Fungitoxicidade de Cymbopogon citratus e Cymbopogon martinii a Colletotrichum gloeosporioides em frutos de pimentão

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1 88 Fungitoxicidade de Cymbopogon citratus e Cymbopogon martinii a Colletotrichum gloeosporioides em frutos de pimentão CARVALHO, J.B. 1 ; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F. 1,3 *; BONALDO, S.M. 1,4 ; CRUZ; M.E.S. 1 ; CARLOS; M.M. 1 ; STANGARLIN, J.R. 2,3 1 Universidade Estadual de Maringá (UEM/PR), Pós-graduação em Agronomia, Departamento de Agronomia, Av. Colombo, 5790, CEP , Maringá, PR, * schwan@wnet.com.br 2 Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Centro de Ciências Agrárias, Rua Pernambuco 1777, Caixa Postal 1008, CEP , Marechal Cândido Rondon. 3 Bolsistas CNPq 4 Bolsista PRODOC/CAPES RESUMO: A antracnose provoca elevadas perdas em frutos de pimentão em pós-colheita e a busca por métodos alternativos de controle nesta fase têm sido intensificada. O presente trabalho objetivou avaliar o potencial fungitóxico das espécies C. citratus e C. martinii in vitro e na proteção pós-colheita de pimentão cv Ikeda contra Colletotrichum gloeosporioides. No ensaio in vitro utilizouse extrato bruto aquoso (EBA) autoclavado das duas espécies nas concentrações de 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 50% incorporados ao meio BDA. A esporulação foi avaliada através da contagem de esporos em câmara de Neubauer, e a germinação de esporos e formação de apressórios em placas de ELISA. No ensaio in vivo, frutos de pimentão foram inoculados com suspensão de esporos (1x10 5 esporos ml - ¹) e após 2 dias tratados com extratos a 10 e 20% obtidos por irradiação de microondas. Água destilada e extrato cítrico foram utilizados como testemunhas. Avaliou-se a redução de massa e a severidade da doença. Os EBA das duas espécies não inibiram o crescimento micelial, a esporulação e a germinação dos esporos, porém, houve efeito inibitório sobre a formação de apressórios. O EBA não promoveu controle da doença no bioensaio in vivo, e no parâmetro redução de massa de frutos. Os EBA foram semelhantes à testemunha positiva, porém menor redução de massa dos frutos foi verificada com o EBA de C. martinii a 10%. Palavras-chave: plantas medicinais, controle alternativo, germinação esporos ABSTRACT: Fungitoxicity of Cymbopogon citratus and Cymbopogon martinii on Colletotrichum gloeosporioides in bell pepper fruits. Anthracnose of bell pepper has provoked raised losses for the culture in the post harvest, when the disease is more severe. The use of alternative methods of post harvest disease control has been intensified to improve the reduction of the use of pesticides, and the use of medicinal plants can be an alternative in the disease control. This work aimed at the verification of the in vitro fungitoxic potential of the Cymbopogon citratus and Cymbopogon martinii as an alternative to control Colletotrichum sp. in bell pepper post harvest period. In vitro test, concentrations of 1, 5, 10, 15, 20, 25 and 50% of the crude extract (CE) autoclaved of the two species were incorporated into PDA. It was evaluated sporulation for the counting of spores in hemacytometer, and the spore germination and apressorio formation in ELISA as well. In the in vivo test bell pepper fruits were inoculated with spore suspension (1x10 5 spores ml -1 ) and after 2 days treated with 10 and 20% extract prepared for microwave irradiation. Distilled water and citric extract were used as controls. Fruits weight reduction and disease severity were evaluated. The CE from the two species have not significantly inhibited the mycelial growth, the sporulation and the spores germination, however it had inhibitory effect on the apressorio formation. During the in vivo assay, the disease was not controlled for the CE. In the parameter fruit weight reduction, the CE was similar to the positive control, however smaller fruits weight reduction was verified with C. martinii CE at a concentration of 10% concentration. Key words: medicinal plants, alternative control, spores germination Recebido para publicação em 07/11/2006 Aceito para publicação em 31/08/2007

2 89 INTRODUÇÃO A produção de frutos e hortaliças tem aumentado consideravelmente em todo o mundo, incluindo o pimentão (Capsicum annuum) que é amplamente produzido para consumo in natura. As perdas, qualitativas e quantitativas em pós-colheita atingem 10%, com diversas causas que variam de região para região, sendo ocasionadas por deteriorações fisiológicas, injúrias mecânicas, pragas, e principalmente por doenças (Oliveira et al., 2004). A antracnose causada por Colletotrichum gloeosporioides pode ser uma das doenças mais comuns e severas para a cultura do pimentão e ocorre principalmente nos frutos. Os danos são diretos à produção e comercialização, levando à depreciação e redução da qualidade, com conseqüente prejuízo ao produtor rural, podendo causar elevadas perdas, em um período relativamente curto (Kurozawa & Pavan, 1997). A redução de doenças em pós-colheita é um desafio para minimizar essas perdas. Atualmente, o controle tem sido à base de fungicidas, e em menor escala, de tratamentos físicos associados ao controle químico. No entanto, a crescente exigência por produtos vegetais de qualidade, livres de contaminação por microrganismos e resíduos químicos, restringe o uso de defensivos agrícolas em pós-colheita e, com isso, tem incrementado o desenvolvimento de pesquisas que buscam métodos alternativos (físicos e biológicos) para controlar as podridões pós-colheita (Mari & Guizzardi, 1998). A exploração da bioatividade antimicrobiana e/ou elicitora de defesa utilizando compostos secundários presentes no extrato bruto ou óleos essenciais de plantas medicinais, constitui-se em mais uma forma potencial para controle de doenças em plantas cultivadas (Schwan-Estrada & Stangarlin, 2005). O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. (capim limão Família Poaceae) e C. martinii (Roxb.) F.J. Watson (palmarosa - Família Poaceae) contra Colletotrichum gloeosporioides e como protetor de frutos de pimentão em pós-colheita. MATERIAL E MÉTODO Obtenção do isolado de C. gloeosporioides O fungo Colletotrichum gloeosporioides foi isolado diretamente de frutos de pimentão cv. Ikeda e mantido em meio BDA (batata-dextrose-agar) a o C, sob fotoperíodo de 12 h, até a utilização nos bioensaios. Obtenção do extrato bruto aquoso (EBA) de C. citratus e C. martinii Folhas frescas de C. citratus (DC.) Stapf. (capim-limão) e C. martinii (Roxb.) J.F. Watson (palmarosa), pertencentes a família Poaceae, foram coletadas no período de 12 às 14:00h no Horto de Plantas Medicinais do Departamento de Agronomia da Universidade Estadual de Maringá. O extrato bruto aquoso (EBA) foi obtido conforme descrito por Bonaldo et al. (2004), nas concentrações de 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 50% (p/v). No bioensaio in vivo, utilizou-se EBAs nas concentrações de 10 e 20%, das plantas medicinais, que foram submetidos a irradiação por microondas (30 W), durante 5 min e depois filtrados em gaze esterilizada, conforme descrito por Guardia et al. (2003). Bioensaios de crescimento micelial e esporulação de C. gloeosporioides Para testar o efeito do EBA no crescimento micelial do fitopatógeno, os extratos foram incorporados ao meio BDA nas concentrações anteriormente descritas, esterilizados em autoclave a 120 o C, durante 20 min, e vertidos em placas de Petri. Os óleos essenciais foram esterilizados por filtração a vácuo em membrana Millipore (0,45 m de diâmetro) e alíquotas de 1, 20, 40 e 60 L foram distribuídas na superfície do BDA com alça de Drigalski. A seguir, um disco de micélio de C. gloeosporioides com sete dias de idade em BDA, foi transferido para o centro das placas e incubadas a 24 ± 2 o C, sob fotoperíodo de 12 h. Foram utilizadas 5 repetições por tratamento. Placas contendo apenas BDA foram consideradas como controle. As avaliações foram efetuadas diariamente, mensurandose o diâmetro das colônias. A esporulação do C. gloeosporioides foi avaliada em cada tratamento nas cinco repetições, após sete dias da repicagem, através do preparo de uma suspensão de esporos, obtida pela adição de 5 ml de água destilada na superfície da colônia, raspagem desta com alça de Drigalski e filtração em gaze estéril. O número de esporos/cm foi determinado através da contagem dos esporos em câmara de Neubauer ao microscópio óptico. O delineamento experimental utilizado foi Inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial (7x2+1) totalizando 15 tratamentos com 5 repetições com 7 concentrações, 2 EBAs e testemunha. Bioensaio para avaliação da germinação de esporos e formação de apressórios por C. gloeosporioides A influência dos EBAs sobre a germinação de esporos e formação de apressórios foi realizada utilizando-se placas de ELISA. Cada poçinho da placa recebeu alíquota de 40 L da suspensão de esporos

3 90 de C. gloeosporioides (1x10 5 esporos/ml) e outra alíquota de 40 L de EBA, de maneira a se obterem as concentrações anteriormente descritas. A testemunha consistiu de água destilada e esterilizada. A placa de ELISA foi mantida em câmara úmida, a 24 o C, sob luz fluorescente constante. A porcentagem de germinação de esporos e formação de apressórios foi avaliada 10 h após o início do experimento, com contagem de 100 esporos por repetição, com cinco repetições por tratamento. A germinação foi paralisada com uma gota de corante azul de algodão com lactofenol, e a contagem foi realizada ao microscópio óptico. Foram considerados esporos germinados aqueles que apresentaram qualquer emissão do tubo germinativo, independente do seu comprimento. O delineamento experimental utilizado foi Inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial (7x2+1) totalizando 15 tratamentos com 5 repetições com 7 concentrações, 2 EBAs e testemunha. Proteção de frutos de pimentão em póscolheita Os frutos foram lavados com água e sabão, imersos em água com hipoclorito de sódio (2%) e, a seguir inoculados com o fungo C. gloeosporioides por aspersão da suspensão de esporos (1x10 5 esporos ml -1 ) sobre ferimentos feitos na região central do fruto. Após 2 dias da inoculação, os frutos foram tratados por imersão durante 1 min nos extratos aquosos de C. citratus e C. martinii a 10 e 20%; e com extrato cítrico (20 g ml -1 ). A testemunha absoluta não foi tratada e nem inoculada; e na testemunha positiva, os frutos foram somente inoculados com o patógeno. Os frutos foram mantidos em bandejas de plástico cobertas com filme plástico, em laboratório a 25 ± 5 o C e UR de 80-90%. A severidade da doença foi avaliada através da contagem do número de lesões, mensuração do diâmetro da lesão, do diâmetro e comprimento dos frutos, calculando-se a % de área lesionada nos frutos, utilizando-se as fórmulas: Área Lesionada (AL) = π.d²/4; Área média do fruto (AF)=área de um cilindro reto=2.π.r.(h+r); e % área lesionada= AL/AF.100, onde D= diâmetro da lesão (cm); R=raio do fruto, D=diâmetro do fruto; e h=comprimento do fruto. A incidência da doença (%) foi avaliada através da contagem do número de frutos com sintomas. As avaliações foram realizadas a cada dois dias, e iniciaram-se dois dias após a inoculação com o patógeno, com avaliações até o 8 o dia após a inoculação. Partindo-se das avaliações de severidade da antracnose nos frutos de pimentão, calculou-se a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) e a redução da massa dos frutos. Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC) em fatorial 2 x 2 [duas espécies (E) de plantas, duas concentrações (C)], com 5 repetições, sendo cada repetição representada por uma bandeja contendo 5 frutos. RESULTADO E DISCUSSÃO Crescimento micelial, esporulação, germinação de esporos e formação de apressórios Os EBAs de C. citratus e C. martinii afetaram o crescimento micelial e a esporulação em todas as concentrações testadas sendo dosedependente. Para o EBA C. martinii com aumento da concentração ocorreu redução no crescimento micelial e aumento da esporulação. Já o EBA de C. citratus estimulou o crescimento micelial e a esporulação de C. gloeosporioides (Tabela 1). Em relação à germinação de esporos, a maior germinação foi alcançada com a concentração de 21% do extrato bruto aquoso de C. martinii (Tabela 1). Para os dados de C. citratus não foi ajustado nenhuma equação. O resultados assemelham-se aos obtidos por Cruz et al. (1998), que verificaram que o EBA de C. citratus não inibiu a germinação de esporos de Colletotrichum graminicola. Emmett & Parbery (1975) citam que as espécies de Colletotrichum podem responder à presença de nutrientes exógenos presentes na superfície de adesão pelo alongamento do tubo germinativo, o que favorece o retardamento na formação de apressórios. Na formação de apressórios (Tabela 2), pela análise de regressão, a equação ajustada foi quadrática tanto para o EBA de C. martinii como para C. citratus sendo a mínima nas concentrações de 36 e 35% para C. martinii e C. citratus, respectivamente. Bonaldo et al. (2004) verificaram que houve inibição total na germinação de esporos e formação de apressórios de Colletotrichum lagenarium em concentrações de 20 e 1% do EA de Eucalyptus citriodora autoclavado, respectivamente. Para o extrato não autoclavado houve 75% de inibição da germinação de esporos em 25% do EA e inibição total da formação de apressórios em 15% do EA. Santos (1998) verificou que substâncias presentes nas folhas secas de Lippia alba também impediram que estas estruturas fossem formadas. A presença de nutrientes pode aumentar a taxa de germinação de esporos, e mesmo em pequenas quantidades podem impedir a formação de apressórios, mas essa inibição causada por nutrientes nem sempre é causada por inibidores específicos ou por concentrações inibitórias. Pesquisando os efeitos de óleos essenciais, Wilson et al. (1997) verificaram que os óleos essenciais de C. martinii e C. citratus inibiram totalmente a germinação de esporos de Botrytis cinerea, até mesmo em baixas concentrações do óleo, 0,39 e 6,25%, respectivamente.

4 TABELA 1. Crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos de Colletotrichum gloeosporioides isolado de pimentão, em diferentes concentrações de extrato aquoso de Cymbopogon citratus e Cymbopogon martinii, autoclavado. Concentrações do extrato bruto aquoso (%) Crescimento micelial (cm) C. martinii C. citratus Equação de Regressão 7, , x 5, , x R 2 0,9027 0,5833 CV (%) 5,78 Concentrações do extrato bruto Esporulação (número esporos. cm -2 ) aquoso (%) C. martinii C. citratus Equação de Regressão 97, ,822730x 114, ,207207x R 2 0,6185 0,4239 CV (%) 19,11 Concentrações do extrato bruto Germinação de esporos (%) aquoso (%) C. martinii C. citratus Equação de Regressão 90, ,877930x - 0,020690x² R² 0, C.V. (%): 2, Proteção de frutos de pimentão em póscolheita Após 8 dias do início do experimento, a redução da massa foi acentuada em todos os tratamentos (Tabela 3). Entretanto, frutos tratados com extrato de C. martinii a 10% apresentaram menores perdas, mas não diferiram significativamente das testemunhas absoluta e positiva e do extrato cítrico. A perda de água de produtos armazenados não só resulta em perda de massa, mas também em perda de qualidade, principalmente pelas alterações na textura. Alguma perda de água pode ser tolerada, mas aquela responsável pelo murchamento ou enrugamento deve ser evitada (Barros et al., 1994). Com relação à proteção dos frutos, em póscolheita, os extratos de C. citratus, C. martinii e extrato cítrico não foram eficientes, uma vez que não houve decréscimo na severidade da antracnose pelo TABELA 2. Formação de apressórios por Colletotrichum gloeosporioides isolado de pimentão em diferentes concentrações de extrato aquoso autoclavado de Cymbopogon citratus e Cymbopogon martinii Concentrações do extrato bruto aquoso Formação de apressórios (%) (%) C. martinii C. citratus Equação de Regressão 62, ,487936x + 0,047740x² 48, ,966506x + 0,041856x² R² 0,9346 0,9925 C.V. (%): 25,05 teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade (Tabela 4). Röder (2003; 2006) também observou que extratos de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Ruta graveolens (arruda) não foram capazes de controlar a podridão parda do pessegueiro (Monilinia fructicola) na póscolheita, entretanto o EBA de R. officinalis controlou podridão causada por Rhizopus nigricans em morangos pós-colheita. Outros EBAs de plantas medicinais como a cânfora foram usadas em controle de antracnose (Colletotrichum musae) pós-colheita de banana e observou-se redução na severidade da doença de 67, 63 e 56% para cânfora, quitosana e fungicida benomyl, respectivamente (Carré et al., 2006). TABELA 3. Efeito de extratos de Cymbopogon citratus e Cymbopogon martinii, após 6 dias da aplicação, na massa de frutos de pimentão em póscolheita Concentrações do extrato bruto aquoso (%) Redução da massa de frutos (%) C. citratus C. martinii 10% 12,86 A a 9,17 Ab 20% 10,36 A a 10,18 Aa Testemunha Absoluta¹ 13,19 Testemunha Positiva² 12,66 Extrato cítrico³ 9,94 CV %: 26,88 Médias seguidas de mesma letra minúscula na linha e maiúscula na coluna não diferem entre si pelo Teste F ao nível de 5% de probabilidade 1 não inoculada e não tratada 2 inoculada e não tratada ³concentração de 2 ml de produto comercial 1000 ml -1 água destilada e esterilizada

5 92 TABELA 4. Área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para antracnose em frutos de pimentão após seis dias da aplicação de extratos aquosos de Cymbopogon citratus e Cymbopogon martinii Tratamentos AACPD Cymbopogon citratus 10% 2,56a Testemunha Positiva¹ 2,75a Cymbopogon citratus 20% 3,05a Cymbopogon martinii 10% 3,30a Extrato cítrico² 3,34a Cymbopogon martinii 20% 3,63a CV %: 19,80 Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo Teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade ¹inoculada e não tratada ²concentração de 20 ppm (2 ml produto comercial 1000 ml -1 de água destilada) A severidade da doença (Figura 1) em frutos tratados com extrato de C. citratus a 10% foi similar à testemunha positiva, porém nos demais tratamentos foi superior, exceto para a testemunha absoluta onde não ocorreram lesões. A hipótese mais plausível que poderia justificar a ineficiência dos extratos seria de que as substâncias com ação fungitóxica tenham sido degradadas pela ação da irradiação de microondas e aquecimento. Estudos posteriores devem ser feitos para averiguar se a irradiação de microondas e o aquecimento causado por ela interferem na ação fungitóxica/elicitora dos extratos de plantas, utilizando diferentes patossistemas. Nas condições deste trabalho, não se observou efeito fungitóxico direto dos EBAs sobre Colletotrichum gloeosporioides, in vitro e in vivo entretanto observou-se diferença entre os EBAs das espécies de Cymbopogon nos efeitos sobre o fitopatógeno. FIGURA 1. Severidade da antracnose avaliada nos 2, 4, 6 e 8 o dia após a inoculação da suspensão de esporos de Colletotrichum gloeosporioides (1x10 5 esporos ml -1 ) em frutos de pimentão tratados com Extrato Cítrico e extratos brutos de Cymbopogon citratus e C. martinii, 2 dias após a inoculação. TA: testemunha absoluta, não tratada e não inoculada; TP: testemunha positiva, inoculada e não tratada; Eco40: extrato cítrico (2 ml de produto comercial 1000 ml -1 de água destilada); PMR 10% e PMR 20%: extrato de C. martinii a 10% e 20%, respectivamente; CL 10% e CL 20%: extrato de C. citratus a 10% e 20%, respectivamente. Para análise estatística, os dados foram transformados por (x + 1) 0,5. As barras sobre as colunas representam o desvio padrão da severidade entre as cinco repetições por tratamento. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA BARROS, J.C.S.M.; GOES, A.; MINAMI, K. Condições de conservação pós-colheita de frutos de pimentão (Capsicum annuum L.). Scientia Agrícola, v.51, n.2, p.363-8, BONALDO, S.M. et al. Fungitoxidade, atividade elicitora de fitoalexinas e proteção de pepino contra Colletotrichum lagenarium, pelo extrato aquoso de Eucalyptus citriodora. Fitopatologia Brasileira, v.29, n.2, p , CARRÉ, V. et al. Controle pós-colheita de Colletotrichum

6 93 musae em banana (Musa sp) por cânfora (Artemísia camphorata) e quitosana. Scientia Agrária Paranaensis, v.5, n.1, p.57-66, CRUZ, M.E.S. et al. Efeito do extrato bruto de Cymbopogon citratus (capim limão) no crescimento micelial e germinação de esporos de fungos fitopatogênicos. In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, 21., Botucatu, Resumos. Summa Phytopathologica, v.24, n.1, supl., p.74, EMMETT, R.W.; PARBERY, D.G. Apressoria. Annual Review of Phytopathology, v.13, p , GUARDIA, A.M. et al. Obtención de um extracto plaguicida de Gliricidia sepium (Jaq.) Steud. Bajo la irradiación con microondas. Revista Cubana de Plantas Medicinais, v.8, n.3, p.1-5, KUROZAWA, C.; PAVAN, M.A. Doenças das Solanáceas (berinjela, jiló, pimentão e pimenta). In: KIMATI, H. et al. Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 3.ed. São Paulo: Ed. Agronômica Ceres, v.2, p MARI, M.; GUIZZARDI, M. The post harvest phase: emerging technologies for the control of fungal diseases. Phytoparasitica, v.26, n.1, p.59-66, OLIVEIRA, S.M.A.; DANTAS, S.A.F.; GURGEL, L.M.S. Indução de resistência em doenças pós-colheita em frutas e hortaliças. Revisão Anual de Patologia de Plantas, v.12, p , RÖDER, C. Controle alternativo de podridões causadas por fungos na pós-colheita em pêssego e morango p. Monografia (Curso Agronomia)- Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Marechal Cândido Rondon. RÖDER, C. Controle alternativo de podridões na cultura do morango com tratamentos em pré-colheita p. Dissertação (Mestrado)-Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Marechal Cândido Rondon. SANTOS, M.M.F.B. Efeito de extratos de Lippia alba sobre o fungo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.), isolados de Citrus. In: MING, L.C. et al. Plantas Medicinais, aromáticas e condimentares: avanços na pesquisa agronômica. Botucatu: UNESP, v.2, p SCHWAN-ESTRADA, K.R.F. Potencial de extratos e óleos essenciais de vegetais como indutores de resistênciaplantas medicinais. Summa Phythopatologica, v.29, n.1, supl., p SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.; STANGARLIN, J.R. Extratos e óleos essenciais de plantas medicinais na indução de resistência. In: CAVALCANTI, L.S. et al. Indução de resistência em plantas a patógenos e insetos. Piracicaba: Fealq, p WILSON, C.L. et al. Rapid evaluation of plant extracts and essential oils for antifungal activity against Botrytis cinerea. Plant Disease, v.81, p , 1997.