Raymundo, A.J.V., Hoezel, S.C.S., Volkmer, T.M.

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1 UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE ELETROSPINNING PARA OBTENÇÃO DE SCAFFOLDS A BASE DE POLI (ε-caprolactona) PARA USO EM ENGENHARIA DE TECIDOS Raymundo, A.J.V., Hoezel, S.C.S., Volkmer, T.M. USE OF ELETROSPINNING TECHNIQUE FOR THE OBTAINMENT OF POLY(ε - CAPROLACTONE ) BASED SCAFFOLDS FOR USE IN TISSUE ENGINEERING RESUMO Existem vários estudos focando em fabricação de nano fibras poliméricas, onde o mais utilizado é o processo de electrospinning. Esta técnica é capaz de produzir scaffolds com um diâmetro de fibras controlado, área superficial elevada, e estrutura porosa. A técnica consiste na aplicação de uma diferença de potencial elevada entre solução de polímero colocada em uma seringa e uma placa coletora, formando, assim, fibras de tamanho nanométrico. Este trabalho utilizou a poli-ε-caprolactona por se tratar de um biopolímero biocompatível e possuir uma degradação muito lenta no organismo, então o objetivo é fabricar scaffolds a base deste polímero via electrospinning Para a síntese dos scaffolds o polímero foi dissolvido em acetona, em uma concentração de 15%, variando-se a diferença de potencial e da distância entre a seringa contendo a solução polimérica e o alvo. Para a caracterização destes foi utilizado a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), teste de absorção d água, o diâmetro da fibra e a viabilidade celular, que nos comprovará se o material tem potencial para atuar na engenharia de tecidos. Palavras-chave: electrospinning, poli(ε-caprolactona) (PCL), scaffolds. INTRODUÇÃO O processo de cicatrização e remodelagem óssea é alcançado por um complexo sistema onde, o desempenho coordenado de células, controle hemodinâmico de fatores bioativos, estrutura e composição da matriz extracelular nativa induzem uma cascata de sinalização químico-biológica que proporcionam a reparação do tecido através da proliferação, diferenciação e migração de células osteoprogenitoras (NIU et al., 2009). Dessa forma, a capacidade de reproduzir e manipular in vitro esse processo em uma escala espaço-temporal similar ao do tecido nativo proporcionaria um grande potencial e sucesso clínico de aplicação da mais ampla gama de biomateriais disponíveis 733

2 comercialmente bem como estratégias adotadas na engenharia tecidual e medicina regenerativa. (MARQUESet al., 2013). Condizente com esta abordagem, a fabricação de scaffolds poliméricos biorreabsorvíveis e hidrolíticamente degradáveis, pertencentes à classe dos poliésteres alifáticos, estão sendo amplamente investigados como scaffolds na engenharia tecidual devido à inerente propriedade de serem biocompatíveis, sofrerem hidrólise no organismo, viabilizando, portanto, o processo de reconstrução tecidual e ainda, apresentarem facilidade de processamento e modulação da taxa de degradação, propriedades mecânicas e visco-elásticas (RATNERet al., 2013). Nanofibras poliméricas são um material extremamente atrativo devido ao amplo espectro de aplicações devido a sua grande razão entre a área superficial em relação ao volume e a sua arquitetura única na nanoescala construída por elas. Seu potencial de aplicação inclui scaffolds para engenharia de tecidos, meios para a liberação de fármacos, meio de filtração, tecidos protetivos, entre outros. É sabido que as propriedades e estrutura molecular interna de polímeros é fortemente afetada pelas condições de processamento. Assim, o entendimento da relação processamento estrutura propriedade é de suma importância para o desenvolvimento de nanofibras poliméricas que cumpram as demandas da aplicação desejada (INAIet al., 2013). Electrospinning é uma técnica única e versátil que permite a produção de nanofibras poliméricas com potencial para serem aplicadas na substituição de tecidos em engenharia de tecidos (KUCINSKA-LIPKAet al., 2015). O método consiste na aplicação de uma diferença de potencial em uma solução de polimérica em algum solvente (a solução pode conter uma carga cerâmica). A solução polimérica é colocada em uma seringa, na qual é aplicada uma força N, suficiente para gerar um jato em direção à uma placa coletora metálica. Quando se aplica uma diferença de potencial (DDP) entre a placa coletora e a seringa, a solução é atraída eletrostaticamente para o alvo metálico e, então, jatos muito finos do líquido espirram em direção ao alvo, devido à formação de uma região instável no jato. O solvente rapidamente evapora e fibras nanométricas são formadas na placa coletora metálica, formando um emaranhado de fibras. Através da variação de parâmetros como voltagem, taxa de injeção da solução polimérica e distância entre a seringa e o alvo metálico é possível obter fibras de diâmetro na escala de nanômetros até micrometros. (GAUMERet al., 2009). O presente trabalho visou desenvolver scaffolds a base de Poli-ε- Caprolactonapara aplicação em engenharia de tecidos a partir da técnica de electrospinning. Onde se tomou como parâmetro três diferentes concentrações de PCL, distâncias entre agulha e o coletor e a DDP utilizada, e para a caracterização destes scaffols foi utilizado a Microscopia eletrônica de varredura (MEV), o teste de absorção de água da fibra, o ensaio de molhabilidadee o ensaio preliminar de viabilidade celular, para nos provar se o biopolímero utilizado é de fato um biomaterial e se possui potencial para o uso em engenharia de tecidos. 734

3 METODOLOGIA MATERIAIS Os materiais foram utilizados como recebidos. Para a fabricação dos scaffolds foi utilizado o polímero Poli-ε-Caprolactona da Marca Merck e peso molecular entre K.e o solvente acetona da marcasynth e peso molecular de 58,08g/mol SÍNTESE DOS SCAFFOLDS DE POLI-ε-CAPROLACTONA No equipamento do eletrospinning uma solução polimérica contida em uma seringa é propulsionada por uma bomba ou por gravidade, a agulha da seringa está eletricamente ligada ao polo positivo de uma fonte de alta tensão. O coletor, ligado à terra, atrai a solução ejetada pela agulha e recolhe a fibra criada eletroestaticamente, conforme mostra a Figura 1. Figura 1. Esquema do equipamento de electrospinning. Para a preparação de uma solução polimérica contendo Poli-ε- Caprolactona dissolveu-se este polímero em acetona com concentração de 15% (m/v) a 50 C usando-se uma chapa aquecedora, e agitação magnética até o 735

4 polímero estar completamente solúvel. Esta solução foi transferida para uma seringa de 5mL com agulha de gauge 18. As amostras foram preparadas a partir da variação da diferença de potencial (DDP) aplicada entre a solução polimérica e o alvo no qual as nanofibras serão formadas e da distância entre a solução polimérica e a placa alvo. Para as primeiras 3 amostras, fixou-se a distância em 15cm e variou-se a DDP aplicada (10, 15 e 20KV). Posteriormente fixou-se a DDP em 20KV e se variou a distância entre a agulha e a placa coletora em (10, 12,5 e 15cm). A Tabela 1 resumeos parâmetros estudados. Tabela 1. Parâmetros estudados par a confecção dos scaffolds de Poli-ε- Caprolactona Reação Distância (cm) Voltagem (KV) , CARACTERIZAÇÃO DOS SCAFFOLDS Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) O uso da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) nos forneceu informações sobre a morfologia das amostras, onde análise da morfologia foi realizada por MEV da marca JEOL, modelo JSM-6060, do Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Previamente as análises as amostras foram submetidas a aplicação de uma fina camada de ouro via sputtering. Com as micrografias de MEV mediu-se o tamanho médio de fibras utilizando-se o software Image J. Pelo menos 10 fibras foram medidas por amostras e plotou-se um gráfico de frequência média de tamanho. Absorção de água A absorção de água da fibra foi medida para ver a quantidade que pode ser absorvida, a qual depende, principalmente, a hidrofilicidade da mesma. As fibras antes imersas em água deionizada foram cortadas em 2x1 cm. Posteriormente foram removidas no intervalo de 1 min, foi limpa suavemente com papel de seda, 736

5 e pesado. O processo foi repetido durante 10 minutos. Então a absorção foi calculada usando a seguinte equação (1): em que representa o peso da fibra molhada e é o peso seco inicial da fibra. Molhabilidade Para o ensaio de molhabilidade sobre a superfície plana dos materiais secos foi posicionada uma gota 10 μl de água deionizada. O ângulo de contato entre a fase sólida - polímero - e a fase líquida - água foi medido pelo software Image J. Viabilidade celular Um ensaio preliminar de viabilidade celular foi realizado, onde primeiramente, as amostras foram esterilizadas sob luz UV, onde as amostras foram cortadas em 1x1cm e colocadas em placa de 6 poços, então estes foram colocados sob luz UV por 30min. As placas foram cultivadas e mantidas sobcondições padrões em estufa (37 C, 95% de umidade e CO 2 5% durante todo o experimento). Para o cultivo das células, o meio de cultura foi removido e a película de células no fundo do frasco foi lavada com tampão fosfatosalino(pbs, do inglês Phosphate Saline Buffer) duas vezes, então as células foram removidas do frasco por exposição a 1ml de tripsina a 37 C por 3-5 minutos, posteriormente foi adicionado 9ml de um novo meio de cultura e as células em suspensão foram transferidas para um tubo de centrifuga, onde as células foram precipitadas por centrifugação por 5 minutos a 1500 rpm, o que procede o processo de resuspensão. Em seguida foi feita a contagem de células em suspensão com o uso de Câmara de Neubauer, feito isso as células foram transferidas para os poços de cultura através de um micropipetador. Para a observação da população celular sobre as amostras e o controle foi antecedida a coloração azul de toluidina. As amostras foram transferidas para nova placa de cultura de 6 poços e lavadas com PBS duas vezes para e eliminação total do meio de cultura, então foi adicionado sobre a amostra 300µL de solução de PBS aditivada com 4% de p-formaldeido, após 15 minutos a solução foi retirada e as amostras foram lavadas novamente com PBS. Feito isso cada amostra foi exposta a uma solução de 1% de azul de toluidina por 1 minuto. As amostras foram visualizadas em microscópio óptico. (1) 737

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO Com as imagens obtidas através da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), podemos notar que os resultados da síntese apresentaramuma estrutura porosa 3D com porosidades interconectadas feita de um emaranhado de fios, com formato similar a uma teia de aranha. A Figura 2 mostra micrografias de cada amostra sintetizada pela variação dos parâmetros estudados e ao seu lado a distribuição de tamanho das fibras, a qual foi calculada pelo uso do software Image J através da medição do tamanho de no mínimo 15 fibras para cada amostra. A análise das imagens nos mostra que o diâmetro das fibras variou entre 0,5 a 10 µm para as amostras analisadas. A Tabela 1 mostra o tamanho médio Figura 2.Micrografias obtidas por MEV e distribuição de diâmetro das amostras Parâmetros estudados par a confecção dos scaffolds de Poli-ε- Caprolactona (A) e (B) 15%-12,5cm-20kv, (C) e (D) 15%-15cm-10kv, (D) e (E) 15%-15cm-15kv, (F) e (G) 15%-15cm-20kv, (I) e (J) 15%-10cm-20kv 738

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8 O diâmetro médio das fibras ficou em torno de 3,7989µm, o que nos mostra que tanto a porosidade como o diâmetro das fibras tiveram diferentes tamanhos devidos os diferentes parâmetros utilizados, nos remetendo a que conforme mantem-se fixado uma concentração e altera a voltagem, e distância entre a placa coletora e agulha, pode-se obter scaffolds com fibras de tamanhos controlados, podendo obter scaffolds com tamanho de fibra e tamanho de poros controlados, visando utilizar esses dados como forma de decidir em que área utilizar tais scaffolds. Tabela 1-Tamanho de fibra AMOSTRAS TAMANHO MÉDIO DAS TAMANHO MODAL FIBRAS (µm) (µm) 12,5cm-20kv 6, cm-10kv 2, cm-15kv 3, cm-20kv 4, /3-4 10cm-20kv 1, G O teste de absorção de água nos mostrado na figura 3. As diferentes razões de absorção podem ser entendidas como resultado das diferentes interações iônicas que ocorrem na presença de água destilada (em ph 5,6). A água é extremamente polar, com constante dielétrica de 78,54 a temperatura ambiente, o que mostra que tal polímero possui afinidade com estruturas polares. Outro aspecto que contribui para uma maior retenção de água é a estrutura porosa que constitui os scaffolds analisados. Os poros facilitam a permeação e subsequente retenção de água na matriz polimérica. Esta retenção se deve pela estrutura porosa do scaffoldque pode ser entendida como consequência do intumescimento no filme, que gera um inchaço no interior do scaffold. (ASSIS; SILVA, 2003, p.) 740

9 Figura 3. Absorção de água dos scaffolds obtidos por electrospinning. Para avaliar-se a hidrofobicidade, foi medida a molhabilidade dos scaffolds. O ângulo de molhamento, mostrado na figura 4, foi maior do que 90, indicando que o material obtido é hidrofóbico. Tal fato, ajuda a explicar que a absorção de água no scaffold tem uma contribuição muito maior por parte da porosidade do scaffold do que pela natureza química do polímero. Figura 4. Ângulo de contato do scaffolds obtidos por electrospinning de composição Após as análises O teste prévio mostrou que as células se aderiram ao scaffold e se proliferaram com bastante sucesso, observamos que apenas nos pontos mais escuros (Figura 5) onde encontraram células mortas, mostrando que talmaterial apresenta potencial para atuar como um biomaterial. 741

10 Figura 5- Células Aderidas no Scaffold (Células mortas, destacadas na figura) CONCLUSÃO O produto resultante da síntese foi uma estrutura porosa 3D com porosidades interconectadas feita de um emaranhado de fios, com formato similar a uma teia de aranha. O diâmetro médio das fibras ficou entre 0,5 e 10 µm e as porosidades apresentaram tamanho entre 10 e 50 µm para todas as amostras sintetizadas. Como pode-se verificar pelos ensaios de absorção de água e molhabilidade, a força motriz para o aumento da absorção de água é a porosidade dos scaffolds. Os ensaios preliminares in vitro, mostram que estes materiais são biocompatíveis. Em suma, os resultados indicam que os scaffolds de PCL sintetizados via electrospinning apresentam potencial para sua aplicação em engenharia de tecidos. 742

11 REFERÊNCIAS ASSIS, O. B. G.; SILVA, V. L. Caracterização Estrutural e da Capacidade de Absorção de Água em Filmes Finos de Quitosana Processados em Diversas Concentrações. Polímeros: Ciência e Tecnologia, São Paulo, v.13, n.4, p , GAUMER, J., PRASAD, A., LEE, D., LANNUTTI, J., Structure function relationships and source-to-ground distance in electrospunpolycaprolactone, ActaBiomaterialia, v.5 n.5, p , INAI, R., KOTAKI, M., RAMAKRISHNA, S., Structure and properties of electrospun PLLA single nanofibres. Nanotechnology, V.16, p , 2013 KUCINSKA-LIPKA, J., JANIK, G.H., SIENKIEWICZ, Fabrication of polyurethane and polyurethane based composite fibers by the electrospinning technique for soft tissue engineering of cardiovascular system.materials Science and EngineeringC, v.46, p , MARQUES, D. R. ; SANTOS, L.A. ; VOLKMER, T. M.. Encyclopedia of Biomedical Polymers and Polymeric Biomaterials.1. ed. New York: Taylor & Francis, NIU, X.; FENG, Q.; WANG, M.; GUO, X.; ZHENG, Q. In vitro degradation and release behavior of porous poly(lactic acid) scaffolds containing chitosan microspheres as a carrier for BMP-2-derived synthetic peptide. Polymer Degradation and Stability, V.94, p , RATNER, B. D. (Ed.). Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier,