Proteinograma sérico de vacas das raças Nelore e Girolando sororreagentes ou não à brucelose e à leptospirose, no Estado do Maranhão, Brasil

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1 RPCV (2015) 110 ( ) Proteinograma sérico de vacas das raças Nelore e Girolando sororreagentes ou não à brucelose e à leptospirose, no Estado do Maranhão, Brasil Serum proteinogram of Nellore and Girolando cows seropositive or not for brucellosis and leptospirosis, in the State of Maranhão, Brazil Washington Luis Ferreira Conceição 1, Virna Clemente 2, Daniela Gomes da Silva* 2, Thaís Gomes Rocha 2, Daniel Praseres Chaves 3, José Jurandir Fagliari 2 1 Departamento de Desenvolvimento Educacional, Instituto Federal do Maranhão IFMA, Av. dos Curiós s/n, São Luís MA, CEP: , Brasil 2 Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FCAV/UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n, Jaboticabal SP, CEP: , Brasil 3 Departamento de Patologia, Centro de Ciências Agrárias CCA, Universidade Estadual do Maranhão UEMA, Caixa Postal 09, São Luís MA, CEP: , Brasil Resumo: O fracionamento eletroforético pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é um dos mais confiáveis métodos de identificação de proteínas séricas, com destaque às proteínas de fase aguda, as quais têm sido utilizadas no diagnóstico, prognóstico e monitoramento de enfermidades em diferentes espécies animais. O objetivo do estudo foi avaliar o proteinograma sérico de vacas das raças Nelore e Girolando, criadas no Estado do Maranhão, sororreagentes ou não à brucelose e à leptospirose, obtido pela técnica de SDS-PAGE. Foram examinadas amostras de sangue de 150 vacas, com 24 a 36 meses de idade, não prenhes e não lactantes, distribuídas nos seguintes grupos experimentais: Grupo controle (25 vacas da raça Nelore e 25 vacas da raça Girolando, negativas aos testes de brucelose e leptospirose), Grupo brucelose (25 vacas da raça Nelore e 25 vacas da raça Girolando, sororreagentes ao teste de brucelose) e Grupo leptospirose (25 vacas da raça Nelore e 25 vacas da raça Girolando, sororreagentes ao teste de leptospirose). Notou-se maior concentração sérica de IgA e de ceruloplasmina nos animais da raça Nelore sororreagentes à brucelose (215 mg/dl e 46,4 mg/dl, respectivamente) e à leptospirose (261 mg/dl e 33,9 mg/dl, respectivamente), enquanto que nos animais da raça Girolando sororreagentes à leptospirose notou-se menor concentração sérica de albumina (2.240 mg/dl), indicando que estas enfermidades podem alterar a concentração das proteínas séricas em vacas. Palavras-chave: bovinos, brucelose, leptospirose, proteínas de fase aguda, SDS-PAGE Summary: The electrophoretic fractionation by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) is one of the most reliable methods for identification of serum proteins, mainly acute phase proteins, which has been used in diagnosis, prognosis and monitoring of diseases in different animal species. The aim of the study was to evaluate the serum protein profile of Nellore and Girolando cows, raised in the State of Maranhão, Brazil, seropositive or not for brucellosis and leptospirosis by SDS-PAGE technique. Blood samples from 150 cows with 24 to 36-month-old, not pregnant and not lactating, were examined. The cows were distributed in the following experimental groups: Control group (25 Nelore cows and 25 Girolando cows negative *Correspondência: danielafcav@yahoo.com.br for brucellosis and leptospirosis), Brucellosis group (25 Nelore cows and 25 Girolando cows seropositive for brucellosis), and Leptospirosis group (25 Nelore cows and 25 Girolando cows seropositive for leptospirosis). It was noted higher concentration of serum ceruloplasmin and IgA in seropositive animals for brucellosis and leptospirosis. It was noted higher serum IgA and ceruloplasmin in Nellore animals seropositive for brucellosis (215 mg/dl and 46.4 mg/dl, respectively) and leptospirosis (261 mg/ dl and 33.9 mg/dl, respectively), whereas in Girolando animals seropositive for leptospirosis was noted lower serum albumin (2,240 mg/dl), indicating that these diseases can alter the concentration of serum proteins in cows. Keywords: cattle, brucellosis, leptospirosis, acute phase proteins, SDS-PAGE Introdução A população bovina brasileira é estimada em animais, 33,59% deles no Centro-Oeste, 21,11% no Norte, 18,58% no Sudeste, 13,67% no Nordeste e 13,05% no Sul. No Nordeste, ainda predominam as criações extensivas, utilizadas para subsistência da população rural (IBGE, 2014). O Estado do Maranhão possui um rebanho estimado em bovinos (IBGE, 2014) e apresenta grande potencial para o desenvolvimento da exploração pecuária; no entanto, o valor médio da produtividade do rebanho situa-se entre os mais baixos do país (Cezar et al., 2005; Andrade et al., 2011). Essa ineficiência na produção de carne e leite é influenciada por vários fatores, destacando-se aqueles relacionados à genética, à nutrição e ao manejo zootécnico-sanitário dos rebanhos (Oliveira, 2008). Nesse último, as doenças infectocontagiosas, particularmente as zoonoses, são relevantes. Dentre essas enfermidades, destacamse a brucelose e a leptospirose, que ocorrem em todo o território nacional e que causam grandes prejuízos socioeconômicos e/ou de saúde pública (Brasil, 2007). 221

2 Conceição W. et al. RPCV (2015) 110 ( ) Alterações na concentração plasmática ou sérica de proteínas são as principais anormalidades laboratoriais detectadas em várias enfermidades, em especial naquelas infecciosas ou inflamatórias. As variações observadas nas diversas frações podem refletir doenças específicas e trazer valiosos subsídios para o diagnóstico e para avaliação da progressão e gravidade das doenças (Thrall, 2007). A determinação das concentrações séricas de proteínas e suas variações, principalmente das proteínas de fase aguda, por meio do fracionamento eletroforético, é um procedimento valioso para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos e tem sido utilizado para o monitoramento de diversas enfermidades em várias espécies animais (Fagliari et al., 2007; Saquetti et al., 2008, Silva et al., 2011). O uso da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é relativamente simples e de baixo custo; possibilita a detecção de concentrações proteicas extremamente baixas e a identificação de 20 a 30 proteínas, utilizando-se quantidade mínima de amostra. Outras técnicas, como as realizadas em gel de agarose ou fita de celulose, apresentam limitações porque permitem o fracionamento de apenas cinco a sete grupos de proteínas (Fagliari e Silva, 2002). Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o proteinograma sérico de vacas das raças Nelore e Girolando, criadas no Estado do Maranhão, sororreagentes ou não à brucelose e leptospirose, obtido pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Material e Métodos Foram examinadas amostras de sangue de 150 vacas, com 24 a 36 meses de idade, não prenhes e não lactantes, sororreagentes ou não à brucelose e à leptospirose, sendo 75 da raça Nelore e 75 da raça Girolando, criadas na mesorregião Centro-Oeste do Estado do Maranhão, do circuito pecuário II deste Estado, que inclui as regionais de Pedreiras, Bacabal, Santa Inês, Presidente Dutra e Barra do Corda (Figura 1). As amostras utilizadas foram obtidas durante a realização do inquérito epidemiológico sobre brucelose bovina, pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por intermédio da Agência de Defesa Agropecuária do Estado do Maranhão (AGED). Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais: Grupo controle (25 vacas da raça Nelore e 25 vacas da raça Girolando, negativas aos testes de brucelose e leptospirose), Grupo brucelose (25 vacas da raça Nelore e 25 vacas da raça Girolando, sororreagentes ao teste de brucelose) e Grupo leptospirose (25 vacas da raça Nelore e 25 vacas da raça Girolando, sororreagentes ao teste de leptospirose). Amostras de 20 ml de sangue, obtidas por venopunção jugular em frascos a vácuo sem anticoagulante, foram centrifugadas a x g, durante 15 minutos. O soro sanguíneo foi, então, separado e fracionado em alíquotas, mantidas a -20 ºC até o momento das análises laboratoriais. Figura 1 - Mapa do Estado do Maranhão com os quatro circuitos pecuários. Para o diagnóstico sorológico da brucelose foram realizados os testes do antígeno acidificado tamponado (AAT), soroaglutinação lenta (SAL) e 2-mercaptoetanol (2-ME) (Brasil, 2004; Brasil, 2006). O diagnóstico sorológico da leptospirose foi realizado por meio da técnica de soroaglutinação microscópica (SAM) (Faine et al., 1999). A concentração sérica de proteína total foi determinada pelo método do biureto, utilizando-se conjunto de reagentes comercial (Labtest, Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG, Brasil) e leitura em espectrofotômetro semiautomático (Labquest, Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG, Brasil). A separação das frações proteicas das amostras de soro sanguíneo foi realizada pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), conforme descrito por Laemmli (1970). As concentrações proteicas foram mensuradas em densitômetro computadorizado (CS-9301 PC, Shimadzu, Tóquio, Japão). Como referência, foi utilizada solução marcadora (Sigma, Saint Louis, Missouri, EUA) com pesos moleculares 6.500, , , , , , , , , , , dáltons (Da), além das proteínas purificadas ceruloplasmina, transferrina, albumina, IgG, α 1 -antitripsina e haptoglobina. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e os contrastes entre pares de médias foram avaliados por meio do teste de Tukey a 5% de significância (Zar, 1999). O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética e Bem-Estar Animal (CEBEA), em conformidade com as normas internacionais para uso de animais de experimentação, sob protocolo nº /

3 Conceição W. et al. RPCV (2015) 110 ( ) Resultados e Discussão A técnica de SDS-PAGE possibilitou a detecção de até 25 proteínas, com pesos moleculares variando entre e Da. Destas, nove proteínas de interesse foram subme tidas à análise estatística, entre elas: imunoglobulina A (IgA), ceruloplasmina, transferrina, albumina, imunoglobulina G (IgG) de cadeia pesada, haptoglobina, α 1 -glicoproteína ácida, IgG de cadeia leve e proteína com peso molecular Da (Tabela 1). Tabela 1 - Média e desvio-padrão das concentrações séricas de proteína total e das frações proteicas do soro sanguíneo de vacas das raças Nelore e Girolando sadias (Grupo controle), sororreagentes para brucelose (Grupo brucelose) e sororreagentes para leptospirose (Grupo leptospirose), criadas na região Centro-Oeste do Estado do Maranhão, obtidas pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Parâmetro Raças Nelore Girolando Proteína total (g/dl) Grupo controle 7,82±0,65Aa 7,90±0,66Aa Grupo brucelose 7,64±0,96Aa 8,17±0,83Ab Grupo leptospirose 7,85±0,96Aa 7,65±0,95Aa IgA (mg/dl) Grupo controle 191±67,1Aa 228±86,5Aa Grupo brucelose 215±59,7ABa 218±81,4Aa Grupo leptospirose 261±89,3Ba 261±102Aa Ceruloplasmina (mg/dl) Grupo controle 29,2±15,6Aa 38,6±15,8Aa Grupo brucelose 46,4±21,4Ba 45,2±13,0Aa Grupo leptospirose 33,9±14,6ABa 34,2±16,6Aa Transferrina (mg/dl) Grupo controle 96,0±37,0Aa 78,6±42,8Aa Grupo brucelose 96,2±74,2Aa 86,9±26,1Aa Grupo leptospirose 89,1±37,5Aa 80,8±38,8Aa Albumina (mg/dl) Grupo controle 2.750±400Aa 2.550±370Aa Grupo brucelose 2.510±360Aa 2.430±310ABa Grupo leptospirose 2.630±550Aa 2.240±380Bb IgG de cadeia pesada (mg/dl) Grupo controle 1.225±234Aa 1.585±973Aa Grupo brucelose 1.450±338Aa 1.434±403Aa Grupo leptospirose 1.411±508Aa 1.377±518Aa Haptoglobina (mg/dl) Grupo controle 16,4±17,8Aa 14,6±22,7Aa Grupo brucelose 12,7±6,47Aa 14,3±7,67Aa Grupo leptospirose 19,8±7,98Aa 14,7±4,08Aa α1-glicoproteína ácida (mg/dl) Grupo controle 15,6±16,6Aa 16,3±11,7Aa Grupo brucelose 15,9±9,98Aa 23,4±9,28Aa Grupo leptospirose 15,3±7,57Aa 17,9±6,79Aa IgG de cadeia leve (mg/dl) Grupo controle 763±192Aa 892±333Aa Grupo brucelose 912±387Aa 1.004±188Aa Grupo leptospirose 923±281Aa 939±353Aa Da (mg/dl) Grupo controle 361±125Aa 436±209Aa Grupo brucelose 389±105Aa 384±80,6Aa Grupo leptospirose 329±107Aa 334±111Aa Valores seguidos de letras maiúsculas iguais na mesma coluna e minúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). Não foram constatadas diferenças significativas entre as médias das concentrações séricas de proteína total entre os grupos experimentais, porém, observaram-se diferenças significativas entre as vacas das raças Nelore e Girolando do grupo sororreagente à brucelose, sendo superior o valor médio apresentado pelos animais da raça Girolando (Tabela 1). Contudo, os teores séricos de proteína total dos grupos experimentais apresentaram variações dentro dos limites considerados normais para a espécie bovina (Kaneko et al., 2008). As concentrações séricas de IgA, ceruloplasmina e albumina diferiram significativamente entre os grupos experimentais. Já as concentrações de IgG de cadeia pesada, haptoglobina, α 1 -glicoproteína ácida, IgG de cadeia leve, transferrina e da proteína de peso molecular Da não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos experimentais para as raças estudadas (Tabela 1). Dentre as proteínas constatadas no traçado densitométrico, cinco são consideradas proteínas de fase aguda: ceruloplasmina, transferrina, albumina, haptoglobina e α 1 -glicoproteína ácida. A maioria destas proteínas de fase aguda são glicoproteínas sintetizadas pelos hepatócitos e tecidos periféricos, como consequência de infecções ou lesões (Ceciliani et al., 2012). Os animais das raças Nelore e Girolando do grupo sorroreagente à leptospirose apresentaram maiores concentrações séricas de IgA, provavelmente devido ao estímulo imune humoral desencadeado pela infecção crônica por Leptospira (Meyer et al., 1995). As concentrações séricas de ceruloplasmina das vacas das raças Nelore e Girolando do grupo sororreagente à brucelose foram superiores às das vacas do grupo controle e sororreangentes à leptospirose (Tabela 1). A ceruloplasmina é uma proteína de fase aguda positiva de atividade moderada em bovinos e que foi utilizada como indicador de doenças inflamatórias e infecciosas nesta espécie animal (Okumura et al., 1991; Segelmark et al., 1997). De maneira semelhante, Fagliari et al. (2003) e Silva et al. (2011) constataram aumento significativo dessa proteína em bezerros infectados por Mannheimia haemolytica e Salmonella Dublin, respectivamente, em comparação com bezerros saudáveis. Com relação à concentração sérica de albumina, foram notados maiores valores nos animais do grupo controle (Tabela 1). As menores concentrações de albumina nas vacas da raça Girolando do grupo sororreagente à brucelose e à leptospirose deve-se ao fato de a albumina ser uma proteína de fase aguda negativa, cuja concentração diminui gradualmente e de forma mais evidente em processos inflamatórios e infecciosos crônicos (Kaneko et al., 2008). Não se constatou diferença significativa entre as concentrações séricas de transferrina dos grupos experimentais (Tabela 1). Por outro lado, Simplício et al. (2013) verificaram diminuição dos teores séricos desta 223

4 Conceição W. et al. RPCV (2015) 110 ( ) proteína em bovinos portadores de doença inflamatória recente. Quanto aos teores séricos de IgG, de cadeia leve e cadeia pesada, mesmo não havendo diferença significativa entre os grupos experimentais (Tabela 1), notou-se maiores concentrações nos animais dos grupos sororreagentes à brucelose e à leptospirose, provavelmente devido ao estímulo antigênico bacteriano (Tizard, 2009). Com relação às concentrações séricas de haptoglobina e α 1 -glicoproteína ácida não foram verificadas alterações significativas, diferentemente dos resultados relatados por Fagliari et al. (2007), que verificaram que a determinação dos teores séricos dessas proteínas é útil no monitoramento de inflamações agudas em bovinos com fotossensibilizacão hepatógena. De acordo com Horadagoda et al. (1999), a haptoglobina é a proteína de fase aguda mais estudada em bovinos e a mensuração desta proteína pode diferenciar melhor as inflamações agudas das crônicas, quando comparadas a outros testes hematológicos. As concentrações séricas da proteína de peso molecular de Da, não identificada nominalmente, foram menores nos grupos sororreagentes à brucelose e à leptospirose (Tabela 1), indicando que as infecções bacterianas influenciaram a dinâmica desta provável proteína de fase aguda de bovinos. Conclusões O fracionamento eletroforético das proteínas do soro sanguíneo de bovinos sadios ou sororreagentes à brucelose e à leptospirose possibilitou a identificação de cinco proteínas de fase aguda (ceruloplasmina, transferrina, albumina, haptoglobina e α 1 -glicoproteína ácida), além de duas imunoglobulinas (IgA e IgG). Notou-se maior concentração sérica de IgA e de ceruloplasmina nos animais da raça Nelore sororreagentes à brucelose e à leptospirose, enquanto que nos animais da raça Girolando sororreagentes à leptospirose notouse menor concentração sérica de albumina, indicando que estas enfermidades podem alterar a concentração das proteínas séricas em vacas. Bibliografia Andrade AC, Rodrigues BHN, Azevedo DMMR, Bezerra EEA, Santos FJS, Nascimento HTS, Magalhães JA, Castro KNC, Araujo Neto RB, Leal TM (2011). Tecnologias para a produção de leite na Região Meio-Norte do Brasil. In: Vilela D. (Org.), Sistemas de Produção de Leite para Diferentes Regiões do Brasil. EMBRAPA Gado de Leite, Juiz de Fora. Disponível em: < cnpgl.embrapa.br/sistemaproducao/content/sistemas-deprodu%c3%a7%c3%a3o-de-leite-para-diferentes-regi%c3%b5es-do-brasil> Acesso em 16 set Brasil (2004). Manual Técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose (PNCEBT). MAPA/DAS/DSA, Brasília, 132. 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