EXTRAÇÃO DE DNA. Guia do Professor

Transcrição

1 EXTRAÇÃO DE DNA Guia do Professor

2 Nesta atividade os alunos aprendem um dos procedimentos experimentais mais comuns num laboratório de Biologia Molecular. Consiste na extração do DNA de células vegetais ou animais seguindo um protocolo experimental análogo ao que é utilizado nos laboratórios, mas usando reagentes e materiais facilmente disponíveis nas nossas casas. NÍVEL ESCOLAR Ensino Secundário ÁREA CIENTÍFICA Biologia Molecular PALAVRAS-CHAVE DNA Extração Biotecnologia DNA recombinante 2

3 OBJETIVOS DA ATIVIDADE Aprender procedimentos experimentais para extrair DNA de células animais e vegetais, semelhantes aos usados em laboratórios de investigação. Compreender e descrever as transformações físicas e químicas que ocorrem em cada passo da extração de DNA. Relacionar a extração do DNA com a sua utilização em algumas tecnologias de DNA recombinante: clonagem (em bactérias), manipulação genética (de plantas, de mamíferos), biotecnologia, sequenciação. MATERIAL NECESSÁRIO: 1 frasco de álcool (mantido no congelador durante pelo menos 2h antes da experiência); sal de cozinha; detergente da loiça (ou champô sem amaciador); gelo e 1 recipiente para gelo (se não existir frigorífico); pontos de água. Por grupo: 1 morango ou 1 banana; 6 copos de plástico transparente (para serem reutilizados entre experiências) ou 3 copos de plástico e 3 tubos transparentes; 1 colher de sobremesa; 1 colher de chá; 1 prato; 1 faca; 1 garfo; 2 filtros de café; 1 proveta; 1 saco ziplock (ou outro tipo); 1 palito; 1 funil; 1 pedaço de cartolina preta. Esta lista inclui o material total para as 3 opções sugeridas na secção 'Explorar'. DURAÇÃO PREVISTA* Introdução da atividade aos alunos: minutos Explorar: minutos Discussão dos resultados e conclusões: minutos Tempo total necessário: minutos *Não inclui preparação prévia de material 3

4 Questionar 4

5 "Existe alguma forma de conseguirmos extrair o DNA das células de forma a vê-lo? Qual será o seu aspecto? " Estas poderão ser as perguntas com as quais começará a envolver e a captar a atenção dos seus alunos para a temática a explorar. Registe as respostas e detete eventuais erros de conceito. Conhecer o nível de conhecimentos prévios na turma poderá guiá-lo na mediação das atividades experimentais e na adaptação das estratégias de integração de novos conceitos durante o processo de aprendizagem. Oriente a discussão de forma a que surja as seguintes questões-problema: Antes de iniciar qualquer aula em enquiry defina muito bem o que pretende que os seus alunos aprendam no final. Reflita sobre os OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM. Atrás sugerimos alguns. (A) Para podermos extrair DNA, quais são as propriedades físicas e químicas das células e do próprio DNA que têm de sofrer transformações ou manter-se igual? (B) Qual o aspecto do DNA das células animais e vegetais? Crie formas de registo individual ou de grupo logo desde o início. Sugestão em anexo. Mais uma vez, registe as respostas dos alunos. Antes de avançar com a atividade de exploração sugerida na secção seguinte, permita que os alunos façam alguma pesquisa, usando livros ou a internet de forma a poderem avançar com algumas hipóteses e até um possível protocolo da experiência que responda às questões-problema apresentadas. Posteriormente, apresente-lhes o(s) protocolo(s) sugerido(s) na secção 'Explorar' (Opção A, B e C) e compare, analisando as diferenças. Avance para a etapa seguinte, aplicando uma ou várias das opções apresentadas na secção 'Explorar'. 5

6 Explorar 6

7 OPÇÃO A: do epitélio bucal 1. Divida a turma em vários grupos. 2. Cada grupo prepara as soluções abaixo indicadas Solução Salina: 2.1. Colocar 2 colheres de chá de sal num copo de plástico (Copo 1) Adicionar 25 ml de água Mexer bem até dissolução total do sal. Solução de detergente: 2.4. Colocar 1 colher de chá de detergente da loiça num copo de plástico (Copo 2) Adicionar 5 ml de água (equivalente a 3 colheres de chá) Mexer bem. Ter cuidado em identificar bem os copos e limpar a colher de chá durante a preparação de uma solução para a outra. 3. Um aluno escolhido pelo grupo bochecha durante 30 segundos uma colher de sopa da solução salina (Copo 1) e cospe para um copo de plástico vazio e devidamente identificado (Copo 3). 4. Adicionar a solução detergente (Copo2) ao Copo 3 e misturar muito bem. 5. Colocar 10 ml da solução do Copo 3 num copo ou tubo transparente e acrescentar álcool etílico gelado até perfazer 1/2 do volume. Manter o copo ou tubo ao nível dos olhos para ver o que acontece. 6. Com a ajuda de um palito ou pau de espetada, retirar uma amostra de DNA, que deverá parecer-se com uma nuvem ou fios brancos, e colocar essa amostra numa cartolina preta. Deixar o álcool evaporar e observar. 7

8 OPÇÃO B: da banana 1. Cada grupo prepara a seguinte solução de extração, tendo cuidado em limpar a colher de chá entre reagentes: Solução de Extração 1.1. Colocar 1 colher de chá de sal num copo de plástico (Copo 1) Adicionar 1 colher de chá de detergente da loiça e 50 ml de água Mexer bem até dissolução total do sal. 2. Tirar a casca da banana e parti-la às rodelas para um prato. 3. Esmagar as rodelas com um garfo até se obter uma papa. 4. Num recipiente largo, juntar a solução de extração (Copo 1) à banana esmagada. Mexer lentamente. 5. Usando um funil e papel de filtro (para café), filtrar o extrato para um tubo ou copo transparente e deixar verter o líquido até 1/8 do volume. 6. Adicionar álcool etílico (gelado) até perfazer 1/2 do volume. 7. Com a ajuda de um palito ou pau de espetada, retirar uma amostra de DNA e colocar essa amostra na cartolina preta. Deixar o álcool evaporar e observar. Figura 1: Esquema ilustrativo da extração de DNA da banana. É possível realizar esta experiência e seguir o mesmo protocolo usando apenas metade da banana. 8

9 OPÇÃO C: de morango 1. Um grupo prepara para toda a turma a seguinte solução de extração: Solução de Extração (1 L) 1.1. Colocar 2 colheres de chá de sal num copo de plástico (Copo 1) Adicionar 50 ml de detergente da loiça e água até perfazer 1 litro Mexer bem até dissolução total do sal. 2. Cada grupo, lava um morango e tirar as sépalas (folhas verdes). 3. Colocar o morango num saco e esmagá-lo com as mãos durante 2 minutos. 4. Adicionar 10 ml da solução de extração ao conteúdo do saco e misturar tudo, apertando com as mãos, durante 1 minuto. 5. Usando um funil e papel de filtro (para café), filtrar o extrato para um tubo ou copo transparente e deixar verter o líquido até 1/8 do volume. 6. Adicionar álcool etílico (gelado) até perfazer 1/2 do volume. 7. Com a ajuda de um palito ou pau de espetada, retirar uma amostra de DNA e colocar essa amostra na cartolina preta. Deixar o álcool evaporar e observar. Figura 2: Esquema ilustrativo da extração de DNA de morango. 9

10 Descobrir 10

11 1. Proporcione o tempo necessário para que os alunos comparem novamente o protocolo usado com a sua proposta inicial e os resultados obtidos entre os vários grupos. Deverão reparar nas características dos vários passos e chegar a uma conclusão sobre a importância de cada. 2. Oriente a discussão explicando, a partir das respostas dos alunos, as conclusões gerais: (A) - Se quisermos ver DNA, as plantas são excelentes fontes: existem, geralmente, em numerosos lugares e em grandes quantidades. Para além disso, muitas possuem oito cópias de cada cromossoma por cada célula (octoplóides) - como os morangos -, o que significa que possuem muito DNA. - As membranas das células são formadas por lípidos, que são gorduras. Tal como acontece quando lavamos loiça, é necessário detergente para atuar na membrana das células e do envelope do núcleo emulsionando as gorduras e destruindo as membranas. O detergente não só rebenta as células e faz com que os organelos circulem suspensos na solução (de água, sal e detergente) como, e principalmente, permite que o DNA se liberte do núcleo, tornando-se assim mais acessível. - O DNA é muito solúvel em água devido aos seus iões fosfato (molécula hidrofílica). Para impedir que o DNA liberto do núcleo da célula se dissolva totalmente na solução e se torne invisível, usa-se sal. O sal, cuja fórmula química é NaCl, quando em solução dissocia-se em iões de Na+ e Cl-. Os iões Na+, com carga positiva, vão interagir com os fosfatos, com carga negativa das moléculas de DNA, tornandoas neutras e estabilizadas, e permitindo a sua agregação. Deste modo, as muitas moléculas de DNA das muitas células aglomeram-se para mais tarde poderem ser visualizadas a olho-nu. (B) O precipitado final de DNA vê-se como um conjunto de filamentos esbranquiçados. Estes correspondem a milhares de moléculas de DNA, com muitas outras moléculas associadas uma vez que a preparação de DNA que se obtém tem um elevado grau de impureza. - A filtração serve para eliminar da solução os restantes constituintes celulares e que só atrapalham : os restos das membranas, os organelos que não rebentaram, etc. Assim, a solução filtrada está tão pura quanto possível, contendo o DNA e outras moléculas, como proteínas, que não interferem com o sucesso da extração. - O álcool usa-se para desidratar as moléculas de DNA, ou seja, afasta a água à sua volta retirando-as da solução. Ocorre precipitação do DNA. 11

12 Anexos 12

13 - PREPARE-SE PARA AS PERGUNTAS DOS ALUNOS! - Nesta secção, disponibilizamos os conceitos teóricos e científicos mais importantes para que possa realizar autonomamente as atividades propostas. No entanto, não exclui a consulta de bibliografia adicional. I. O Ácido Desoxirribonucleico - DNA - Graças aos avanços científicos, hoje sabemos que o DNA (ou ADN) está presente praticamente em todas as células de todos os organismos vivos: animais, plantas, bactérias e fungos. E também em muitos vírus - organismos que precisam de infetar células para se manterem vivos. Em todos, tem a mesma estrutura química. - Nos Humanos, assim como na maioria dos vertebrados, os glóbulos vermelhos são as únicas células que não têm DNA. (Nota: os eritrócitos de galinha têm vestígios de DNA.) - À exceção das bactérias e das arqueobactérias, é no núcleo das células que o DNA se encontra distribuído e na forma de estruturas compactas, os cromossomas. Cada cromossoma não é mais do que uma única molécula de DNA ligado e enrolado em proteínas, as histonas. - Cada célula dos diferentes seres vivos pode conter várias cópias de cada cromossoma: nos humanos existem duas cópias - as células são diplóides (à exceção dos gâmetas femininos e masculinos - óvulos e espermatozóides - que contêm apenas uma cópia de cada cromossoma - dizem-se haplóides); existem organismos com 4 cópias de cada cromossoma por célula - tetraplóides (como por exemplo, o sapo africano e a batata branca), e outros com oito cópias - octaplóides (como por exemplo, o morango). As células estão organizadas em compartimentos, os organelos, separados uns dos outros por membranas e suspensos num fluido de água, sal e moléculas orgânicas, o citoplasma; cada organelo está especializado em desempenhar uma determinada função na célula, sendo um desses, o núcleo, o armazenador da informação genética. Em cada célula humana existem cerca de 2 metros de ADN. - De organismo para organismo, o número total de cromossomas por célula varia. Vejamos o exemplo: à exceção dos gâmetas, as células humanas contam 46 cromossomas (23 pares); já um morango tem 56 cromossomas em cada uma das suas células. - É nos cromossomas, mais especificamente no DNA, que se encontra armazenada a informação que codifica a vitalidade de cada um de nós, seres vivos. Ou, no caso de alguns vírus, as instruções que permitem a sua replicação no hospedeiro que infetam. 13

14 Recorde com os alunos alguns conceitos da síntese proteica, como a transcrição e tradução. - Através de um processo complexo e finamente regulado, o DNA é continuamente lido e codificado sob a forma de proteínas, assegurando dessa forma as funções vitais das células. - Apenas uma pequena parte do DNA, a correspondente aos genes, é codificada em proteínas, sendo que a respetiva percentagem varia com a complexidade do organismo. Por exemplo no humano, apenas ~ 1,5% do seu genoma (~ 25,000 genes) é expresso e codificado em proteínas. O restante DNA não é transcrito nem traduzido em proteínas; no entanto, desempenha um importante papel na regulação da expressão dos genes, nomeadamente na transcrição. Atua também na condensação da cromatina e durante o processo de replicação do DNA. I. Estrutura química do DNA Quimicamente, todas as células são constituídas por macromoléculas (para além de outras moléculas mais pequenas): proteínas, lípidos, hidratos de carbono e ácidos nucleicos. Cada uma destas classes de macromoléculas tem a sua função na célula, podendo estar envolvidas em diversos mecanismos de sinalização, comunicação, transporte, suporte, expressão e regulação génica. - Quando Gregor Mendel, baseado nas suas experiências com a ervilheira, estabeleceu os 3 princípios da transmissão dos caracteres hereditários (1865), ainda nada se sabia sobre a existência do ADN (ou DNA, na sigla inglesa) e muito menos conhecida era a sua composição e estrutura. Foi passado quase um século (1953) que James Watson e Francis Crick descobriram a estrutura de dupla-hélice do DNA, sendo descrita com as seguintes características (que ainda hoje prevalecem): A molécula de DNA tem uma estrutura tridimensional enrolada em forma de dupla hélice. As duas cadeias que a constituem estão unidas através de ligações de pontes de hidrogénio entre nucleótidos complementares, estes por sua vez unidos entre si por grupos fosfato. Cada nucleótido no DNA é composto por uma base azotada (adenina, timina, citosina ou guanina), um açúcar (desoxiribose) e um grupo fosfato, todos ligados por ligações covalentes. As adeninas (A) de uma cadeia ligam-se sempre às timinas (T) da cadeia complementar e as citosinas (C) emparelham sempre com as guaninas (G) e viceversa. É através de ligações de hidrogénio entre as bases azotadas, 2 ou 3 ligações dependendo do par de bases emparelhado, que as duas cadeias se unem. Cada cadeia de DNA tem uma extremidade 5 e outra 3. Cada grupo fosfato liga o carbono na posição 3 de um açúcar ao carbono 5 do açúcar seguinte. A informação contida na sequência de DNA (os genes e sequências reguladoras) lê-se da extremidade 5 para a 3. As duas cadeias de DNA estão dispostas paralelamente e correm em sentidos opostos dizem-se antiparalelas: o nucleótido da extremidade 5 de uma cadeia liga-se ao nucleótido da extremidade 3 da cadeia complementar. A composição química das bases azotadas permite, através de ligações de hidrogénio, que outras moléculas se liguem ao DNA, nomeadamente proteínas importantes na sua replicação e na expressão dos genes. 14

15 III. Regulação da expressão génica - Os processos de regulação da expressão dos genes determinam a identidade e funcionamento das células. - Sequências de nucleótidos não-codificadores (p.ex. promotores e reguladores situados a montante dos promotores) funcionam como locais de ligação a proteínas (RNA polimerase, indutores e repressores) cuja interação com o DNA determina a transcrição dos genes (a jusante dos promotores). - Nos eucariontes existem outros mecanismos celulares que também regulam a expressão génica. São eles: 1) o estado de condensação da cromatina uma maior ou menor condensação da cromatina aumenta ou diminui o acesso da RNA polimerase ao promotor e, consequentemente, ativa ou inibe a transcrição de um determinado gene; 2) o processo de excisão alternativa a remoção de diferentes intrões a uma mesma molécula de pré-mrna -, permite que um mesmo gene transcrito origine duas proteínas distintas. IV. Mutações - Qualquer dano, à estrutura química do DNA, se não for reparado, resultará na perda da integridade e, potencialmente, da estabilidade da molécula. Alterações na identidade dos nucleótidos resultam em mutações, com efeitos benéficos ou prejudiciais para o indivíduo (ou ser vivo). Entre as mutações benéficas incluem-se aquelas que conferem vantagens na adaptação ao meio ambiente (p.ex. mutações que tornam bactérias resistentes a antibióticos). Várias doenças, por outro lado, resultam diretamente de mutações (p.ex. a anemia falciforme). - Uma mutação nem sempre resulta num efeito no organismo. As células (eucarióticas e procarióticas) ao longo da evolução desenvolveram mecanismos capazes de detetar e reparar os vários erros que podem ocorrer no DNA, sejam eles provocados por condicionantes externas, como a radiação UV ou o fumo do tabaco, ou fatores internos, como erros na replicação do DNA durante a divisão celular. V. e a Biotecnologia A descoberta do DNA permitiu não só compreender como as células regulam o seu metabolismo mas também como as características hereditárias são transmitidas entre gerações. Para além das implicações diretas no conhecimento da biologia das células, as conclusões de estudos do DNA têm permitido grandes avanços na compreensão da genética Todas as células de um organismo têm a mesma composição genética. Em cada tipo celular, é a ativação (i.e., a transcrição) de uns genes em deterimento de outros que vai determinar a identidade da célula. Por exemplo, uma célula da pele é uma célula da pele e não uma célula nervosa porque os mesmos genes são expressos (estão ligados ) na célula da pele mas não são expressos (estão desligados ) na célula nervosa, e viceversa. A membrana celular, que separa cada célula do exterior, constitui uma dupla barreira para a célula: por um lado, mantém a integridade dos seus constituintes e, por outro, impede os compostos de passarem livremente de e para a célula. Recorde com os seus alunos os seguintes conceitos: organismos geneticamente modificados; clonagem; sequenciação. 15

16 Mais sobre ratinhos knockout em learn.genetics.utah.edu/ content/tech/transgenic/ Outro tipo de técninas usadas em Biotecnologia: - Técnica de DNA recombinante; - Produção de bactérias geneticamente modificadas; - Síntese de DNA complementar; - Electroforese; - PCR. de doenças. Paralelamente, tem possibilitado o aparecimento de inovadoras práticas biotecnológicas com impacto relevante, não só em procedimentos de investigação básica como aplicada - a Biotecnologia. O sector da indústria farmacêutica, por exemplo, tem beneficiado de todo o conhecimento desde que se descobriu o DNA e o código genético: hoje em dia é possível, a partir do DNA, produzir grandes quantidades de proteínas importantes para o tratamento de doenças, acessíveis a todos na forma de vacinas e/ou medicamentos. Repercussões semelhantes foram sentidas nas áreas do ambiente e agricultura. Isolar e purificar DNA de células animais ou plantas, de fungos ou bactérias é tarefa diária dos investigadores em Biologia Molecular, quer para aqueles que procuram compreender a origem de certas doenças humanas como os que, por exemplo, procuram melhorar a produtibilidade de determinada planta. Através do seu isolamento, os cientistas conseguem obter e estudar genes que de outro modo seriam difíceis de aceder, devido às restrições impostas pela própria constituição química e biológica das células. Uma vez isolado o DNA, os cientistas conseguem por deleção de determinado gene inativar a função desse gene nas células. A inserção do gene mutado nas células faz-se com a produção de organismos designados knockout (é comum utilizar-se o ratinho, a mosca da fruta e plantas). É assim que os cientistas conseguem estudar o efeito daquele gene mutado no funcionamento das células. Uma vez isolado o DNA, é possível aumentar a função de determinado gene, quer por inserção de cópias extra do gene ou por aumento da síntese da proteína por si expressa. Desta forma, os cientistas conseguem analisar em maior detalhe a função do gene. A técnica comummente usada para extrair DNA é a prova viva de que, algures na história recente da ciência, foram ultrapassadas as barreiras impostas pela célula e que nos separavam do DNA. Desde que esta possibilidade surgiu, as técnicas de biologia molecular foram melhoradas e novas foram introduzidas Biotecnologia -, sendo hoje possível manipular, modificar, clonar e/ou multiplicar genes Engenharia Genética. A visualização da estrutura em dupla-hélice da molécula de DNA não é possível a olho-nu e nem mesmo o microscópio mais potente consegue captar essa imagem. Só através de uma técnica de cristalografia por difração de raios-x é possível obter imagens que revelam a sua estrutura. Esta foi a mesma técnica que Rosalind Franklin (conhecida biofísica britânica) usou quando, um pouco antes da publicação do modelo proposto por J. Watson & F. Crick, apresentou, junto da comunidade científica uma fotografia de um cristal de ADN. Foi nesta fotografia que Watson e Crick se basearam em grande parte para construir o modelo teórico da dupla hélice. 16

17 - FOLHA DE REGISTO (GRUPO OU INDIVIDUAL) - Nome da atividade: Membros do grupo: O que sabemos sobre este tema? O que ainda não sabemos e queremos descobrir? Como podemos descobrir? O que observámos? O que aprendemos? 17