Ocorrência e Distribuição de Aflatoxina B 1. e Zearalenona em Soja

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1 Ocorrência e Distribuição de Aflatoxina B 1 e Zearalenona em Soja 42 Maria Antonia Calori-Domingues 1 ; Paula Municelli Rodrigues; Giancarllo Hercoton Ponce; Eduardo Micotti da Gloria; Carlos Tadeu dos Santos Dias 2 RESUMO A contaminação dos produtos agrícolas com micotoxinas não é uniforme e normalmente poucos grãos estão altamente contaminados. Nesta pesquisa 30 amostras de soja foram separadas em grãos inteiros e de defeitos determinados na classificação oficial da soja para verificar a ocorrência da contaminação por aflatoxina B 1 (AFB 1 ) e zearalenona (ZEA). Observou-se que: a) das 30 amostras de soja avaliadas 16 apresentaram no mínimo uma fração contaminada com AFB1 e dessas, 13 apresentaram contaminação estimada que variou de traços (<0,37 µg/ kg) a 7,9 µg/kg com média de 0,5 µg/kg de AFB1 e que a fração de grãos mofados foi a que apresentou a maior incidência de contaminação com AFB1 (50%) com média de 8,7 μg/kg. b) todas as 30 amostras apresentaram frações contaminadas com zearalenona e a contaminação média estimada das amostras foi de 16,7 µg/ kg. A co-ocorrência de AFB1 e ZEA nas amostras de soja foi observada em 56,7% das mesmas. Palavras chave: soja, aflatoxinas, zearalenona, ocorrência, classificação INTRODUÇÃO A ocorrência de micotoxinas em soja já foi relatada em alguns países. A presença de zearalenona, desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol e toxina HT-2 foram 1 ESALQ/USP Depto. Agroind. Alim. e Nutrição Laboratório de Micologia e Micotoxinas Cx Postal 09, Piracicaba, São Paulo, Brazil - macdomin@.usp.br 2 ESALQ/USP Depto de Ciências Exatas 451

2 detectadas nos Estados Unidos em grãos de soja danificados (JACOBSEN et al. (1995). SCHOLLENBERGER et al. (2007), avaliando produtos a base de soja na Alemanha, demonstraram a ocorrência de várias micotoxinas produzidas por espécies de Fusarium com predominância de Desoxinivalenol e zearalenona. No Brasil PONTES NETTO et al (2002) analisaram 21 amostras de soja provenientes da região norte do Paraná e observaram que 3 (14,3%) estavam contaminadas com aflatoxinas, 9 (42,9%) com zearalenona e 1 (4,8%) com ocratoxina A. Na mesma região SASSAHARA et al. (2003) avaliaram amostras de farelo de soja e observaram 1 amostra contaminada com aflatoxinas na concentração de 33,3 µg/kg e zearalenona em 1 amostra contaminada com zearalenona na concentração de 221 µg/kg. De acordo com trabalhos citados por MARTINELLI et al. (2004) a temperatura e umidade elevadas durante a maturação e a colheita das sementes de soja podem favorecer a infecção de fungos, como Phomopsis spp. e Fusarium spp. Além disso, a ocorrência de percevejos-sugadores responsáveis por picadas e retardamento da colheita da soja, favorecem a infecção por fungos, dentre estes, o Fusarium que podem se manter viáveis durante o armazenamento devido à sua localização interna nas sementes, tendo sua penetração facilitada pelos danos causados por percevejos. Segundo COSTA et al. (2003) estudos já realizados no Brasil têm mostrado que apesar de toda tecnologia disponível na produção de soja, a qualidade da semente proveniente de algumas regiões tem sido severamente comprometida em função dos elevados índices deterioração por umidade, de lesões de percevejos, de quebras, de ruptura de tegumento e de danos mecânicos o que contribui para a redução das qualidades fisiológica e sanitária das sementes. Embora os autores estejam visando a qualidade de sementes, esses fatores contribuem de forma significativa para a infecção de fungos em grãos, de uma maneira geral (CAST, 2003), indicando que existem condições para crescimento de fungos incluindo os potencialmente produtores de micotoxinas. Atualmente observa-se, no mundo e no Brasil, uma preocupação crescente com a contaminação de alimentos com micotoxinas. As exigências do mercado consumidor, aliadas a um maior rigor nas exigências sanitárias e fitossanitárias das agências governamentais nacionais e internacionais, demonstram a necessidade da implementação de programas de monitoramento da qualidade dos alimentos. O objetivo desse trabalho foi: avaliar a ocorrência e distribuição contaminação com aflatoxinas e zearalenona em grãos de soja separados em grãos inteiros e grupos de defeitos determinados na classificação oficial da soja. MATERIAL E MÉTODOS Trinta amostras de grãos de soja (2-3 kg), representativas de lotes provenientes dos estados de Goiás (11), Paraná (10), Mato Grosso (5) e São 452

3 Paulo (4), foram separadas em grãos inteiros e em grupos de defeitos (frações) de acordo com a Instrução Normativa n 11, (BRASIL, 2007). As frações de cada amostra de soja, após avaliação da atividade de água (A a ), foram trituradas individualmente para obtenção de granulometria 0,85mm (20 mesh), e armazenadas sob temperatura de congelamento (<-18 o C) até o momento das análises de micotoxinas. As micotoxinas foram extraídas com a mistura acetonitrila:h 2 O (75:25) e purificadas empregando-se coluna de imunoafinidade Aflastar TM (Romer Labs ) para aflatoxinas e NeoColumn para zearalenona (Neogen Corp.) A detecção e quantificação foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência e derivatização fotoquímica para as aflatoxinas. As metodologias apresentaram os seguintes limites de detecção e de Quantificação, respectivamente: AFB1 = 0,125 / 0,37 µg/kg; ZEA = 2,0 / 6,0 µg/kg. Após a análise de cada fração a contaminação estimada de cada amostra foi calculada considerando-se o percentual e a concentração de cada micotoxina, como indicado a seguir. Cont. = (%Int cont.)+(%pqa µg/kg)+(%mof µg/kg)+(%aq µg/kg)+(%fgdic µg/kg)+(%esv µg/kg)+(%mi µg/kg) 100% Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias de contaminação foram comparadas pelo teste de Tukey a concentração de 5% de probabilidade, empregando-se o programa SAS 2 (STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM, 2010). Na análise exploratória dos dados, foi necessário transformar os dados originais através da potência ótima de Box- Cox. A transformação utilizada foi igual a x -0,1 onde x corresponde à concentração em µg/kg AFB1 ou ZEA. Avaliou-se a correlação entre a contaminação média das frações e a contaminação média estimada das amostras pelo teste de correlação de Pearson ao nível de 5% de probabilidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO Atividade de Água: os valores médios A a observados entre as frações variou de 0,58 a 0,65 (Tabela 1). Apenas 7 frações apresentaram valores acima de 0,70 que é o valor máximo recomendado para evitar o crescimento da maioria dos fungos durante o armazenamento (GASGA, 1997). Distribuição de AFB 1 nas frações obtidas das amostras de soja: observou-se a presença das aflatoxinas B1 e B2, sendo que essa última em apenas 7,6% das frações e em concentrações inferiores a 1,5 µg/kg. Desta 453

4 maneira, optou-se pela avaliação apenas de AFB 1 que foi a de maior frequência nas frações das amostras. Na Tabela 1 estão apresentados os resultados obtidos da contaminação média de AFB1, percentual médio e atividade de água de cada fração. Das 30 amostras de soja avaliadas 16 (53,3%) apresentaram no mínimo uma fração contaminada com AFB 1 e dessas, 13 (representando 43,3% do total) apresentaram contaminação estimada que variou de traços (<0,37 µg/kg) a 7,9 µg/kg com média de 0,5 µg/kg de AFB 1. De acordo com a RDC n 7, da ANVISA (BRASIL, 2011), o limite máximo tolerado (LMT) para aflatoxinas varia de 5 a 20 μg/kg para diversos produtos agrícolas e alimentos. Embora apenas a média de concentração de grãos mofados tenha sido superior a 5 µg/kg, observou-se algumas amostras com frações com concentrações entre 55 e 61 ppb. A fração de grãos mofados foi a que apresentou o maior percentual de incidência de contaminação, 50%, seguida da fração de grãos ardidos+queimados (30,4%) e de matérias estranhas+impurezas (26,0%). A contaminação média com AFB 1 da fração de grãos mofados (8,7 μg/kg), foi estatisticamente maior (p<0,05), do que as frações GI, PQA, ESV e MI. As demais frações não diferiram entre si (p<0,05). Distribuição de ZEA nas frações obtidas das amostras de soja: do total de amostras avaliadas 25 (83,3%) apresentaram contaminação estimada de ZEA que variou de traços (< 6,0 µg/kg) a 104,3 μg/kg (Tabela 1). Os valores de LMT para ZEA para diversos produtos, de acordo com a RDC nº 7, variam de 200 a µg/kg. A contaminação estimada da amostra que apresentou maior concentração de ZEA foi 104,3 μg/kg e, portanto, abaixo do menor LMT estabelecido para ZEA. No entanto, as frações MOF, AQ e MI apresentaram valores médios entre 250 a 332 µg/kg e ocorreram amostras que apresentaram tais frações com valores entre e µg/kg. A incidência de ZEA na fração de grãos inteiros foi de 46,7% e nas demais frações variou de 69 a 100%, indicando que a contaminação com ZEA em grãos de soja é preocupante e, portanto deveria ser monitorada. A maior concentração média de ZEA foi observadas na fração MI, que foi estatisticamente semelhante às frações AQ e MOF e maior que nas demais frações. As frações de grãos inteiros, PQA e ESV não diferiram estatisticamente entre si (p<0,05), bem como não foi observada diferença estatística entre tais frações e a contaminação estimada média das amostras. A análise da correlação entre a concentração de zearalenona de cada fração com a concentração estimada na amostra indicou uma alta correlação positiva (p<0,05) para as frações MI (r=0,78) e correlação média para FGDIC (r=0,58) e PQA (r=0,46). Verificou-se também a co-ocorrência de AFB1 e ZEA nas amostras de soja. Das 30 amostras de soja avaliadas 17, representando 56,7%, apresentaram coocorrência de contaminação o que é uma observação preocupante mesmo que as concentrações médias observadas não tenham sido elevadas. Desse modo, a prática de utilizar determinadas frações que são segregadas durante as etapas de pré-limpeza dos grãos de soja, normalmente destinados à alimentação animal, poderá trazer prejuízos à saúde dos mesmos devido à maior possibilidade de contaminação com micotoxinas, como observado nesta pesquisa. 454

5 Tabela 1. Resultados da média, da faixa de concentração, da incidência e da concentração estimada de Aflatoxina B 1 (AFB 1 ) e Zearalenona (ZEA), do percentual e atividade de água das frações de soja. Observação FRAÇÕES INT PQA MOF AQ FGDIC ESV MI Conc. Estim. g/kg) AFB1 ( g/kg) 0,2 b (Tr - 2,8) 0,5b (Tr - 13) 8,7 a (Tr 61) 3,2 ab (Tr 55) 1,0 ab (0,6 12) ND b 2,4 b (Tr 57) 0,5 ab (Tr 7,9) Incidência AFB1 (%) 10,0 10,3 50,0 30,4 20,7 0,0 26,0 43,3 ZEA ( g/kg) 8,4 d (Tr 51) 22 cd (Tr 120) 275 ab ( ) 332 ab (Tr 3.584) 81 bc (Tr 457) Tr d (Tr 10) 250 a ( ) 16,7 cd (1,3 104) Incidência ZEA (%) 46,7 69,0 88,9 100,0 75,9 70,0 96,3 83,3 % Fração 82,3 (67-86) 8,2 (0,4-16) 1,3 (0,1-7,1) 1,8 (0,1-9,2) 7,3 (0,30-20,2) 0,2 (0,1-0,5) 0,7 0,1-1,4 - Aw 0,65 0,62 0,64 0,61 0,60 0,63 0,58 - Int: grãos inteiros; PQA: grãos partidos + grãos quebrados + grãos amassados; Mof: grãos mofados; AQ: grãos ardidos + grãos queimados; FGDICP: grãos fermentados + germinados + danificados + imaturos + chochos; Esv: grãos esverdeados; MI: matérias estranhas + impurezas; ND = Nãodetectada; Trç = Traços: concentração abaixo do limite de quantificação. Incidência considerando-se apenas as amostras que apresentaram a fração. Letras seguidas da mesma letra minúscula na mesma linha não diferem entre si (p<0,05) 455

6 Apoio Financeiro para o desenvolvimento dessa pesquisa e bolsa de iniciação científica: CNPq (proc. n o /2009-7) e FAPESP (proc. n o 2010/ ). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL. Ministério da Saúde, Resolução RDC nº 7, de Agência Nacional de Vigilância Sanitária Resolução ANVISA. Regulamento Técnico sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília DF, 09 março de 2011, pag (republicação). BRASIL. Instrução Normativa n o 11, de 15/05/2007. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Diário Oficial da União de 16/05/2007, Brasília, seção 1, p. 13, COSTA, N.P. ;MESQUITA, C.M.; MAURINA, A.C.;FRANÇA NETO, J.B.; KRZY- ZANOW SKI, F.C; HENNING, A.A. Qualidade fisiológica, física e sanitária de sementes de soja produzidas no Brasil. Rev. Bras. Sementes. 2003, v. 25, n. 1 p , COUNCIL FOR AGRICULTURAL SCIENCE AND TECNOLOGY (CAST). Mycotoxins: risk s in plant, animal and human systems. Washington, 2003, 199 p. (Task force report, 139). JACOBSEN, B. J.; HARLIN, K. S.; SWANSON, S. P.; LAMBERT, R. J.; BEA- SLEY, V. R.; SINCLAIR, J. B.; WEI, L. S. Occurrence of fungi and mycotoxins associated with field mold damaged soybeans in the midwest. Plant Disease,79 (1): 86-89, 1995 PONTES NETTO; ZANLUCHI, A.T.; SASSAHARA, M.; YANAKA, E.K., D. Micotoxinas em alimentação animal no período de maio/1997 a março/2001 no Laboratório de Toxicologia Veterinária da Universidade Estadual de Londrina Londrina PR. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 23, n. 1, p , jan./ jun MARTINELLI, J.A., BOCCHESE, C.A.C., XIE, W., O DONNELL, K. & KISTLER, H.C.Soybean pod blight and root rot caused by lineages of the Fusarium gra- 456

7 minearum and the production of mycotoxins. Fitopatol. bras., Brasília, v. 29, n. 5, p , STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM INSTITUTE. SAS user s guide. Version 9.2 ed. Cary, 2010 SASSAHARA, M.; YANAKA, E.K.; PONTES NETTO, D. Ocorrência de aflatoxina e zearalenona em alimentos destinados ao gado leiteiro na Região Norte do Estado do Paraná Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 24, n. 1, p , jan./jun SCHOLLENBERGER, M.; MÜLLER, H.M.; RÜFLE, M.; TERRY-JARA,H.; SUCHY, S.; PLANK,S.; DROCHNER, W. Natural occurrence of Fusarium toxins in soy food marketed in Germany. International Journal of Food Microbiology, v.113 p ,