EDIANE RONCAGLIO BASEGGIO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA FRONTEIRA SUL CAMPUS ERECHIM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL EDIANE RONCAGLIO BASEGGIO EXTRATOS VEGETAIS E COMPOSTOS VOLÁTEIS NO CONTROLE DE Monilinia fructicola IN VITRO E DA PODRIDÃO PARDA NA PÓS-COLHEITA DE PÊSSEGOS ERECHIM 2016

2 EDIANE RONCAGLIO BASEGGIO EXTRATOS VEGETAIS E COMPOSTOS VOLÁTEIS NO CONTROLE DE Monilinia fructicola IN VITRO E DA PODRIDÃO PARDA NA PÓS-COLHEITA DE PÊSSEGOS Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental da Universidade Federal da Fronteira Sul UFFS como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental sob a orientação do Prof. Dr. Clevison Luiz Giacobbo e Prof. Dr. Sc. Leandro Galon. ERECHIM 2016

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DA FRONTEIRA SUL Rua General Osório, 413D CEP: Caixa Postal 181 Bairro Jardim Itália Chapecó - SC Brasil

4 EDIANE RONCAGLIO BASEGGIO EXTRATOS VEGETAIS E COMPOSTOS VOLÁTEIS NO CONTROLE DE Monilinia fructicola IN VITRO E DA PODRIDÃO PARDA NA PÓS-COLHEITA DE PÊSSEGOS Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental da Universidade Federal da Fronteira Sul UFFS. Para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental, defendido em banca examinadora em 06/04/2016. Orientador (a): Prof. Dr. Clevison Luiz Giacobbo Prof. Dr. Sc. Leandro Galon Aprovado em 06/04/2016 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Clevison Luiz Giacobbo - UFFS Orientador Prof. Dr. Sc. Leandro Galon - UFFS Orientador Prof. Dr. Sérgio Miguel Mazaro - UTFPR Prof. Dr. André Luiz Radünz - UFFS Erechim/RS, Abril de 2016

5 AGRADECIMENTOS A Deus que sempre ilumina e guia meus passos, e conforta nas horas de ansiedade. À Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS) pela oportunidade de realização do curso. À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pela concessão da bolsa de estudo Aos orientadores Dr. Clevison Luiz Giacobbo e Dr. Sc. Leandro Galon pela dedicação, paciência e ensinamentos não só teóricos e práticos, mas também de vida, hoje se sou uma pessoa melhor devo isso inclusive a vocês. Ao professor Dr. Sérgio Miguel Mazaro pela disponibilidade e ajuda, assim como a Micheli Preuss da Cruz e Gisely Correa de Moura da UTFPR Dois Vizinhos. Aos técnicos de laboratório Ângela, Flávia, Suzana e Glauber, pela paciência e ajuda A todas as pessoas que me ajudaram nos experimentos, principalmente as minhas amigas e pessoas inesquecíveis em minha vida, Gabriele Gaik Reik, Paola Mendes Milanesi e Paloma Alves da Silva Sexto. A minha família pela estimulo, paciência e ajuda em cuidar do Lorenzo. Em especial ao filho Lorenzo por entender e aceitar os momentos de ausência da mãe, como ele diz: a mãe precisa estudar, estudar.... E o esposo Everton por encorajar a cada dia a lutar pelos sonhos. Ao meu PAI (in memoria) por ser meu porto seguro, sei que onde estás me dá forças e coragem de seguir em frente, mesmo quando o caminho é árduo.. MUITO OBRIGADO!

6 Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes. Marthin Luther King

7 RESUMO A Monilinia fructicola causa a podridão parda em pessegueiros e se torna um fator limitante na produção e qualidade dos pêssegos, pois ocorre o apodrecimento dos frutos antes do amadurecimento ou diminui seu período de pós-colheita. Assim produtos alternativos como extratos vegetais e óleos essenciais apresentam potencial para o controle desta doença. Desta forma foram desenvolvidos dois trabalhos sendo um in vitro e outro em pós-colheita de pêssegos buscando avaliar o efeito dos extratos de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera), capim cidreira (Cymbopogon citratus), eucalipto (Eucalyptus globulus) e nim (Azadirachta indica), sobre o fungo Monilinia fructicola e no controle de podridão parda nos frutos. O primeiro trabalho foi in vitro, utilizando extratos aquosos autoclavados e não autoclavados sobre o crescimento micelial e a germinação de conídios de Monilinia fructicola. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco repetições cada, sendo a unidade experimental composta por uma placa de Petri. O fungo foi isolado a partir de frutos infectados em meio BDA (Batata-Dextrose-Ágar). Os extratos aquosos foram confeccionados utilizando 20 g do material vegetal para 100 ml de água destilada. Após diluído em meio BDA nas concentrações 0, 5, 10, 15 e 20%. Com a solidificação do meio, colocou-se discos de 0,5 cm de diâmetro, contendo o micélio e conídios do patógeno no centro de cada placa. Para avalição do óleo essencial avaliou-se a dose de 20 μl de cada óleo essencial, obtido por hidrodestilação, aplicados em papel filtro esterilizado, fixado no centro da tampa da placa de Petri. As placas foram vedadas, incubadas em BOD a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h. Após 24 h iniciou-se a mensuração do crescimento micelial por 7 dias. No trabalho em pós-colheita de frutos o delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições, sendo a unidade experimental composta por 7 frutos. Os frutos, sem lesões e sem sintomas de podridão parda, foram colhidos, desinfestados e secos a temperatura ambiente. Em seguida mergulhados nos extratos por 30 min e armazenados em BOD a 25 ºC, fotoperíodo de 12 h, por 24 h. Após foi inoculado M. fructicola na concentração 2x10 5 conídios ml -1. Depois da inoculação os frutos permaneceram em condições controladas e após 24, 48 e 72 h a inoculação coletou-se amostras do fruto com aproximadamente 1 cm² e 0,5 cm de profundidade. Após esse período foi realizada a mensuração do teor de proteínas, açúcares totais e redutores, atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase (FAL), β-1,3-glucanase e quitinase. Ainda, avaliou-se o percentual de podridões dos frutos. Os resultados demonstraram no experimento in vitro que todos os extratos, bem como o efeito volátil, possui potencial sobre a redução do crescimento micelial M. frutícola, sendo que tal ação apresenta especificidade de resposta em função das concentrações. Quanto ao efeito sobre a produção de esporos, tal potencial também é demonstrado, com exceção do extrato de arruda. Entre os extratos avaliados o de alho demonstrou destaque na supressão do crescimento micelial e esporulação do patógeno. No experimento em pós-colheita os resultados demonstraram que os extratos avaliados, possuem potencial de induzir a resistência dos frutos à podridão parda, ativando as enzimas quitinase e fenilalanina amônia-liase. No entanto, o extrato de alho, além de demonstrar destacável potencial de ativar tais mecanismos de defesa, atua na redução da podridão de frutos de pêssego causada por M. fructicola. Palavras-chave: Monilinia fructicola. Prunus persica. Controle alternativo.

8 ABSTRACT The Monilinia fructicola causes the brown rot in peaches and becomes a limiting factor in the production and quality of peaches, it is the fruits of rot before ripening or decrease your postharvest period. Thus alternative products such as plant extracts and essential oils have the potential to control this disease. Thus they were developed two works being an in vitro and another in post-harvest peaches seeking to evaluate the effect of garlic extract (Allium sativum), rue (Ruta graveolens), coot (Baccharis trimera), grass - lemongrass (Cymbopogon citratus) eucalyptus (Eucalyptus globulus) and neem (Azadirachta indica), on the fungus Monilinia fructicola and control of brown rot on fruit. The first job was in vitro using aqueous extracts autoclaved and not autoclaved on mycelial growth and germination of conidia of M. fructicola. The experimental design was completely randomized, with five replications, and the experimental unit composed of a Petri board. The fungus was isolated from infected fruit on PDA (Potato-Dextrose-Aagar). The aqueous extracts were made using 20 g of plant material per 100 ml of distilled water. After diluted in PDA medium at concentrations of 0,5, 10, 15 and 20%. With the solidification placed 0,5 cm diameter disks containing the mycelium and conidia of the pathogen in the center of each plate. To evaluate the essential oil evaluated the dosage of 20 μl of each essential oil obtained by hydrodistillation, applied to filter paper sterile, fixed in the center of Petri board cover. Plates were sealed, incubated in BOD at 25 C and photoperiod of 12 h. After 24 h began measuring the mycelial growth for 7 days. At work in fruit postharvest experimental design was completely randomized, with four replications, and the experimental unit consisting of 7 fruits. The fruits, without injuries and symptoms of brown rot were collected, disinfected and dried at room temperature. Then dipped in the extracts for 30 min and stored in a chamber at 25 C, 12 h photoperiod for 24 h. After inoculated M. fructicola in concentration 2x10 5 conidia ml -1. After inoculation fruits were under controlled conditions and after 24, 48 and 72 h inoculation is collected fruit samples of about 1 cm² and 0,5 cm deep. After that was done to measure the protein content, total and reducing sugars, activity of enzymes phenylalanine ammonia lyase (PAL), β-1,3- glucanase and chitinase. Still, it was evaluated the percentage of rottenness of the fruits. The results demonstrated in vitro experiment all the extract and the volatile effect has the potential for reducing the M. fructicola mycelial growth, and such action has specific response in different concentrations. As to the effect on the production of spores, such potential is also shown, with the exception of arruda extract. Among the extracts evaluated the garlic has shown highlighted in the suppression of mycelial growth and sporulation of the pathogen. In the experiment in post-harvest the results showed that the extracts evaluated, have the potential to induce resistance to brown rot of fruits, activating the chitinase enzymes and phenylalanine ammonia lyase. However, the garlic extract, besides demonstrating detachable potential to activate such defense mechanisms, works to reduce the peach fruit rot caused by M. fructicola. Keywords: Monilinia fructicola. Prunus persica. Alternative control.

9 LISTA DE ILUSTRAÇÃO Figura 1 - FCrescimento micelial (cm) de Monilinia fructicola em diferentes concentrações de extrato autoclavado e não autoclavado de alho, arruda, carqueja e nim, em função do tempo de incubação Figura 2 - Crescimento micelial (cm) de Monilinia fructicola em relação aos compostos voláteis de alho, arruda, carqueja e nim em função do tempo de incubação Figura 3 - Incidência (%) de podridão parda em pêssegos tratados em pós-colheita com extrato aquoso de alho, arruda, carqueja e nim em função do tempo de avaliação... 41

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Tabela 2 - Tabela 3 - Tabela 4 - Tabela 5 - Tabela 6 - Tabela 7 - Equações, coeficiente de determinação e probabilidade para o crescimento micelial de Monilinia fructicola sob diferentes concentrações de extratos autoclavados ou não de alho, arruda, carqueja e nim, em função do tempo de incubação Efeito dos extratos autoclavados de alho, arruda, carqueja e nim em diferentes concentrações sobre a porcentagem de inibição do desenvolvimento micelial de Monilinia fructicola Efeito dos extratos não autoclavados de alho, arruda, carqueja e nim em diferentes concentrações sobre a porcentagem de inibição do desenvolvimento micelial de Monilinia fructicola Efeito dos compostos voláteis de alho, arruda, carqueja e nim sobre a porcentagem de inibição do desenvolvimento micelial de Monilinia fructicola Efeito dos melhores extratos vegetais autoclavado e não autoclavado, verificado para a inibição do crescimento micelial em diferentes concentrações sobre a produção de esporos de Monilinia fructicola Efeito dos compostos voláteis dos óleos essenciais sobre a produção de esporos de Monilinia fructicola Teor de proteína, atividade da enzima quitinase e atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL) presente em pêssegos tratados em póscolheita com extrato aquoso de alho, arruda, carqueja e nim em função do tempo de avaliação... 42

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL METODOLOGIA GERAL ARTIGO 1 - EXTRATOS VEGETAIS E COMPOSTOS VOLÁTEIS DE ÓLEOS ESSENCIAIS NA INIBIÇÃO DO DESENVOLVIMENTO DE Monilinia fructicola IN VITRO RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Isolamento e cultivo de M. fructicola Obtenção dos extratos vegetais aquosos e óleos essenciais Efeito dos extratos vegetais e compostos voláteis dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial de Monilinia fructicola Inibição da esporulação de M. fructicola Delineamento experimental RESULTADOS E DISCUSSÃO Inibição do crescimento micelial de Monilinia fructicola Inibição da esporulação de Monilinia fructicola CONCLUSÃO AGRADECIMENTO REFERÊNCIAS ARTIGO 2 - INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA À PODRIDÃO PARDA DE PESSEGUEIRO COM USO DE EXTRATOS VEGETAIS EM PÓS-COLHEITA RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO AGRADECIMENTO REFERÊNCIAS CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 49

12 12 1 INTRODUÇÃO GERAL O pessegueiro (Prunus persica) originário da China foi introduzido no Brasil por Martin Afonso de Souza, sendo implantado no Estado de São Paulo. Por ser uma cultura de clima temperado se adaptou nessa região nos locais mais favoráveis, porém encontrou nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e parte do Paraná as melhores condições para sua expansão (MADAIL; RASEIRA, 2008). Apesar da persicultura estar se difundindo para outros estados do País com temperatura mais elevada, sua área diminuiu 10,85% entre os anos de 2010 e 2013, porém sua produtividade aumentou em 9,8% no mesmo período (FAOSTAT, 2016). Fato que pode ser atribuído a pesquisas que melhoram a produtividade, os manejos e tecnologias de melhoramento genético para que o pessegueiro se desenvolva em clima tropical e adquira resistência genética à podridão parda, que é a maior causa de perda econômica aos produtores de pêssego, devido a diminuição da capacidade produtiva do pomar e da sanidade dos frutos. A podridão parda (Monilinia fructicola (Wint) Honey) ataca as partes aéreas das plantas de pessegueiro, causando sintomas, como o pardeamento e morte das flores, ficando aderentes ao pedúnculo por tempo indeterminado (GARRIDO; SÔNEGO, 2003). Nos ramos e nos galhos ocorrem lesões e cancros podendo causar a morte destes (WAGNER JÚNIOR, 2003). Enquanto que nos frutos, os sintomas iniciam com pequenas manchas circulares e pardas, geralmente nos locais com injurias, que se unem até criar ampla zona mole e parda, em poucos dias, o fruto está completamente infectado, ficando recoberto por massa cinza, pulverulenta de esporos, estes aparecem rapidamente na superfície do fruto, sendo disseminado pelo vento, chuva e insetos (OGAWA et al., 1995; MAY-DE MIO et al., 2004). Caso os frutos sejam deixados na planta se desidratam e mumificam na planta ou caem ao solo permanecendo todo o inverno, liberando os conídios que formam o inóculo primário na primavera (AGRIOS, 1997; FORTES; MARTINS, 1998). O controle do fungo é realizado basicamente com uso de fungicidas. No entanto, a utilização indiscriminada está se mostrando ineficiente, devido ao elevado número de aplicações, muitas vezes uso de sub ou super doses, além da aplicação de produtos não recomendados para a cultura, podem ter levado o patógeno a adquirir resistência a determinados fungicidas (SANTOS et al., 2006). Dessa forma faz-se necessário estudos buscando novas formas de controle da podridão parda com produtos alternativos, que não agridem a saúde humana e o agroecossistema, além de auxiliar os produtores orgânicos. Segundo Matos (1997) a exploração da atividade de

13 13 compostos secundários de plantas, como extrato, óleo essencial ou pó tem se tornado uma alternativa para o controle de fitopatógenos com objetivo de substituir os químicos, pois possuem substâncias com propriedades fungicidas e/ou fungitóxicas. Stangarlin et al. (1999) descrevem que os compostos possuem vantagens, como: ser geralmente menos prejudiciais ao homem e ao meio ambiente; com menores custos aos produtores; as plantas para extração das substâncias estão facilmente disponíveis aos agricultores; em alguns casos podem superar os produtos sintéticos em sua ação antimicrobiana; quase não apresentar problemas de resistência genética aos fitopatógenos; apresentar seletividade, causando menos danos devido ao baixo efeito residual e baixa fitotoxicidade. Porém oferecem algumas desvantagens: rápida degradação em condições de alta luminosidade, umidade e chuva, exigindo várias aplicações para se obter o controle satisfatório; pouca disponibilidade comercial; falta de dados de pesquisa quanto à eficácia, efeitos secundários, toxicidade crônica e variabilidade dos efeitos das substâncias da planta, devido a variáveis como a espécie, cultivar, elementos climáticos (luz, temperatura, umidade relativa e chuvas), posição geográfica do cultivo (latitude e altitude), qualidade do solo, tratos culturais, fenologia da planta, horário do dia que ocorreu a coletada, e se esta sofreu algum tipo de estresse, entre outros (CARVALHO et al., 1999). Assim para que os extratos possam ser utilizados no controle de moléstias faz-se necessário estudos que comprovem a sua eficiência, com seu potencial de inibição através da ação fungitóxica direta, pela inibição da germinação de esporos e crescimento micelial (BETTIOL; MORANDI, 2009). Além do controle direto do patógeno, ou seja, da aplicação dos extratos no patógeno, seja in vitro ou in vivo, os extratos vegetais também possuem ação indireta, agindo como eliciadores externos, quando ativam os mecanismos de defesa que se encontram latente na planta ou nos frutos, ativando a resistência sistêmica adquirida (RSA) na defesa contra o patógeno (DURRANT; DONG, 2004). A RSA é caracterizada pela expressão de genes que codificam respostas de defesa à patógenos nas plantas, como as proteínas relacionadas à patogenicidade (proteínas-pr) dentre as quais quitinases e β-1,3 glucanases; enzimas envolvidas na rota da síntese de fitoalexinas, como fenilalanina amônia-liase (FAL); acúmulo de lignina em tecidos adjacentes ao local de penetração do microrganismo (DURRANT; DONG, 2004). Segundo Oliveira et al. (2001) as proteínas-pr ativadas pelos indutores como as hidrolases β-1,3-glucanase e quitinase, promovem a desorganização da parede celular dos

14 14 patógenos, enquanto que, as peroxidases e a FAL, estão diretamente envolvidas no processo de lignificação da parede celular. Devido as grandes perdas econômicas causadas pela podridão parda em pessegueiros e a busca por frutos com menor residual de produtos químicos na pós-colheita, este trabalho foi realizado com o objetivo geral de avaliar o potencial de extratos vegetais e compostos voláteis no controle de Monilinia frutícola in vitro e da podridão parda na pós-colheita de pêssegos. Os objetivos dos experimentos foram: Experimento 1: 1. Avaliar a atividade antifúngica in vitro dos extratos de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera), capim cidreira (Cymbopogon citratus), eucalipto (Eucalyptus globulus) e nim (Azadirachta indica), com e sem autoclavagem, sobre o crescimento micelial e esporulação de Monilinia fructicola; 2. Testar os compostos voláteis liberados a partir do óleo essencial de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera) e nim (Azadirachta indica), sobre o crescimento micelial e esporulação de Monilinia fructicola. Experimento 2: 3. Avaliar o potencial dos extratos vegetais de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Braccharis trimera) e nim (Azadirachta indica), aplicados em póscolheita de pêssegos, na ativação da indução de resistência sobre a podridão parda nos frutos. 2 METODOLOGIA GERAL Foram desenvolvidos dois trabalhos sendo um in vitro e outro em pós-colheita de pêssegos buscando avaliar o efeito dos extratos de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera), capim cidreira (Cymbopogon citratus), eucalipto (Eucalyptus globulus) e nim (Azadirachta indica) sobre o fungo Monilinia fructicola e no controle de podridão parda nos frutos. Os mesmos foram executados na UFFS, campus Erechim/RS, sendo que as análises bioquímicas do segundo experimento no laboratório de fitopatologia da UTFPR, campus Dois Vizinhos/PR. No experimento 1, testou-se os extratos aquosos de alho, arruda, carqueja, capim cidreira, eucalipto e nim, com e sem autoclavagem in vitro, sobre a inibição do desenvolvimento micelial e esporulação de M. fructicola. Também avaliou-se o efeito dos compostos voláteis liberados a partir do óleo essencial de alho, arruda, carqueja e nim sobre o desenvolvimento e esporulação do fungo.

15 15 No experimento 2, utilizou-se os extratos aquosos de alho, arruda, carqueja e nim aplicados na pós-colheita de pêssegos, avaliando a incidência de podridão parda nos frutos, bem como a alteração nos níveis de proteínas totais, a ativação das enzimas relacionadas a patogenicidade (proteínas-pr), sendo a FAL, quitinase e B-1,3,glucanase. Assim os experimentos serão apresentados na forma de artigos no decorrer da dissertação.

16 16 3 ARTIGO 1 - EXTRATOS VEGETAIS E COMPOSTOS VOLÁTEIS DE ÓLEOS ESSENCIAIS NA INIBIÇÃO DO DESENVOLVIMENTO DE Monilinia fructicola IN VITRO RESUMO Avaliou-se com este trabalho, o efeito dos extratos aquosos autoclavados e não autoclavados de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera), capim cidreira (Cymbopogon citratus), eucalipto (Eucalyptus globulus) e nim (Azadirachta indica) em diferentes concentrações, bem como o efeito dos compostos voláteis dos óleos essenciais dessas plantas sobre o crescimento micelial e esporulação de Monilinia fructicola. O fungo foi isolado em meio de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar) a partir de pêssegos infectados pelo patógeno. O meio de cultura, contendo concentrações de 0%, 5%, 10%, 15% e 20% dos extratos vegetais foi vertido em placas de Petri, após ter solidificado, discos de 0,5 cm de diâmetro, contendo o micélio e conídios do patógeno, foram dispostos no centro de cada placa. Para avalição dos compostos voláteis avaliou-se a dose de 20 μl de cada óleo essencial, sendo aplicados em papel filtro esterilizado com 1,5 cm², fixado no centro da tampa da placa, colocou-se também um disco de 0,5 cm de diâmetro contendo micélio e conídios do patógeno no centro da superfície do meio de cultura BDA. Todas as placas foram vedadas e em seguida, incubadas em BOD a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h. Após 24 h iniciou-se a mensuração do crescimento micelial de M. fructicola, por 7 dias. Pode-se observar que todos os extratos, bem como o efeito volátil, demonstraram potencial sobre a redução do crescimento micelial M. fructicola, sendo que tal ação apresenta especificidade de resposta em função das concentrações. Quanto ao efeito sobre a produção de esporos, tal potencial também é demonstrado, com exceção do extrato de arruda. Entre os extratos avaliados o de alho demonstrou destaque na supressão do crescimento micelial e esporulação do patógeno. Palavras-chave: Prunus persica. Podridão parda. Controle alternativo. ABSTRACT We evaluated this work, the effect of autoclaved aqueous extracts and not autoclaved garlic (Allium sativum), rue (Ruta graveolens), coot (Baccharis trimera), grass - lemongrass (Cymbopogon citratus), eucalyptus (Eucalyptus globulus) and neem (Azadirachta indica) in different concentrations, and the effect of the volatile compounds from essential oils of these plants on the mycelial growth and sporulation of Monilinia fructicola. The fungus was isolated on PDA culture medium (Potato-Dextrose-Agar) from peaches infected by the pathogen. The culture medium containing concentrations of 0%, 5%, 10%, 15% and 20% of the plant extracts was poured into Petri plates, after solidified, 0,5 cm diameter disks containing the mycelium and pathogen conidia, were arranged in the center of each plate. To evaluate the essential oil evaluated the dosage of 20 ul of each essential oil being applied on filter paper sterilized with 1.5 cm², set in the center of the cover plate, also placed a 0,5 cm disc diameter containing mycelium and conidia of the pathogen in the center of the surface of PDA culture medium. All plates were sealed and then incubated in a chamber at 25 C and 12 h photoperiod. After 24 h began measuring the mycelial growth of M. fructicola, for 7 days. It can be seen that all the extracts and volatile effect, demonstrated potential for reducing M. fructicola mycelium growth, and such action has specific response in different concentrations. As to the effect on the production of spores, such potential is also shown, with the exception

17 of arruda extract. Among the extracts evaluated the garlic has shown highlighted in the suppression of mycelial growth and sporulation of the pathogen. Keywords: Prunus persica. Brown rot. Alternative control INTRODUÇÃO A podridão parda, causada pelo fungo Monilinia fructicola (G. Wint) Honey (fase teleomórfica), ou Monilia fructicola (G. Wint) Batra (fase anamórfica), é a principal causa de perda econômica nos pomares de Prunus. Uma vez atingido o pomar, ataca ramos, flores e frutos. Tendo início na primavera, infecta primeiramente os órgãos florais (GARRIDO; SÔNEGO, 2003), nos frutos, causa manchas pardas pequenas e circulares com colonização rápida, principalmente, próximo à maturação, após desidratam-se e apresentam aspecto mumificado presos às plantas ou no solo (OGAWA et al., 1995; MAY-DE-MIO et al., 2004), permanecendo durante todo o inverno. Nesta entre safra, sobre os frutos mumificados formam os apotécios, contendo ascas que liberam os ascósporos, responsáveis pela infecção primária (GARRIDO, SÔNEGO 2003; MAY-DE MIO et al., 2004). Na maioria das vezes as práticas culturais não controlam a doença, devido à rápida disseminação, assim o controle desta tem se intensificado, basicamente através de produtos sintéticos. No entanto, a utilização indiscriminada está se mostrando ineficiente, devido ao elevado uso dos fungicidas, nem sempre recomendados para a cultura (SANTOS et al., 2006). Dessa forma a exploração de compostos de plantas tem se tornado uma alternativa no controle de fitopatógenos, pois possuem substâncias com propriedades fungicidas e/ou fungitóxicas, como extrato bruto e óleo essencial (LAZAROTTO et al., 2009). Estes possuem potencial ecológico na substituição de produtos sintéticos, pois prejudicam menos o homem e o meio ambiente, menor custo, fácil disponibilidade aos agricultores, além de gerar novos compostos, degradação mais rápida e amplo espectro de ação (FERRAZ et al., 2008). Para a utilização dessas substâncias no controle de doenças, são necessárias pesquisas que comprovem a eficiência, com ação fungitóxica direta, caracterizada pela inibição do crescimento micelial e germinação de esporos em fungos fitopatogênicos (BETTIOL; MORANDI, 2009). O potencial de plantas como o alho (Allium sativum L.(Liliaceae)), tem sido bastante elucidado, em função da alicina, substância tóxica, que inativa os microorganismos fitopatogênicos (TALAMINI; STADNIK, 2004). Este efeito inibitório tem sido demonstrado para diversos fungos, desde patógenos de pós-colheita, foliares e de solo (TANSEY; APPLETON, 1975; LAVEZO et al., 2010).

18 18 Outras plantas também estão sendo estudadas, como a arruda (Ruta graveolens L. (Ruataceae)) no controle de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. (CELOTO et al., 2008). Segundo Schwan-Estrada e Stangarlin (2001) a arruda têm sido utilizada para inibição do crescimento micelial e esporulação de Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Alternaria alternata, Phytophthora sp e Colletotrichum graminicola. A carqueja (Baccharis trimera, Less (DC) (Asteraceae)) também tem sido utilizada em pesquisas, com vistas à inibição de crescimento micelial e esporulação de fungos fitopatogênicos (SCHWAN- ESTRADA et al., 1997). O uso de seu óleo essencial pode inibir o crescimento de Rhizoctonia solani Khun, Sclerotium rolfsii Sacc., Alternaria alternata (Ellis; G. Martin) L.R. Jones; Grout e Phytophthora sp. (STANGARLIN et al., 1999). Quanto ao capim cidreira (Cymbopogon citratus D.C. Stapf. (Poaceae)), possui em sua composição citral, com ação antifúngica (BARBOSA et al., 2006). Tagami et al. (2009) testaram a fungitoxidade do extratos no desenvolvimento dos fungos R. solani e S. rolfsii e destacaram baixas taxas de inibição do crescimento, porém ao utilizarem óleo essencial obtiveram 100% de inibição do crescimento micelial. O eucalipto (Eucalyptus globulus L. (Myrtaceae)), também possui propriedade antifúngica a germinação dos urediniósporos de Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja (MEDICE et al., 2007). Bonaldo et al. (2004) observaram esse efeito ao utilizarem extrato aquoso de eucalipto (Eucalyptus citriodora) em folhas de pepino inoculadas com C. lagenarium. Além destas plantas, o uso do óleo e extrato da folha de nim (Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)), também é utilizado no controle de fitopatógenos devido seu principal composto a azadiractina, presente principalmente nas sementes, biodegradável e de curta persistência no meio ambiente (MARTINEZ, 2002). A sua composição possui terpenos e flavonóides, compostos com reconhecida atividade antimicrobiana, que atuam na defesa química das plantas contra fungos e bactérias (CASTRO et al., 2004). Desta forma, o objetivo com este trabalho foi avaliar a atividade antifúngica in vitro dos extratos de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera), capim cidreira (Cymbopogon citratus), eucalipto (Eucalyptus globulus) e nim (Azadirachta indica), com e sem autoclavagem, além de compostos voláteis liberados a partir do óleo essencial de alho, arruda, carqueja e nim, sobre o fungo Monilinia fructicola, agente causal da podridão parda em pessegueiros.

19 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no Laboratório de Entomologia e Fitopatologia da Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS) Campus Erechim/RS Isolamento e cultivo de M. fructicola O fungo M. fructicola foi isolado a partir de frutos mumificados oriundos de um pomar comercial de um produtor de pêssego do Município de Barrão de Cotegipe/RS. Os isolados foram cultivados em meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA), contendo 200 g L -1 de infusão de batatas, 20 g L -1 dextrose e 15 g L -1 de ágar, Imedia, em câmara tipo BOD a 25 C, fotoperíodo de 12 h, até atingir toda a superfície da placa e, após, foram armazenados em geladeira até o momento do uso Obtenção dos extratos vegetais aquosos e óleos essenciais Os extratos foram obtidos a partir de bulbilhos de alho (Allium sativum) adquiridos no mercado, provenientes de lavouras do Rio Grande do Sul. Parte aérea de arruda (Ruta graveolens) e carqueja (Braccharis trimera) capim cidreira (Cymbopogon citratus), eucalipto (Eucalyptus globulus), colhidos de plantas que não apresentavam floração, durante as primeiras horas do dia. As plantas de arruda e capim-cidreira foram cultivadas em hortas caseiras, sem aplicação de produtos químicos. Enquanto que a carqueja e eucalipto estavam em matas distante de estradas e cidades. Folhas de nim (Azadirachta indica) foram coletadas de plantas que estavam num bosque e após secas a 60 C por 24h. Para a obtenção dos extratos aquosos, utilizou-se 20 g do material vegetal para 100 ml de água destilada. Este foi triturado em liquidificador industrial, por 3 vezes consecutivas, durante 5 min e intervalo de 3 min. Em seguida, o extrato foi deixado em repouso por 24 h, quando então foi peneirado, passado em gaze até não sobrar resíduos de partes vegetais, armazenado em embalagem plástica e envoltos por papel pardo, devidamente identificado. Para a obtenção dos óleos essenciais, foram utilizadas as mesmas partes vegetais empregadas para o preparo dos extratos aquosos, porém o material vegetal foi submetido à secagem a 60 C por 24 h, em estufa com circulação de ar forçada. Em seguida, foi realizada a extração do óleo essencial pelo método de hidrodestilação, por arraste com vapor d água, durante 3 h, através do extrator tipo Clevenger. O óleo essencial foi coletado e armazenado em frasco âmbar, envolto com papel alumínio e armazenado em freezer até o momento do uso.

20 Efeito dos extratos vegetais e compostos voláteis dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial de M. fructicola Para avaliar o crescimento micelial foram utilizados os extratos de alho, arruda, carqueja e nim adicionados ao meio de cultura BDA autoclavado nas concentrações 0%, 5%, 10%, 15% e 20%. Outra parte dos extratos foi adicionada ao meio de cultura BDA, nas mesmas concentrações citadas e após autoclavado a 120 ºC, durante 30 min, a fim de avaliar o efeito da autoclavagem sobre os extratos. O meio de cultura com os extratos foi vertido em placas de Petri com 6,5 cm de diâmetro. Após solidificar, foi colocado no centro da placa de Petri um disco de 0,5 cm de diâmetro contendo micélio e conídios de M. fructicola. Para verificar a eficiência dos compostos voláteis dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial, foi avaliada a dose de 20 μl de cada óleo essencial, sendo aplicados em papel filtro esterilizado com 1,5 cm², fixado no centro da tampa da placa de Petri. Na mesma placa, um disco de 0,5 cm de diâmetro contendo micélio e conídios de M. fructicola foi colocado no centro da superfície do meio de cultura BDA. Todas as placas foram vedadas com Parafilm e, em seguida, foram incubadas em câmara tipo BOD a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h, durante 7 dias. A avaliação ocorreu diariamente, consistindo em medições, do crescimento micelial das colônias, com duas medidas diametralmente opostas em cm (centímetros), com auxílio de régua graduada Inibição da esporulação de M. fructicola A partir dos resultados da inibição do crescimento micelial do experimento anterior, os extratos que apresentaram maior inibição, além de todos os óleos essenciais, foram utilizados para a avaliação da esporulação do patógeno. A suspensão de conídios foi preparado adicionando-se 20 ml de água destilada esterilizada sobre as colônias de M. fructicola seguida por uma leve fricção sobre o micélio do fungo com alça de Drigalski, de modo que fosse liberado as estruturas fúngicas. Em seguida, a suspensão foi filtrada em gaze dupla e recolhida em béquer, a fim de que ocorresse somente a passagem da suspensão. Foram adicionados 80 ml de água destilada e esterilizada, para completar 100 ml de suspensão nas quais, após homogeneização, retirou-se 10 μl para que o número de conídios ml -1 fosse quantificado em câmara de Neubauer.

21 Delineamento experimental O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com 5 repetições para cada tratamento, sendo a unidade experimental composta por uma placa de Petri. Para avaliar o crescimento micelial e porcentagem de inibição de crescimento micelial, sob diferentes concentrações de extratos vegetais aquosos, conduzido em arranjo fatorial 5x8 (5 concentrações para cada extrato vegetal e 8 tempos de incubação). Enquanto que sob o efeito dos compostos voláteis dos óleos essenciais, foi conduzido em arranjo fatorial 5x8 (4 tipos de óleo, testemunha e 8 tempos de incubação), sendo a testemunha apenas meio BDA. A partir dos melhores resultados dos extratos vegetais na inibição do crescimento micelial, bem como, todos os compostos voláteis dos óleos essenciais testados, foram utilizados para avaliação quanto a inibição da esporulação de Monilinia fructicola. Os dados obtidos para os extratos vegetais e compostos voláteis dos óleos essenciais foram tabulados e submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott (p 0.05), com auxílio do programa ASSISTAT 7.7 (SILVA; AZEVEDO, 2002) Quando os dados dos extratos vegetais foram significativos se efetuou a análise de regressão através do programa SigmaPlot v RESULTADOS E DISCUSSÃO Inibição do crescimento micelial de M. fructicola Verificou-se na tabela 1 significância na maioria das variáveis analisadas, bem como as equações de regressão e interações correspondentes, principalmente no extrato de alho autoclavado nas concentrações 10% e 15%, e não autoclavado a 15% e 20%, pois a equação foi igual à média (Y=0,5), não ocorrendo o desenvolvimento do fungo (Figura 1A e 1B). Porém os extratos de capim-cidreira e eucalipto autoclavados e não autoclavados não diferiram estatisticamente da testemunha, não inibindo o desenvolvimento do patógeno. O extrato de alho possui potencial fungitóxico, o que pode ser constatado pelo total da porcentagem de inibição do crescimento micelial, quando comparado a testemunha todos as concentrações foram significativas durante todo o tempo de exposição do fungo ao extrato, porém pode ser observado que extrato de alho autoclavado a 20% nos dois últimos dias de avalição diferiu estatisticamente das demais concentrações tendo uma porcentagem em torno de 2,5% menor de inibição de crescimento micelial (Tabela 2). No entanto, quando o extrato não foi autoclavado as concentrações 5% e 10% diminuíram a eficiência do controle a partir

22 22 do quarto dia de análise, sendo que no último dia a eficiência foi respectivamente 1,85% e 5,08% menor comparado às concentrações 15% e 20% (Tabela 3). Segundo Talamini e Stadnik (2004) esse efeito fugitóxico deve-se à alicina, substância formada do complexo de aliinase e aliina. Resultados semelhantes a estes, também foram observados por Souza et al. (2007), que testaram a atividade antifúngica do extrato de alho, verificando redução do crescimento micelial de Fusarium proliferatum (Matsush.) em sementes de milho. Ribeiro e Bedendo (1999) observaram que os extratos aquosos de alho inibiram o desenvolvimento de micélio do fungo Colletotrichum gloeosporioides, diretamente proporcional às concentrações avaliadas. O potencial fungitóxico do extrato bruto de alho no crescimento micelial também foi constatado na antracnose em morangueiro (Colletotrichum acutatum) (ALMEIDA et al., 2009) e sobre o agente causal da antracnose da videira (Elsinoe ampelina) (BOTELHO et al., 2009; LEITE et al., 2012). Para o extrato de arruda autoclavado, a partir do terceiro dia ocorreu desenvolvimento do fungo, sendo que nas concentrações 5% e 20% houve menor controle do crescimento que nas demais concentrações (Figura 1C e 1D). Além disso, o extrato autoclavado a 15% diferiu estatisticamente dos demais no decorrer do tempo, obtendo maior controle, inclusive quando comparado a maior concentração superou a inibição em 27,54%, desta forma infere-se que este extrato poderia ser utilizado em menor concentração, proporcionando melhor aproveitamento de material vegetal (Tabela 2). Os extratos quando não autoclavados, demonstraram maior porcentagem de inibição de desenvolvimento do patógeno, conforme o aumento da concentração (Tabela 3). Esses resultados foram melhores do que os observados por Celoto et al. (2008), que constataram a inibição em, aproximadamente, 23% do crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides quando utilizaram o extrato aquoso de arruda a 20%. Porém, os resultados deste estudo corroboram com Pedroso et al. (2009) que, analisando o crescimento micelial do fungo Alternaria solani (Moniliales), comprovaram que o extrato de arruda a 10% inibiu o crescimento vegetativo do fungo. Também Venturoso et al. (2011), observaram que o extrato aquoso de arruda inibiu 25,3% o crescimento de Phomopsis sp., sendo que o efeito antifúngico deste extrato pode ser devido à rutina, seu principal componente químico (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002). O extrato de carqueja autoclavado na concentração 10% e 15% diferiram dos demais, sendo superior a concentração 20%. Enquanto que o extrato não autoclavado nas

23 23 concentrações 15 e 20%, apresentaram inibição micelial durante todo o período de incubação, não diferindo estatisticamente entre si, assim como o extrato de arruda, pode-se utilizar menor concentração obtendo o mesmo efeito. Fato interessante pode ser observado no extrato autoclavado a 10% do segundo ao quinto dia de avaliação, e a 20% do segundo ao sexto, diminuíram a porcentagem de inibição, após esse período a concentração 10% se equivaleu a 15% (Figura 1E e 1F; Tabela 2 e 3). Em relação à planta de carqueja, relatos indicando o potencial no controle de fitopatógenos, em que o extrato bruto obteve inibição parcial no crescimento de Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Alternaria alternata e Phytophthora sp. (STANGARLIN et al.,1999). Enquanto que o extrato de nim autoclavado houve maior porcentagem de inibição micelial na concentração 10% durante todo o período de exposição. Para a concentração 20%, a partir do terceiro dia de exposição, não foi observado efeito de controle, sendo que sua eficiência foi menor que a concentração 5%, que não apresentou controle nos dois últimos dias. Porém no extrato não autoclavado as concentrações extremas não deferiram estatisticamente, obtendo maior inibição do desenvolvimento do fungo durante todo o período (Figura 1G e 1H; Tabela 2 e 3). Carneiro (2003) buscando o controle de oídio em tomateiro através do uso de extrato de folhas de nim verificou a redução do crescimento micelial e formação de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum, nas concentrações de 0,25%, 0,5% e 2%. Koona e Budida (2011) verificaram que extratos de folhas proporcionaram efeito antibacteriano às bactérias Proteus vulgaris e Micrococcus luteus. Foi verificado ainda a redução do número de conídios de Phaeoisariopsis griseola e controle da mancha angular do feijoeiro quando as aplicações ocorreram antes da inoculação (CARNEIRO et al., 2008).

24 Tabela 1 - Equações, coeficiente de determinação e probabilidade para o crescimento micelial de Monilinia fructicola sob diferentes concentrações de extratos autoclavados ou não de alho, arruda, carqueja e nim, em função do tempo de incubação. UFFS. Erechim/RS, Extrato Método Concentrações (%) Equações R² P 0 Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0,0001 Alho Autoclavado 5 Y=0,497+0,004*x-9,687E-012*x² 0,87 P= 0, Y= 0,496-0,006*x+0,005*x² 0,96 P=0,0012 Não autoclavado Autoclavado Não autoclavado Autoclavado Não autoclavado Autoclavado Não autoclavado FONTE: Elaborado pelo autor Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y= 0,482+0,019*x+0,0005*x² 0,89 P= 0, Y= 0,516-0,038*x+0,011*x² 0,96 P= 0, Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y=6,148/(1+exp(-(x-3,505)/1,083)) 0,99 P<0, Y= 0,390+0,278*x-0,015*x² 0,97 P=0, Y= 0,488+0,007*x+0,003*x² 0,94 P=0, Y= 0,315+0,366*x+0,008*x² 0,99 P<0, Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y=6,671/(1+exp(-(x-4,059)/1,146)) 0,98 P<0, Y= 0,679-0,399*x+0,102*x² 0,98 P=0, Y= 0,496+0,003*x-9,6869E-012*x² 0,87 P=0, Y= 0,504-0,014*x+0,005*x² 0,93 P=0, Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y= 6,524/(1+exp(-(x-2,799)/0,705)) 0,98 P<0, Y= 0,526+0,315*x-0,013*x² 0,98 P=0, Y= 0,549-0,092*x+0,022*x² 0,90 P=0, Y= 0,461+0,305*x-0,009*x² 0,99 P<0, Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y= 6,441/(1+exp(-(x-3,240)/0,841)) 0,98 P<0, Y= 6,554/(1+exp(-(x-3,823)/0,819)) 0,99 P<0, Y= 0,453+0,065*x-0,001*x² 0,94 P= 0, Y= 0,499+0,005*x+0,0008*x² 0,98 P=0, Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y= 5,353/(1+exp(-(x-6,458)/2,145)) 0,98 P<0, Y= 0,506-0,024*x+0,008*x² 0.99 P<0, Y= 6,519/(1+exp(-(x-3,581)/1,229)) 0,99 P<0, Y= 2,412/(1+exp(-(x-2,787)/1,261)) 0,96 P=0, Y=6,592/(1+exp(-(x-3,260)/0,475)) 0,99 P<0, Y= 0,470+0,024*x+0,004*x² 0,93 P=0, Y= 2,094/(1+exp(-(x-2,480)/1,087/) 0,69 P=0, Y= 3,939/(1+exp(-(x-2,864)/0,773)) 0,98 P=0, Y= 0,499-0,0004*x+0,0008*x² 0,94 P=0,0042

25 Figura 1 - Crescimento micelial (cm) de Monilinia fructicola em diferentes concentrações de extrato autoclavado e não autoclavado de alho (A) e (B), arruda (C) e (D), carqueja (E) e (F) e nim (G) e (H), respectivamente, em função do tempo de incubação. UFFS. Erechim/RS, Crescimento micelial (cm) AB CD E F GH Crescimento mecelial (cm) Crescimento micelial (cm) Crescimento micelial (cm) 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 % 5 % 10 % 15 % 20 % Alho autoclavado 0, ,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 % 5 % 10 % 15% 20 % Arruda autoclavado 0, ,0 6,5 Tempo (dias) Carqueja autoclavado 6,0 0 % 5 % 5,5 10 % 5,0 15 % 20 % 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, ,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 % 5 % 10 % 15 % 20 % Tempo (dias) Nim autoclavado 0, FONTE: Elaborado pelo autor. Tempo (dias) Crescimetno micelial (cm) Crescimento micelial (cm) Crescimento micelial (cm) 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 % 5 % 10 % 15% 20 % Alho não autoclavado 0, ,0 6,5 0 % Arruda não autoclavado 6,0 5 % 10 % 5,5 15 % 5,0 20 % 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, ,0 6,5 Tempo (dias) Carqueja não autoclavado 6,0 0 % 5 % 5,5 10 % 5,0 15 % 20 % 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, ,0 6,5 Nim não autoclavado Tempo (dias) 0 % 6,0 5 % 10 % 5,5 15 % 5,0 20 % 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Tempo (dias) 0, Tempo (dias) 25

26 26 Tabela 2 - Efeito dos extratos autoclavados de alho, arruda, carqueja e nim em diferentes concentrações sobre a porcentagem de inibição do desenvolvimento micelial de Monilinia fructicola (*). UFFS. Erechim/RS, Extratos Concentrações (%) Dias de exposição ,00 ba 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 ba 0,00 ca 0,00 ca aa 100 aa 100 aa 100 aa 99,70 aa 99,70 aa 99,70 aa 99,70 aa Alho aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa aa 100 aa 100 aa 100 aa 98,72 aa 98,72 aa 97,23 bb 97,23 bb CV (%) 1,36 Arruda 0 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 da 0,00 da 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca aa 100 aa 67,8 bb 44,62 cc 40,31 bc 36,9 bc 14,62 cd 12,31 cd aa 100 aa 86,85 aa 82,91 aa 52,84 bb 68,00 ab 59,08 bb 59,08 bb aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 98,46 aa 97,54 aa 97,54 aa aa 100 aa 63,13 bb 63,81 bb 63,42 bb 78,46 aa 74,62 bb 70,00 bb CV (%) 37,37 Carquej a 0 0,00 ba 0,00 ca 0,00 da 0,00 da 0,00 ca 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ba aa 70,73 bb 60,00 bb 27,96 cc 27,53 cc 15,39 bc 10,15 bc 5,38 bc aa 64,56 bb 37,33 cb 59,01 bb 72,70 ba 81,85 aa 81,08 aa 76,31 aa aa 100 aa 100 aa 100 aa 97,95 aa 98,46 aa 97,84 aa 90,15 aa aa 63,00 bb 30,33 cc 43,21 cc 58,71 bb 75,08 ab 69,85 aa 63,54 ab CV (%) 40,64 0 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca aa 100 aa 100 aa 89,56 aa 82,69 aa 76,46 ab 64,92 bb 60,93 bb Nim aa 100 aa 100 aa 100 aa 99,07 aa 94,77 aa 96,85 aa 92,92 aa aa 88,00 aa 62,20 bb 72,07 bb 45,95 bc 43,23 bc 23,08 cc 20,31 cc aa 100 aa 100 aa 55,57 bb 48,96 bb 54,31 bb 54,00 bb 48,92 bb CV (%) 36,03 *Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5% de significância. FONTE: Elaborado pelo autor.

27 Tabela 3 - Efeito dos extratos não autoclavados de alho, arruda, carqueja e nim em diferentes concentrações sobre a porcentagem de inibição do desenvolvimento micelial de Monilinia fructicola (*). UFFS. Erechim/RS, Extratos Concentrações Dias de exposição (%) ,00 ba 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 Ca 0,00 ca 0,00 da aa 100 aa 100 aa 100 aa 98,15 Bb 98,31 bb 98,15 bb 98,15 bb Alho aa 100 aa 100 aa 100 aa 99,12 Bb 98,15 bb 98,15 bb 94,92 cc aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa CV (%) 1,42 0 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca 0,00 da 0,00 ca aa 100 aa 100 aa 46,49 bb 54,02 bb 43,69 bb 28,46 cc 10,77 cd Arruda aa 100 aa 100 aa 100 aa 99,28 aa 90,46 aa 76,92 bb 57,54 bc aa 100 aa 100 aa 100 aa 99,58 aa 99,69 aa 99,69 aa 99,69 aa aa 100 aa 100 aa 100 aa 98,33 aa 99,69 aa 97,85 aa 97,85 aa CV (%) 19,59 0 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 da 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ba 0,00 ba aa 100 aa 100 aa 24,76 cb 25,08 bb 19,93 cb 3,84 bc 0,00 bc Carqueja aa 100 aa 50,00 bb 62,67 bb 49,39 bb 38,15 bb 19,08 bc 18,46 bc aa 100 aa 100 aa 78,00 ba 94,63 aa 95,38 aa 95,23 aa 95,23 aa aa 100 aa 93,33 aa 99,60 aa 99,27 aa 99,38 aa 99,08 aa 98,77 aa CV (%) 28,94 0 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ba 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca 0,00 ca aa 100 aa 100 aa 100 aa 95,49 aa 96,15 aa 94,92 aa 94,61 aa Nim aa 100 aa 100 aa 67,25 bb 63,63 bb 76,15 bb 76,15 bb 75,38 bb aa 100 aa 100 aa 66,20 bb 64,89 bb 66,00 bb 59,54 bb 57,08 bb aa 100 aa 100 aa 100 aa 100 aa 99,70 aa 99,69 aa 99,38 aa CV (%) 21,30 *Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5% de significância. FONTE: Elaborado pelo autor. 27

28 28 Na figura 2 tem-se o desenvolvimento micelial de M. fructicola quando incubado com compostos voláteis de óleos essenciais, pode ser observado que os compostos presentes no óleo de alho tiveram o mesmo resultado do que os extratos, ou seja, são fungitóxicos não havendo nenhum desenvolvimento do patógeno. Segundo Antunes e Cavacob (2010) os óleos essenciais possuem substâncias que podem atuar como fungistáticos ou fungicidas, como o caso do óleo de alho. Lee et al. (2008) também comprovaram a eficiência dos compostos do óleo de alho em diferentes espécies de plantas da família Myrtaceae, sobre os fungos Phytophthora cactorum, Cryponectria parasitica e Fusarium circinatum. Os compostos voláteis presentes nos óleos de arruda, carqueja e nim não diferenciaram da testemunha, principalmente a partir do quarto dia (Figura 2), isso também pode ser notado em relação a porcentagem de crescimento diário (Tabela 4), em que foi observado no primeiro dia baixa inibição para os compostos, diminuindo no decorrer do experimento, e no caso do óleo de arruda e nim, os compostos voláteis não tiveram nenhum controle nos últimos dois dias. Diferentemente do observado por Garcia et al. (2012), em que o óleo de nim de 100 μg ml -1 de nim indiano adicionado ao meio de cultura, reduziu em 53,6% o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum. Com o mesmo método Triana e González (2009) inibiram 56% do crescimento micelial de Rhizoctonia solani. Figura 2 - Crescimento micelial (cm) de Monilinia fructicola em relação aos compostos voláteis de alho, arruda, carqueja e nim em função do tempo de incubação. UFFS. Erechim/RS, Crescimento micelial (cm) 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Tempo (dias) Testemunha y=1,028+3,265*x-0,315*x² Alho y=0,5 Arruda y=0,305+3,427*x-0,319*x² Carqueja y=0,352+2,894*x-0,256*x² Nim y=0,0913+2,8561*x-0,2228*x² FONTE: Elaborado pelo autor.