melhor alternativa é realizar o teste de diferentes ensaios com altas reações cruzadas contra certos grupos de esteróides, obtendo-se assim ensaios grupoespecíficos (SCHWARZENBERGER, 2007). Enzimaimunoensaios para progestinas foram usados com sucesso no monitoramento não invasivo da função endócrina durante o ciclo estral, gestação, e período pós-parto de veados (Mazama guazoubira) (PEREIRA et al., 2006) Os resultados obtidos por Songsasen (2006) no monitoramento da função gonadal através da quantificação de metabólitos fecais por EIE em fêmeas de lobo guará (Chrysocyon brachyurus) foram similares ao observado por Velloso et al. (1998) usando o RIE. O trabalho desenvolvido por Gudermuth (1998) indica que os eventos hormonais ocorridos durante o ciclo reprodutivo do cão doméstico (Canis familiares) apresentam reflexos nas concentrações de esteróides fecais, resultados estes obtidos através da técnica de EIE. A quantificação de 17β-estradiol e progesterona em soro canino utilizando EIE apresentou boa correlação (r=0,91, p<0,001) com os resultados obtidos por RIE (VERVERIDIS et al., 2002). Esses ensaios enzimáticos têm sido usados com sucesso para quantificação de metabólitos de progesterona em fezes de animais de produção como vacas de corte, com o objetivo de facilitar o manejo e permitir o monitoramento do ciclo ovariano. Isobe et al. (2005) conclui que o EIE é um ótimo método para a mensuração de progesterona fecal em gado de corte. Este tipo de ensaio permite um resultado rápido, sensível a concentrações de progesterona plasmática inferiores a 1.0ng/mL, é relativamente mais barato e pode ser realizado com maior facilidade, até mesmo em trabalhos a campo (SINGER et al., 2004).

25 24 Ensaios que apresentam alta reação cruzada com um grupo de pregnanedionas e hidroxe-pregnanes têm sido utilizados com sucesso para quantificar metabólitos de progesterona em fezes de diversas espécies incluindo carnívoros (BROWN, 2006). Diversos trabalhos com EIE avaliaram a função ovariana por meio da quantificação dos metabólitos de estrógenos e progestinas em diversas espécies utilizando respectivamente os anticorpos policlonal R522-2 e monoclonal CL425 obtidos de Coralie Munro (Universidade da Califórnia, Davis, CA, EUA). Estes anticorpos mostraram-se eficientes, permitindo a identificação de diferentes momentos fisiológicos como gestação, puberdade, ciclo estral e ovulação em espécies como lobo guará (Crysocyon brachyurus), elefantes africanos (Loxodonta africana), rinocerontes negros (Diceros bicornis) e brancos (Ceratotherium simum), hipopótamos (Hipopotamus amphibius), okapis (Okapia johnstoni) (GRAHAM et al., 2001; SONGSASEN et al., 2006) e esquilo (Xerus inauris) (PETTITT et al., 2007). Trabalhos realizados com felídeos selvagens (BROWN et al.,1994, 1995, 1996; GRAHAM et al., 2001; MOREIRA et al., 2001; GRAHAM et al., 2006) utilizaram para detecção das progestinas um anticorpo monoclonal que reage 100% com progesterona, 96% com 5-α-pregnane-3β-ol-20-ona, 36% com 5α-pregnane-3αol-20-ona, 15% com 5β-pregnane-3β-ol-ona, 15% com 17β-hidroxiprogesterona, 13% com pregnanolona, 5% com 5β-pregnane-3α-ol-20-ona, 5% com 5β-pregnane- 3α, 17α-diol, 20α-ona e menos que 1% com androstenediona, testosterona, estradiol, estriol e cortisol. Os principais metabólitos fecais de progesterona para esse táxon foram determinados por HPLC por Brown et al., São eles 5βpregnane-3β-ol-ona (61,8%), 5β-pregnane-3α-ol-20-ona (22,3%), 5α-pregnane-3α-ol- 20-ona (13,9%), 5-α-pregnane-3β-ol-20-ona (3,2%).

26 Progestinas A concentração de progesterona no soro aumenta após ovulação espontânea ou induzida e deve estar presente para que a gestação seja mantida. Foi demonstrado em um estudo com gato doméstico que as enzimas necessárias para a produção de progesterona estão presentes na placenta, sugerindo que a unidade feto-placental seja uma fonte de progesterona gestacional (KUSTRITZ, 2006). Progesterona é metabolizada em pregnanedionas e pregnanes hidroxilados antes de sua excreção nas fezes. Então, o uso de anticorpos de progesterona subestima as concentrações de metabólitos fecais. Para melhorar a metodologia de análise não invasiva de metabólitos de progesterona nas fezes, enzimaimunoensaios utilizando um grupo específico de anticorpos são indicados (SCHWARZENBERGER et al., 1996). O mecanismo da ovulação parece variar entre as diferentes espécies de felinos. Estudos que utilizaram dosagens hormonais séricas ou plasmáticas confirmam que alguns felinos selvagens como tigresas - Panthera tigris (SEAL et al., 1985), leopardo das neves - Panthera uncia (SCHIMIDT et al., 1993), e suçuaranas - Puma concolor (BONNEY et al., 1981), possuem mecanismo de ovulação induzida, assim como a gata doméstica - Felis catus (SHILLE et al., 1979; JOHNSTON et al., 1996). No entanto, alguns trabalhos observaram altas concentrações de progesterona sérica e a presença de corpo lúteo em gatas que não tiveram contato físico com machos, sugerindo que a ovulação pode ter ocorrido espontaneamente ou por outro estímulo que não a cópula (LAWLER et al., 1993; GUDDERMUTH et al., 1997).

27 26 Alguns trabalhos sugerem também, a ocorrência de ovulação espontânea em algumas espécies de felinos silvestres. Fêmeas de leopardos (Panthera pardus) apresentaram os dois mecanismos de ovulação em duas diferentes situações. Quando mantidas isoladas, mostraram perfil hormonal típico de ovuladoras reflexas, porém, quando alojadas em duplas de fêmeas, ovularam, provavelmente estimuladas pelo contato físico entre elas (SCHMIDT et al., 1988). Leoas (P. leo) isoladas de machos mostraram um padrão distinto dos demais felinos relatados. Schmidt et al. (1979) comprovaram por dosagens hormonais séricas e visualização do corpo lúteo, que esta espécie apresenta ovulação espontânea com freqüência superior a outros felinos já descritos na literatura. Moreira et al. (2001) acompanharam o perfil longitudinal, através da dosagem hormonal dos estrógenos e progestinas fecais de três espécies da linhagem das jaguatiricas, e observaram que a jaguatirica (Leopardus pardalis) e gato-do-mato (Leopardus tigrinus) apresentaram ovulação reflexa, enquanto o gato-maracajá (Leopardus wiedii) apresentou ovulação espontânea. Segundo Wildt et al. (1979), a ovulação da onça-pintada assemelha-se a do gato doméstico, sugerindo que muito provavelmente estes animais apresentem ovulação não espontânea. Em algumas espécies (jaguatirica, lince e onça-pintada) observou-se que as progestinas estão aumentadas durante a elevação do estradiol. Entretanto, isto não é observado em todas as espécies e a significância desta co-variação não é conhecida. As progestinas são provavelmente de origem folicular, porque as concentrações são apenas uma fração daquelas observadas pós ovulação (BROWN, 2006).

28 27 Viau (2003) não observou variação significativa das concentrações de metabólitos de progesterona nos períodos de estro e inter estro em fezes de onça pintada. Berbare (2004) observou elevações dos metabólitos de progesterona nas fezes de gato mourisco, mas estas elevações apresentaram-se irregulares e inconsistentes, não sendo possível concluir que essas elevações tenham refletido uma atividade luteínica, fato que caracterizaria uma ovulação espontânea. Alterações hormonais durante o período de diestro pós-cópula no gato doméstico estão bem caracterizadas. Inicia-se de 1 a 2 dias pós ovulação, a secreção de progesterona do corpo lúteo aumentando e permanecendo elevada de 64 a 67 dias nas gatas gestantes, e aproximadamente a metade deste período nas não gestantes (WILDT, 1981; TSUITSUI, 1993). Após a ovulação, 17β Estradiol sérico flutua acima dos níveis basais, indicando atividade esteroidogênica mesmo durante a gestação. Estrógenos aumentam significativamente durante a última metade da gestação, com uma elevação ocorrendo cerca de uma semana antes do parto (ROTH et al., 1995). O diagnóstico de gestação baseado na análise de progesterona durante a primeira metade da gestação não é possível devido aos níveis de concentração da fase luteal não apresentarem significativa variação. Entretanto, como a fase luteal é mais curta é possível se detectar a gestação se a progesterona continua elevada após 40 dias da cópula (BROWN, 2006). Em tigres podem-se utilizar as concentrações de progestinas fecais para o diagnóstico da gestação após 35 dias da cópula (GRAHAM et al., 2006). Em diversas espécies de felinos selvagens, leão (SCHIMDT et al., 1979), puma (BOONEY et al., 1981), leopardo das neves, guepardos e tigres (BROWN,

29 , 1996) observou-se que a duração da fase luteal gestante é cerca de um terço a metade da gestação. Em trabalho realizado com fêmeas de gato mourisco (Puma yagouaroundi) prenhes as progestinas comportaram-se de maneira diferente do relatado para gato doméstico e outros felinos, com níveis considerados basais durante a gestação, apresentando elevação destes níveis no período da lactação (BERBARE, 2004). Variações na concentração de progesterona podem também estar associadas a situações estressantes. Encontramos na literatura diversos trabalhos que utilizam dosagens de cortisol e progesterona como um parâmetro para se avaliar a resposta do córtex adrenal ao stress em diversas espécies animais como vacas (ESSAWY et al., 1989), cães (PRITTIE et al., 2002) e gatos SMITH et al.,1999; CHATDARONG et al., 2006). CHATDARONG et al., 2006 observou que variações de ambiente e manipulações podem agir como agentes estressores induzindo a secreção de cortisol e progesterona pela adrenal em gatos domésticos com a mesma magnitude que a administração de ACTH.

30 29 OBJETIVOS

31 30 3 OBJETIVOS - Caracterizar o perfil das progestinas fecais no início da atividade ovariana e durante o ciclo estral em fêmeas de onça pintada. - Caracterizar a atividade luteal durante a gestação e lactação em fêmeas de gato mourisco. - Demonstrar a aplicabilidade da técnica de enzimaimunoensaio (EIE) para quantificar progestinas fecais utilizando amostras previamente dosadas por radioimunoensaio (RIE).

32 31 MATERIAIS E MÉTODOS

33 32 4 MATERIAIS E MÉTODOS Neste estudo utilizamos amostras oriundas dos seguintes projetos de pesquisa: Determinação das concentrações de estrógenos e progestinas em extratos fecais de fêmeas de onça pintada (Panthera onca) e Metabólitos fecais de hormônios esteróides sexuais do gato-mourisco (Herpailurus yagouaroundi), nível mestrado, fomentados pela FAPESP, nº 00/ e 01/ , respectivamente, Desta maneira os subitens 4.1 Onça Pintada e 4.2 Gato Mourisco seguem o que foi previamente descrito por Viau (2003) e Berbare (2004). 4.1 Onça Pintada Foram utilizadas três fêmeas de onça-pintada (Panthera onca), sendo uma adulta e duas pré-púberes. Os animais foram divididos em dois grupos: animais adultos (grupo AA) e animais pré-púberes (grupo PP). O animal adulto era de procedência desconhecida e mantido na Fundação Parque Zoológico de São Paulo FPZSP (AA-01), em recinto individual no setor extra, porém com contato olfativo e/ou visual com machos e fêmeas da mesma e de outras espécies. No grupo PP, uma fêmea (PP 01) era procedente da Região do Rio Negro Pantanal pertencente ao Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros Sorocaba/SP. A idade média estimada dessa fêmea era de 11 meses no início do experimento. A segunda fêmea era procedente de Anaurilândia MS, e mantida no Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira CESP/SP (PP02), tendo contato visual e olfativo com um macho da mesma ninhada. A idade média estimada para esta fêmea foi de 15 meses, no início do experimento.

34 33 Todos os animais estiveram expostos ao ambiente (fotoperíodo, temperatura e umidade do ar), tinham acesso livre à água e a dieta alimentar era oferecida à tarde conforme rotina empregada pelas instituições. No quadro 1 encontram-se os dados de cada animal. animal Idade Procedência Histórico Reprodutivo AA-01 Adulta FPZSP - SP 1 gestação PP meses PZMQB Sorocaba/SP - PP meses CCFS/ CESP- Ilha Solteira/SP - FPZSP=Fundação Parque Zoológico de São Paulo PZMQB= Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros CCFS=Centro de Conservação da Fauna Silvestre Quadro1- Identificação, idade, procedência e histórico reprodutivo das fêmeas de onça pintada (Panthera onca) utilizadas no presente estudo Amostras Onça Pintada As amostras fecais foram colhidas de 2 a 7 vezes por semana, logo após os animais defecarem no período da manhã. A colheita das amostras de onça pintada do grupo AA foi realizada durante aproximadamente 18 meses, e do grupo PP durante aproximadamente 16 meses. 4.2 Gato Mourisco Foram utilizadas no estudo três fêmeas de gato-mourisco (Puma yagouaroundi), com idade variando de 2 à 10 anos, que encontravam-se alojadas na Fundação Parque Zoológico de São Paulo, no bairro da Água Funda em São Paulo,

35 34 fora do setor de exposição. Todos os animais estavam submetidos à fotoperíodo natural, e havia contato visual e olfativo com machos da espécie. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e reprodutiva. Todos os animais encontravam-se sadios ao exame clínico e sem alterações patológicas no sistema reprodutivo. As fêmeas G2 e G5 estavam prenhes com tempo de gestação estimado pelo exame ultrassonográfico em 40 a 45 dias e fase final (±60 dias), respectivamente. O animal G5 pariu dois filhotes no dia 25/02 e o animal G2 um filhote no dia 16/03. O animal G6 pariu 3 filhotes três dias após o início do experimento. No quadro 2 encontram-se os dados de cada animal. Animal Idade Procedência Histórico Reprodutivo G2 (20762) 10 anos FPZSP-SP 7 gestações G5 (25244) 2 anos FPZSP-SP 2 gestações G6 (23120) 6 anos FPZSP-SP 2 gestações FPZSP= Fundação Parque Zoológico de São Paulo Quadro 2 - Identificação, idade, procedência e histórico reprodutivo das fêmeas de gato-mourisco (Puma yagouaroundi) utilizadas no presente estudo Amostras Gato Mourisco As amostras de fezes de gato mourisco foram colhidas cinco vezes por semana durante um período total de 9 meses (14/01/2003 a 03/10/2003). No período da manhã, entre 7:00h e 8:00h, foram colhidas amostras fecais recentes com o auxílio de espátula de madeira. Todo material colhido foi acondicionado em tubos plásticos devidamente identificados quanto ao cadastro do animal e datas, e

36 35 congelado em um prazo máximo de 12 horas após a colheita a uma temperatura de 20ºC, pois segundo Cockrem e Rounce (1994), dentro desse período não há o risco de se ter uma degradação hormonal significativa. As amostras ficaram armazenadas no Laboratório de Dosagens Hormonais (LDH) / FMVZ-USP, em freezer a - 20 C, até o descongelamento para realização do processo de extração hormonal. 4.3 Preparação das amostras Todas as amostras foram liofilizadas durante 24h com o auxílio do aparelho evaporador giratório tipo Speed vac (Speed vac Sc110, Savant ). A liofilização de cada amostra colhida garante a ausência de ação bacteriana, uma vez que estas necessitam de água, e também a padronização do peso do material fecal utilizado. A metodologia empregada na extração dos metabólitos fecais foi de acordo com a técnica descrita por Graham et al. (2001). Alíquotas de 0,2g de fezes liofilizadas foram colocadas em tubos de 15mL e adicionados 5mL de etanol (Etanol, P.A. - Merck ) a 80% (80% etanol, 20% água destilada). Os tubos foram fechados e agitados suavemente em um homogeneizador de sangue (AP22, Phoenix, Araraquara, Brasil) por 15 horas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 1500g por 15 minutos (Centrífuga Excelsa II, modelo 206 MP - Fanem ) e o sobrenadante transferido para tubos de polipropileno e conservado a -20ºC até a realização dos ensaios hormonais. Para esta etapa, as amostras foram diluídas em tampão gelatina [NaPO4 (13,8g), NaCl (9,0g), azida sódica (1,0g) e água destilada (1000ml), ph 7,0], na proporção de 1/100.

37 Transformação das concentrações determinadas por EIE As concentrações determinadas por EIE foram expressas para progesterona em pg/poço, sendo necessária a adequação dos resultados para ng/g de fezes secas. Para essa adequação utilizamos a seguinte equação: CF= C x Vfe x D Pi x Vext. CF = concentração final; C = concentração fornecida pelo EIE; Vfe = volume das fezes ao final da etapa de extração; D = diluição empregada; Pi = peso inicial Vext = volume do extrato utilizado 4.5 Dosagens Hormonais Os metabólitos fecais foram quantificados por enzimaimunoensaio (EIE) de acordo com os procedimentos descritos para outros mamíferos (MUNRO; STABENFELDT, 1984; ILLERA et al., 2003; PEREZ, G.C. et al. 2004). O anticorpo (Ac) monoclonal anti-progesterona clone 425 (CL 425) e a progesterona conjugada 3-O-carboxymetiloxime (HRP) foram fornecidos pela Dra Coralie Munro (Universidade da Califórnia, Davis, Califórnia, USA). As reações-cruzadas deste

38 37 anticorpo foram previamente descritas e são apresentadas na tabela 1 (GRAHAM et al., 2001). Tabela 1 Percentual de reações cruzadas do clone nº 425 do anticorpo para progesterona e seus metabólitos segundo descrito por Graham et al., 2001 Metabólitos de progesterona Nome comum Reação cruzada (%) 4- Pregnan-3,20-diona Progesterona Pregnan-3α-ol-20-ona Pregnan -3β-ol-20-ona Pregenan - 11α-ol-3,20-diona 147 5α-Pregnan-3β-ol-20-ona 94 5α-Pregnan-3α-ol-20-ona 64 5α-Pregnan-3,20-diona 55 5β- Pregnan-3β-ol-20-ona 12,5 5β-Pregnan-3,20-diona 8,0 4- Pregnan-11β-ol-3,20-diona 2,7 5β-Pregnan-3α-ol-20-ona 2,5 5β-Pregnan-3α,20α-diol Pregnanediol <0,1 5α-Pregnan-3α,20β-diol <0,1 5β-Pregnan-3,17-diona Androstenediona <0,1 5β-Pregnan-11β,21-diol-3,20-diona Corticosterona <0, Procedimento enzimaimunoensaio Teste de titulação A primeira etapa na realização do enzimaimunoensaio consistiu na realização de um Teste de Titulação, para que se estabelecesse a melhor relação Ac x HRP. Neste teste foram confrontadas diferentes diluições de Ac com diferentes diluições de conjugado conforme modelo a seguir (Figura 1):

39 A Br STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4 B B0 STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4 C B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5 HRP 1/80000 D B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5 E B0 STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4 F B0 STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4 1/ G B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5 H B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5 Ac 1/4000 1/8000 1/10000 As colunas 5 e 9 não foram utilizadas nesse ensaio Br = branco B0= máxima ligação entre o Ac e o conjugado STD 1= 0,1pg/poço STD 2= 1,0pg/poço STD 3= 10,0pg/poço STD 4= 100,0pg/poço STD 5= 1000,0pg/poço STD 6= 10000,0pg/poço Figura 1- Modelo placa utilizada no Teste de Titulação Descrição do enzimaimunoensaio O enzimaimunoensaio para progesterona foi realizado com base no protocolo descrito por Illera et al. (2003). A técnica consiste na marcação de placas (NUNC Maxisorb) de 96 poços com 50µl de uma solução de anticorpo purificado (Cl 425,1/8.000) em uma solução de coating (coating buffer; Na 2 CO 3, NaHCO 3, H 2 O, ph9,6) exceto o primeiro poço que foi utilizado como branco (Br). As placas foram cobertas com selador plástico (SARSTEDT) e incubadas a 4ºC por 16 horas (Figura 2). Os anticorpos não aderidos a placa foram removidos através de três lavagens em

40 39 lavadora automática (Modelo: Fluido 96-2, Asys Hitech- Anthos ) com uma solução de lavagem (NaCl 1,5M, 0,05% Tween 20) (Figura 3). A placa foi coberta com os padrões e amostra (Figura 4). As soluções padrões foram mantidas dissolvidas em etanol a -20ºC. Foram utilizados os padrões nas diluições: 0,1,1,10,100,1000 e pg/poço. O etanol foi evaporado em um fluxo de ar comprimido (60ºC) e os padrões ressuspendidos em uma solução 1/ de progesterona HRP-conjugado em uma solução de ensaio (EIA Buffer, Na 2 HPO 4 0.1M; NaH 2 PO 4 0.1M; NaCl 0.15M cm 0,1% BSA, ph7,0). As amostras finais foram preparadas com 25µl de extrato fecal, os tubos deixados para secagem em capela overnight e ressuspendidos em 150µl de solução 1/ do conjugado HRP. Padrões e amostras foram analisados em duplicata. Os poços da primeira coluna foram denominados B0 (máxima ligação entre o anticorpo e o conjugado). Para a curva padrão 50µl de EIA buffer seguido de 50µl de cada padrão foram pipetados nos poços das colunas 1 e 2. Para as amostras de extratos fecais 50µl de EIA buffer seguido de 50µl de amostra foram pipetados no poços das colunas 3 a 12. Após incubação em temperatura ambiente por 2 horas, as placas foram lavadas novamente e 100µl de solução de substrato (Enhanced K-Blue TMB Substrate, Neogen Corporation) foi adicionada a cada poço (Figura 5). Após minutos a reação foi parada com 100µl de solução de 10% de H 2 SO 4 (Figura 6), seguida da leitura em um leitor automático (Modelo Multi Detector DTX 800, Beckman Coulter ) com um filtro de 450nm (Figura 7).

41 40 Figura 2 Adsorção dos anticorpos, incubação por 16 horas em geladeira Figura 3 - Lavagem das placas

42 41 Figura 4 - Adição das amostras, padrões e conjugado Figura 5 - Adição do substrato

43 42 Figura 6 Adição de solução de parada Figura 7 Leitura da placa, processamento dos resultados

44 Controle de qualidade Todos os parâmetros de controle de qualidade dos ensaios hormonais foram analisados conforme rotina e empregada no LDH, ou seja, foram calculados o coeficiente de variação intra e inter-ensaio, utilizando valores altos e baixos, no início e fim de cada ensaio. Analisamos a porcentagem de ligação B/B0, sensibilidade e linearidade. 4.7 Validação Realizou-se a validação laboratorial e biológica do enzimaimunoensaio para o uso em extrato de fezes de onça pintada e gato-mourisco, utilizando-se os métodos de paralelismo e validação fisiológica. Paralelismo utilizando matriz íntegra: Indica se o material utilizado está interferindo na ligação antígeno-anticorpo. Foi utilizado um pool de amostras de alta concentração hormonal (valores próximos aos limites superiores da curva-padrão). Estas amostras foram diluídas com o mesmo fator da curva padrão. Validação fisiológica: Indica se as concentrações de metabólitos de esteróides encontradas refletem a função gonadal ou adrenal. Para o gato mourisco foi realizada a validação fisiológica através de um desafio de ACTH e a análise comparativa dos resultados das dosagens de corticosteróides e progestinas fecais dosadas por RIE e por EIE. Para a onça pintada foi realizada a validação fisiológica através da comparação dos resultados de progestinas fecais obtidos nos animais

45 44 pré-púberes (antes do início da atividade ovariana) com os resultados do animal adulto. 4.8 Desafio de ACTH em gato mourisco (Puma yagouaroundi). Foi realizado um protocolo experimental durante dez dias (D-3 a D6) em uma fêmea de gato mourisco (Puma yagouaroundi) (Figura 8), mantida em cativeiro no setor extra do Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros em Sorocaba, São Paulo. O objetivo deste experimento foi verificar a resposta da glândula adrenal após estímulo com ACTH exógeno. No D0 o animal recebeu uma injeção intramuscular 250UI de tetracosídeo ACTH (Synacthene Depot-Novartis- uso humano, 800UI/mg, 1mg, 1ml) (Figura 9). Amostras de fezes foram coletadas diariamente no período da manhã e mantidas a - 20 C até o processamento. As etapas de liofilização, extração (segundo GRAHAM et al., 2001) e ensaios hormonais foram realizadas no Laboratório de Dosagens Hormonais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP. Os metabólitos de corticosterona foram quantificados pela técnica de radioimunoensaio (RIE) utilizando-se o conjunto diagnóstico comercial de duplo anticorpo (MP BIOMEDICALS; INC, CA-USA) e as progestinas fecais por enzimaimunoensaio (EIE) e por radioimunoensaio (RIE), utilizando-se o anticorpo monoclonal CL425 e o conjunto diagnóstico comercial em fase sólida (Siemens, antiga DPC, Los Angeles, CA, USA), respectivamente.

46 45 Figura 8 - Fêmea de gato mourisco (Puma yagouaroundi) mantida em cativeiro no PZMQB Sorocaba Figura 9 - Contenção física e aplicação da injeção de ACTH (Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros, Sorocaba)

47 Análise dos Resultados Todos os resultados foram expressos de acordo com suas médias e erro padrão das médias. As variáveis foram primeiramente analisadas quanto à sua distribuição pelo teste de Kolmogorov Smirnov (teste KS), para verificação de normalidade, e pelo teste de Bartett para verificação de homogenidade de variâncias. Os demais resultados comparativos foram analisados, na dependência das análises anteriormente descritas, segundo métodos paramétricos ou nãoparamétricos. Na hipótese dos dados apontarem para uma metodologia paramétrica, a análise de variância (ANOVA) e os testes de comparação entre médias daí decorrentes foram preferencialmente empregados. Caso contrário deu-se preferência à análise de variância não-paramétrica para correlação de amostras relacionadas. Para verificação de paralelismo nos métodos empregados na validação dos enzimaimunoensaios, foi realizada uma análise de regressão simples e o índice de correlação adotado superior a 0,95 (GRAHAM, 2001). Os dados foram analisados através do programa SAS System for Windows (SAS, Institute Inc, Cary, NC, USA, 2000)