Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias

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1 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Levantamento sorológico pelo teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) da lentivirose ovina em rebanhos do Rio Grande do Norte, Brasil Mestrando: Jean Berg Alves da Silva Orientadora: Maria Fátima da Silva Teixeira Fortaleza Ceará 2003

2 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Título: Levantamento sorológico pelo teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) da lentivirose ovina em rebanhos do Rio Grande do Norte, Brasil Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade animal Orientadora: Maria Fátima da Silva Teixeira Fortaleza Ceará Fevereiro de 2003

3 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Título: Levantamento sorológico pelo teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) da lentivirose ovina em rebanhos do Rio Grande do Norte, Brasil Aluno: Jean Berg Alves da Silva Aprovada em: Banca Examinadora: Prof. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira (Orientadora) Prof. Dr. Francisco Selmo Fernandes Alves Co-orientador/Examinador Prof. Dr. Roberto Soares de Castro Co-orientador/Examinador Fortaleza Fevereiro/2003

4 A ética não é uma etiqueta que a gente põe e tira. É uma luz que a gente projeta para segui-la com os nossos pés, do modo que pudermos, com acertos e erros, sempre, e sem hipocrisia. Herbert José de Souza (Betinho)

5 A todos àqueles que acreditam que a Educação é a única arma capaz de tirar um povo da escuridão eterna, formada pela miséria e pela ignorância. E aos que acreditam que só quando passarmos a fazer o que pregamos conseguiremos vencer o obstáculo da desigualdade social. Dedico.

6 Agradecimentos A Deus por estás sempre ao meu lado nos momentos mais difíceis iluminando e guiando-me pelo caminho mais correto, mesmo quando este não era o mais fácil a ser seguido. Aos meus pais Francisca Alves da Silva e Sizenaldo da Silva, que nunca deixaram de acreditar na minha potencialidade, e sempre investiram em educação, legado maior que um pai pode deixar a seu filho. A minha noiva Luzia Lidiane de Olvieira Moura, pela sua paciência, dedicação e compreensão nestes anos de convivência. Ao meu tio Francisco Celiton da Silva pela ajuda e paciência. A minha orientadora Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira, sempre tão atenciosa e compreensiva, grande incentivadora neste início de carreira. A Francisco Marlon Carneiro Feijó, orientador e amigo, que sempre esteve pronto à ajudar nos momento de dificuldade. Ao Prof. Dr. Roberto Soares de Castro, do qual, sem a ajuda a execução deste trabalho poderia estar comprometida. Ao Dr. Francisco Selmo Fernandes Alves pela colaboração e disposição de nos ajudar sempre que precisamos. Aos, mais que colegas, amigos de laboratório, Francisco Jarbas, Ney de Carvalho Almeida, Cesarino de Lima Júnior Aprígio, Lívia Maria, Cristina, Roberta, Jorge, Galileu Planck, Marcírio Frota, Isaac Neto. Aos companheiros de apartamento Márcio César Vasconselos, Kilder Dantas Filgueira, Edgar Pereira Neto que tantas lamentações suportaram. Aos amigos Karlos Yuri Fernandes Pedrosa, Jailson José de Santana, Policarpo Ademar Sales Júnior, Jeanne Souza e Silva, Raimundo Alves Barreto Júnior e Marcelo Barbosa Bezerra, que tiveram importante participação na parte inicial do experimento (coleta). Aos caprino-ovinocultores do Rio Grande do Norte, que apesar de sempre serem esquecidos, estão sempre aptos a colaborar com as pesquisas universitárias. E contribuíram de forma decisiva para a realização desta pesquisa.

7 Aos professores Marcos Fábio Gadelha e a Profª. Maria Isabel que sempre estiveram dispostos a ajudar no que fosse preciso. Aos professores que compõem o PPGCV/UECE que colaboraram para o nosso crescimento acadêmico. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias PPGCV, da Universidade Estadual do Ceará UECE. À CAPES pelo apoio financeiro concedido, que apesar do curto período de duração da bolsa, foi de suma importância para a continuação do trabalho. Ao Ministério da Ciência e Tecnologia MCT que viabilizou a realização deste trabalho com a liberação de recursos, que foi fundamental para a realização da coleta de amostras.

8 Resumo Maedi-Visna (MV) é uma enfermidade que provoca nos ovinos adultos uma infecção multisistêmica, muitas vezes assintomática de evolução crônica, que leva o animal a um quadro de definhamento progressivo com conseqüente queda da produtividade, podendo levar à morte do mesmo. Com o objetivo de fazer um levantamento sorológico da infecção pelo vírus Maedi/Visna no estado do Rio Grande do Norte, foram coletadas amostras de sangue de 315 ovinos, pertencentes a 32 diferentes rebanhos de 13 municípios do estado. Os soros foram submetidos ao teste de imunodifusão em gel de agarose utilizando um kit diagnóstico para Maedi/Visna fornecido pela Universidade Federal Rural de Pernambuco. Constatou-se que 21,3% dos animais amostrados apresentavam-se positivos para o teste, e que a porcentagem de animais positivos não variou entre as diferentes faixas etárias, nem entre os animais de raça pura e os SRD. Com base nos resultados obtidos conclui-se que a infecção pelo vírus Maedi/Visna está amplamente distribuída na região amostrada, afetando ovinos de ambos os sexos, adultos e jovens, de diferentes raças. Palavras-chave: lentivírus, ovinos e soro-diagnóstico

9 Abstract Maedi-Visna (MV), it is an chronic disease of that causes in the adult sheep, a subclinical infection, persistent virus-carrier state. It takes the animal to a progressive weakening with consequent fall of the productivity, causing death of the animal. The objective of this work was rising a serological test of the infection for the virus maedi/visna sheep in the herds of state Rio Grande do Norte. Samples of blood of 315 sheep were collected, to 32 different flocks of 13 municipal districts of the state. The serums were submitted to Immunodifusion Test in Agarose Gel (IDGA) using of a kit diagnosis for Maedi/Visna supplied by the Rural Federal University of Pernambuco. After the accomplishment of the tests it was verified that 21,3% of the animals resulted positive for the test. It was proven although the percentage of positive animals no change with the increase of the age.and with races. With base in the results was concluded that the infection for the virus Maedi/Visna is thoroughly distributed in the area of study, affecting adults and young sheep of both sexes and of different races. Key-Words: sheep, immunodiagnostic, lentivirus

10 Sumário 1. Introdução Revisão de Literatura Área de Coleta das Amostras Histórico e Importância da Ovinocultura Nordestina Maedi/Visna (MV) Caracterização da enfermidade Etiopatogenia da Maedi/Visna Resposta Imune frente a infecção pelo MVV Sintomatologia Diagnóstico da Infecção pelo MVV Controle e Profilaxia Distribuição da infecção por Maedi/Visna vírus Justificativa Hipótese Científica Objetivos Material e Métodos Amostras Local da Coleta Técnica de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) Análise Estatística Resultados e Discussão Conclusões e Perspectivas Artigo Referência Bibliográficas... 51

11 Introdução O estado do Rio Grande do Norte está inserido na região nordeste do Brasil contando com uma área correspondente a ,8 Km 2 e uma população de habitantes (IBGE Censo 2000). A criação de ovinos tem sido vista como uma atividade empreendedora, gerando empregos e renda para as populações, funcionando como fixadora do homem no campo, e como fonte de proteína pela população mais carente, uma vez que os animais são utilizados tanto para a própria subsistência quanto como fonte de renda pela venda de animais, carne e pele. Embora tenha toda esta importância para a sobrevivência das famílias e para a economia de alguns municípios, a maioria das criações de ovinos no sertão nordestino ainda é feita de forma extensiva e rudimentar, sem que haja um adequado controle sanitário, nutricional ou reprodutivo dos animais. Estes fatos associados levam à baixa produtividade dos rebanhos, o que muitas vezes caracteriza-se como um entrave para o crescimento desta atividade, tornando-se assim um negócio pouco lucrativo não atraindo investimentos do setor privado nem do setor público. O que forma um círculo vicioso, que se não há investimentos o atual quadro não muda. Provavelmente uma das principais causas pela baixa produtividade, deste rebanho, sejam as enfermidades infecto-contagiosas que acometem estes animais, dentre estas afecções a lentivirose ovina, provocada pelo vírus Maedi-Visna (MVV), inspira maiores cuidados com relação a sua possível ocorrência no rebanho potiguar, uma vez que esta caracteriza-se por provocar nos animais uma pneumonia progressiva e/ou uma infecção multisistêmica, muitas vezes assintomática de evolução crônica (Oliver et al, 1981a). Que leva o animal a um definhamento progressivo com conseqüente queda da produtividade (Pritchett, 1994). Durante muitos anos o semi-árido nordestino foi considerado livre desta enfermidade, ou pelo menos não existiam dados que confirmassem a sua ocorrência nesta região. Porém nos últimos anos algumas pesquisas vieram confirmar a sua ocorrência em alguns estados nordestinos como no Ceará (Almeida et al, 2003) e Pernambuco (Abreu et al, 1998), onde a sorologia positiva de um número significativo

12 de animais indicaram a necessidade de uma melhor caracterização da atual situação dos demais estados do Nordeste, para que possam ser tomadas as medidas necessárias visando o controle de tal enfermidade que caracteriza-se por ser a região que possui o maior plantel do Brasil com animais, correspondendo a 52% do rebanho nacional (Ministério da Agricultura, 2002). A ovinocultura ocupa hoje a terceira posição em importância dentre as atividades pecuárias do Rio Grande do Norte, perdendo em significatividade apenas para a bovinocultura e para carcinicultura. Portanto dado o alto poder debilitante e a facilidade de disseminação e a falta de pesquisas sobre a infecção pelo Maedi-Visna Vírus neste Estado, se faz necessária a implementação de um trabalho de investigação visando caracterizar a atual situação desta infecção no rebanho ovino norte-riograndense para que possa ser montado um plano de ação visando o seu controle, caso seja necessário ou a prevenção de sua introdução nas fronteiras deste estado.

13 Revisão de Literatura 1- Área de Coleta das Amostras 1.1- Rio Grande do Norte Localizado próximo à linha do Equador, no hemisfério sul-ocidental, Nordeste da Região Nordeste do Brasil, apresenta características climáticas bem específicas, como o verão seco e a presença do sol durante, mais ou menos, 300 dias no ano. O Rio Grande do Norte possui uma área com mais de Km2, cerca de 0,62% do território nacional, limitando-se a leste e ao norte com o Oceano Atlântico, a oeste com o Ceará e ao sul com a Paraíba (SEBRAE, 2001a). O clima norte-rio-grandense é caracterizado por dois tipos bem caracterizados como descrito abaixo (Cidades Potiguares, 2002): a) Tropical Quente, Úmido e Sub-úmido - Predominante no litoral leste, que vai de Baía formosa até as proximidades do município de Touros, abrange também alguns municípios vizinhos ao litoral, assim como as partes mais elevadas das serras João do Vale, Martins e São Miguel. Uma das características desse tipo de clima é a quantidade de chuvas, que varia de 800 a 1200 mm por ano, distribuídas entre os meses de fevereiro e julho. As maiores precipitações ocorrem na região de Natal. Outra característica é a temperatura média de 26º C, amplitude térmica variando de 18 à 38ºC. b) Tropical Quente e Seco (semi-árido) - Predominante no restante do Estado, apresenta características como: poucas chuvas, com médias precipitações entre 400 e 600 mm anuais, distribuídas entre os meses de janeiro e abril. Os lugares onde ocorre esse tipo de clima ficam sujeitos aos fenômenos das secas. É nesta região onde encontra-se a maioria dos rebanhos ovinos do estado. Nela também está inserida predominantemente a vegetação do tipo caatinga que serve como alimento aos animais que na maioria das vezes são criados extensivamente nesta região (SEBRAE, 2001 C ). No campo econômico a agropecuária vem tendo uma participação bastante variável no PIB potiguar, variação esta determinada principalmente pelos fatores naturais, como a má distribuição das chuvas. Em 1996 a participação agropecuária no PIB foi de 10,6% já em 2000 esta participação caiu para 7,0% (SEBRAE, 2001a).

14 Ainda de acordo com o SEBRAE (2001b) os pólos dinâmicos da agropecuária do Estado estão associados, principalmente, à carcinicultura, à agricultura irrigada, à cajucultura, à cana-de-açúcar e ao desenvolvimento da pecuária, sendo os principais rebanhos, em ordem decrescente de efetivos, o bovino, ovino e caprino. No que diz respeito à caprinovinocultura, o Rio Grande do Norte, através de entidades empresariais e do Governo, vem dando amplo destaque a sua reestruturação, colocando o setor no cenário de grande possibilidade econômica, pelas potencialidades que o Estado apresenta em recursos naturais apropriados à atividade e às condições favoráveis de mercado. Com relação especificamente a ovinocultura o Rio Grande do Norte detém um rebanho de cabeças (Brasil, 2000). Observa-se que este rebanho é formado principalmente por animais SRD, porém o número de animais mestiços vem aumentando significativamente nos últimos anos devido a constante procura por raças exóticas visando o melhoramento dos rebanhos (SEBRAE, 2001b).

15 2. Histórico e Importância da Ovinocultura Nordestina A ovinocultura vem se constituindo nos últimos anos como uma atividade de alta rentabilidade, quando explorada de forma correta e sensata, o que não a descaracteriza como uma das atividades responsáveis pela fixação do homem no meio rural servindo como fonte de proteína e renda. Ao longo dos anos esta atividade foi desenvolvida de forma extensiva sem que fosse realizado qualquer tipo de controle sobre os animais dificultando assim o diagnóstico dos problemas responsáveis pela baixa produtividade. Porém com o início da produção em larga escala alguns destes problemas, passaram a atuar como verdadeiros entraves ao crescimento desta atividade, dentre estes problemas podemos destacar os de ordem sanitária, especialmente as doenças infecto-contagiosas que atuam diminuindo a produtividade e comprometendo a lucratividade. Os ovinos, possivelmente, fizeram parte dos primeiros animais domésticos introduzidos pelos colonizadores portugueses no Brasil a partir de 1535 ( Araújo, 1980). A medida que os sertões foram sendo desbravados em decorrência da expansão das fronteiras agrícolas, os rebanhos ovinos foram sendo confinados em determinadas áreas do Nordeste, onde, sendo submetidos à ação da seleção natural, formaram grupos étnicos bem diferenciados e que foram adaptando-se às condições adversas do semiárido nordestino, os quais constituem o nosso rebanho ovino atualmente (Santana, 2002). As constantes secas periódicas comuns do Nordeste, que ocasionam freqüente escassez de água e pastagem, associados com o sistema ultra-extensivo de criação, provocaram novos ajustamentos na relação animal/meio ambiente. Os grupos étnicos originais sofreram, ao longo do tempo, redução no seu porte e características produtivas (Santana, 2002). A ovinocultura deslanada explorada, essencialmente, para carne e pele, constitui-se em importante fonte de renda, amenizando a fome protéica que assola grande parte do Brasil. Os cruzamentos industriais de ovelhas deslanadas do Nordeste com machos de raças exóticas, aliados a outras tecnologias, tais como manejo, nutrição, sanidade e reprodução, certamente possibilitarão maior produtividade numérica e ponderal dos rebanhos (Nunes et al, 1997).

16 A criação de caprinos e ovinos, na Região, é uma atividade básica e generalizada que permeia a grande maioria das propriedades rurais, revestindo-se de grande importância sócio-econômica para o homem do campo, sendo responsável pelo fornecimento de 40% de toda proteína animal consumida pela população rural (Alves, 2002).

17 3. Maedi/Visna (MV) 3.1 Caracterização da enfermidade Dentre as principais doenças infecciosas que acometem os ovinos pode-se destacar a virose provocada pelo vírus Maedi/Visna (MVV), que pertence à família Retroviridae, subfamília Lentivirinae, gênero Lentivírus, que inclui além do MVV, o vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e os vírus das imunodeficiências em felinos (FIV), bovinos (BIV), Símios (SIV) e humanos (HIV), além do vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (AIEV) (Small et al., 1989). Maedi/visna ou pneumonia progressiva dos ovinos como também é conhecida, é uma doença debilitante de ovinos adultos, que é causada por um grupo de retroviroses não oncogênicas, estreitamente relacionadas conhecidas como lentiviroses, que têm como principais órgãos alvo os pulmões, o sistema nervoso central, as articulações e as glândulas mamarias (Ellis & DeMartini, 1985). Visna e o Maedi são respectivamente enfermidades inflamatórias do sistema nervoso central e dos pulmões, e são manifestações de uma mesma infecção vírica (Pritchett, 1994). O Maedi/Visna vírus assim como os demais lentivírus causam uma doença de característica crônica em ovinos, afetando principalmente os pulmões, além de outros órgãos dos animais infectados. A pneumonia intersticial provocada pelo MVV é bastante semelhante a que acomete humanos associada a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo-1 (Mornex et al, 1994). A Maedi/Visna, também conhecida como pneumonia progressiva dos ovinos (PPO), assim como as demais lentiviroses tem por característica principal causar uma doença crônica com um período de incubação longo (Shih et al., 1992). Uma propriedade comum ao MVV e o CAEV é a persistência que têm estes vírus no organismo do animal, mesmo na presença de resposta imunológica, devido a replicação destes vírus ser bastante restrita (Gendelman et al, 1986).

18 3.2 Etiopatogenia da Maedi/Visna Os lentivírus de pequenos ruminantes (MVV e CAEV) são partículas esféricas, envelopadas com aproximadamente 100 nm de diâmetro com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas duas moléculas idênticas de RNA fita simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg 2+ e proteínas do nucleocapsídeo (Gonda et al., 1986). Os lentivírus em geral replicam-se bem em culturas de células (macrófagos, linfócitos CD4 e/ou fibroblastos) oriundas do hospedeiro natural do vírus. In vitro todos os lentivírus infectam macrófagos dos seus hospedeiros naturais, porém esta infecção nem sempre resultam em uma replicação produtiva (Joag, 1996). Uma característica importante dos lentivírus de pequenos ruminantes é a sua capacidade de variação genética, que pode resultar no aparecimento de variantes mais evoluídas e adaptadas ao hospedeiro, o que aumenta a dificuldade no controle da enfermidade uma vez que a adaptação destes vírus pode se dar a tal ponto que eles conseguem esquivar-se da defesa imunológica do animal com elevada destreza (Callado et al, 2001). Os vírus pertencentes a família Retroviridae, na qual estão inseridos os Lentivírus, carregam a sua própria enzima polimerase que é uma DNA polimerase dependente de RNA chamada de transcriptase reversa, assim denominada por que executa uma reação (RNA Æ DNA) que é exatamente o inverso da conhecida transcrição DNAÆ RNA. O DNA transcrito incorpora-se a DNA da célula hospedeira podendo permanecer integrado de forma latente sendo passado para a geração seguinte de células ou ser transcrito produzindo novos vírus que irão infectar células adjacentes (Tortora et al, 2000). O genoma dos lentivírus, está bastante relacionado com outras retroviroses, sendo que os três principais genes funcionais são: pol, gag e env. O produto do gen gag é uma proteína precursora que é posteriormente clivada em três proteínas: a proteína da Matriz (MA), do capsídeo (CA) e do nucleocapsídeo (NC). A proteína MA é essencial na produção de vírions infectantes, a proteína CA é a mais abundante do vírus e elicita a produção de anticorpos durante a infecção e a proteína NC confere proteção ao RNA viral. O gen pol codifica a proteinase viral (transcriptase reversa), codifica ainda as

19 proteínas endonuclease, integrase e dutpase. Já o gene env codifica as glicoproteínas do vírus que irão ter papel principal na formação do envelope viral (Joag, 1996). Inicialmente os vírus Maedi e Visna eram estudados separadamente sendo que o primeiro considerado como o agente etiológico de uma pneumonia progressiva nos ovinos e o segundo o agente e encefalomielites não supurativas que causam uma paralisia progressiva. Tendo ficado comprovado que estes dois vírus apresentam uma relação estreita tanto antigenicamente quanto nas suas propriedades físicas, químicas e biológicas passando a ser denominado Maedi/Visna (Thormar & Helgadóttir, 1965). O vírus Maedi/Visna possui ainda uma estreita relação com o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), sendo que as proteína estruturais destas duas espécies são geralmente muito similares, porém não idênticas, o que pode ser comprovado pela reação de imunoprecipitação que é evidenciada quando o soro de um caprino infectado com CAEV reage com antígenos oriundos de culturas de MVV ( Dahberg et al, 1981). Banks et al (1983) comprovaram a infecção cruzada de caprinos com o MVV e de ovinos com o CAEV através de infecções experimentais demonstrando que estes vírus são capazes de infectar e reproduzir a enfermidade em outros hospedeiros, não sendo portanto espécie-específico como os demais lentiviroses. A principal via de infecção do MVV é a aerógena, uma vez no organismo do animal o vírus tem como células de eleição para multiplicar e disseminar-se pelo organismo os macrófagos ou monócitos (Lairmore et al, 1987). Porém podem disseminar-se do local de infeção inicial até os linfonodos regionais através das células dendríticas, que atuam não só como carreadoras de vírus, mas também como amplificadoras do vírus uma vez que este é capaz de replicar-se nestas células (Ryan et al, 2000). Tendo também especial importância a contaminação via colostro ou leite principalmente em rebanhos onde o manejo não se dá de forma intensiva (Pritchett, 1994). De acordo com Haase et al (1982), a infecção crônica característica apresentada pelo MVV é derivada do crescimento restrito que este vírus apresenta in vivo. No animal a produção de vírus acontece em taxas baixas, e consequentemente as alterações patológicas associadas com a replicação do vírus também acontecerão de maneira lenta.

20 3.3 Resposta Imune frente a infecção pelo MVV De acordo com Tizard (1985) a resposta imune contra os vírus pode ser observada de duas formas principais ou esta resposta é contra as próprias proteínas do vírus, principalmente às do capsídeo e as do envelope como no caso do MVV, ou impedindo a infecção da célula alvo pelo vírus. Esse impedimento da infecção celular pode ocorrer através do bloqueio da adsorção de um vírus recobrindo à célula alvo, iniciando a virólise mediada pelo complemento, causando agrupamento dos vírus reduzindo assim o número de unidades infectantes disponíveis, ou pela estimulação da fagocitose dos vírus pelos macrófagos. Alguns vírus têm a capacidade de se evadir da resposta do hospedeiro por diversos mecanismos. Os lentivírus em especial fazem essa evasão principalmente pela variação antigênica, conseqüência da variação genética que estes microrganismos apresentam. Na infecção pelo MVV os anticorpos neutralizantes são produzidos apenas lentamente. Como resultado, a seleção de novas variantes virais é ineficiente, e os vírus antigenicamente diferentes só surgem de forma lenta. Esses anticorpos neutralizantes são incapazes de reduzir a carga viral no ovino afetado, não ocorrendo assim recidivas cíclicas como no caso da AIE (Tizard, 1998). Tizard (1998) afirma, ainda, que outro fator que contribui para que o MVV escape da destruição pelos anticorpos é o poder que ele apresenta de infectar macrófagos e monócitos. E na maioria dessas células, a replicação do vírus pára após o seu RNA ter sido reversamente transcrito em DNA pró-viral. Desta forma as células ficam persistentemente infectadas pelo vírus sem expressar antígenos virais. O vírus pode, portanto, persistir e se disseminar sem provocar um ataque imunológico. Pritchett (1994) afirma que em infecções experimentais com MVV pode-se observar, que os anticorpos fixadores do complemento aparecem algumas semanas depois da inoculação, alcançando a concentração máxima por volta de dois meses PI, permanecendo constantes durante todo o decorrer da enfermidade. Já os anticorpos neutralizantes aparecem bem mais tarde, sendo que na maioria dos casos só alcançam a

21 concentração máxima um ano PI, permanecendo constantes a partir de então até o fim da enfermidade. No caso das infecções por lentivírus tanto a resposta humoral quanto a celular estão presentes. No início da infecção os anticorpos produzidos são contra as proteínas de um grupo específicos e não protegem contra a infecção. Já os anticorpos produzidos contra as proteínas do envelope são capazes de neutralizar os vírus. Mas de uma forma geral os animais infectados com lentivírus produzem anticorpos que são capazes de neutralizar amostras laboratoriais dos vírus, mas que na maioria das vezes são ineficazes contra os vírus selvagens ( Joag, 1996). Brodie et al (1992), afirmam que a infecção pelo MVV pode ocorrer sem que haja a presença de uma resposta imune pelo menos no início da infecção, nestes casos os vírus podem ser detectados por técnicas de PCR ou Imunoblot nas células macrofágicas do animal infectado. Jolly et al (1989), investigando a ação de anticorpos neutralizantes sobre a replicação do MVV em culturas celulares de fibroblastos e de macrófagos, constataram que quando acrescentava-se altas concentrações de anticorpos (Ac) neutralizantes nas culturas a taxa de replicação do mesmo era bastante diminuída, porém este efeito era bem mais significativo na cultura de fibroblastos, sendo que na cultura de macrófagos os títulos do vírus permaneceram elevados. Este fato da ação menos eficiente dos Ac. neutralizantes nos macrófagos pode ser considerado um dos motivos pelos quais haja uma persistência da infecção in vivo mesmo na presença de grandes concentrações de anticorpos neutralizantes circulantes. Klein et al (1985) demostraram que a produção de anticorpos neutralizantes ocorre de forma diferente dependendo da cepa de MVV envolvida na infecção, eles observaram que na infecção com amostras líticas de MVV ocorre uma maior produção de anticorpos neutralizantes do que quando a cepa envolvida na infecção é não lítica. Este fato poderá ter influência no diagnóstico da enfermidade. Com relação a resposta celular o MVV também apresenta algumas particularidades como os demais lentivírus. Por exemplo, ao contrário do que ocorre na

22 maioria das infecções víricas, a células T não tem papel preponderante na resposta imune contra a infecção pelo MVV, apesar de ser comprovado que tanto linfócitos T do grupo CD8 quanto do subgrupo CD4 estão presentes na Resposta Imune (RI) contra esta infecção, o seu papel ainda não foi bem esclarecido deixando dúvidas sobre sua real importância no combate a infecção, apesar das pesquisas indicarem que a resposta antiviral é otimizada quando a concentração de CD4 e CD8 é elevada ( Reyburn et al, 1992). Diferentemente das lentiviroses de primatas, que afetam primariamente os linfócitos T CD4 e macrófagos, levando a uma diminuição da resposta imune principalmente pela infecção das células CD4 com sua conseqüente morte, o MVV não tem afinidade por este tipo celular, provavelmente pela ausência de receptores moleculares na superfície destas células para que o vírus sofra aderência. Esta não adesão às células CD4 pode explicar o fato de que a Maedi-Visna não acarreta uma imunodepressão tão acentuada quanto nas lentiviroses de primatas e felinos (Gorrel et al, 1992).

23 3.4 Sintomatologia O vírus Visna causa uma doença progressiva envolvendo o sistema imune e o sistema nervoso central (Small et al., 1989). A sintomatologia aparece de forma progressiva e lenta, os primeiros sinais são uma ligeira alteração na forma de andar, que afeta especialmente o trem posterior, tremor dos lábios e inclinação anormal da cabeça, e raramente pode causar cegueira, estes sintomas podem ser creditados à ação do visna no sistema nervoso central (Moojen, 1998). Já o Maedi leva a uma perda de peso acentuada, com dificuldades na respiração provocada por uma pneumonia intersticial progressiva, às vezes pode ocorrer tosse seca, mas sem secreção, e geralmente o animal vem a óbito por infecções secundárias que levam a um quadro de pneumonia aguda, mas não pela ação direta do maedi. A enfermidade pode apresentar-se ainda sob a forma de mamite e artrite que podem ser uni ou bilaterais (Moojen, 2001). Além de uma sintomatologia respiratória, com dispnéia progressiva, o animal afetado pode apresentar ainda aumento dos linfonodos, das articulações e tecido periarticular e uma perda de peso acentuada (Lairmore et al, 1988). Alguns animais podem apresentar ainda lesões no sistema nervoso central (Olivier et al, 1981b) e mamite por infiltração linfocitária (Luján et al, 1991). Na necropsia de animais infectados pode-se observar que os pulmões não colabam no momento de abertura da cavidade torácica, apresentando-se firmes, pode-se verificar ainda áreas de aderência entre a pleura e parede torácica. Microscopicamente pode-se notar a presença de uma pneumonia intersticial com infiltração leucocitária e hiperplasia de tecidos linfóides do animal (Luján et al, 1991). Já nas glândulas mamárias pouca ou nenhuma lesão macroscopicamente é observada, enquanto que microscopicamente pode-se observar obstrução parcial dos ductos por proliferação de tecido linfóide (Luján et al, 1991). A doença se manifesta principalmente em animais com mais de dois anos, mesmo sendo comprovada a sua transmissão através do leite e colostro. Este fato devese ao longo período de incubação que pode ter o vírus. Uma importante forma de

24 transmissão é o contato direto do animal sadio com as secreções respiratórias do animal infectado, sendo o reservatório os próprios animais doentes (Moojen, 1998).

25 3.5 Diagnóstico da Infecção pelo MVV O início da infecção pela característica sintomatológica da enfermidade a MV pode ser confundida com outras enfermidades do Sistema Nervoso Central (SNC), como abscessos, traumatismos ou enfermidades parasitárias. Posteriormente o curso cada vez mais prolongado, a ausência de febre e a pleosite no líquido céfalo-raquidiano (LCR) são indicativos da infecção pelo MVV (Pritchett, 1994). Entretanto pela própria característica da infecção persistente pelos lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR), a forma mais prática de diagnóstico é a sorologia, pois a presença de anticorpos demonstra indiretamente a presença da infecção. Por outro lado, o diagnóstico da infecção pelo isolamento e identificação do agente não é rotineiramente empregado por ser demorado e bastante dispendioso (Callado et al., 2001). Outro fator que contribui para a viabilidade deste imunodiagnóstico é que de uma forma geral as infecções víricas, diferentemente da infecções bacterianas, apresentam uma resposta imune de duração longa. Apesar das razões para que isto ocorra não estejam completamente esclarecidas, mas uma explicação provável para tal fato estaria ligada à persistência do vírus no interior das células, em forma latente ou com uma replicação lenta (Tizard, 1998). Tanto a artrite encefalite caprina quanto a MV são infecções persistentes que podem ser diagnosticadas através da pesquisa de anticorpos. Mas apesar destas duas viroses estarem relacionadas antigenicamente, o uso de seus antígenos para verificar a infecção cruzada parece não apresentar bons resultados, sendo desaconselhado este uso pela organização internacional de enpizootias (OIE). Para as lentiviroses de pequenos ruminantes os antígenos virais de maior importância são a glicoproteína de envelope gp135, e a proteína do capsídeo p28. (OIE, 2002). Sendo que a glicoproteína do envelope gp135 é o maior sítio de ação dos anticorpos neutralizantes contra o MVV in vivo (Carey, 1993) Destas forma o diagnóstico do Maedi-Visna pode ser obtido através de exames laboratoriais como: o ELISA, imunodifusão radial (RIA), Ensaio de Imunoblot e imunodifusão em gel de agarose (IDGA) sendo este último recomendado pela OIE. Por ser de fácil aplicabilidade e não exigir equipamentos nem instalações sofisticadas o IDGA é a forma de diagnóstico mais utilizada em todo mundo, principalmente em

26 programas de controle da doença que já são empregados em vários países (Moojen, 1998). Além da fácil aplicabilidade o IDGA tem alta especificidade o que acaba credenciando-o para a realização dos diagnósticos de triagem nos programas de controle da enfermidade(varea et al, 2001). Saman et al (1999) afirmam que apesar do grande número de métodos de diagnóstico sorológicos que podem ser empregados na identificação da infecção pelo MVV apenas dois são utilizados rotineiramente com sucesso o IDGA e o ELISA. De acordo com Tortora et al (2000) a reações de precipitação envolvem a reação de antígenos solúveis com anticorpos IgG e IgM na formação de agregados moleculares grandes e entrelaçados semelhantes a uma tela de rede. Os testes de imunodifusão consistem em reações de precipitação, realizadas em gel de ágar em uma placa de Petri ou em uma lâmina de microscópio. Neste desenvolve-se uma linha de precipitação visível entre os orifícios no ponto em que é alcançada a relação ótima entre antígeno e anticorpo. Para Tizard (1998) o teste de imunodifusão é um método simples de demonstração de antígenos por parte dos anticorpos que pode ser utilizado com facilidade na identificação de antígenos virais. O autor afirma ainda que o teste de imunodifusão pode ser considerado de uma forma geral grupo específico desta forma ele é mais indicado na tentativa de identificação do gênero a que o vírus pertence, não sendo, portanto, algumas vezes possível fazer a identificação de que espécie viral está envolvida na infecção. Segundo Vitu (1982) o teste de IDGA é capaz de identificar animais experimentalmente infectados com o MVV cerca de quatro a cinco meses após a infecção, e afirma ainda que este teste mostrou-se mais sensível que o teste de fixação do complemento, sendo que quando comparado com o ELISA mostrou resultados bastante correlacionados, apesar de quando o teste utilizado é o ELISA a infecção poder ser identificada de forma mais precoce (sete semanas PI). O que foi confirmado por Larsen et al (1982), que infectando ovinos experimentalmente observaram que presença de anticorpos precipitantes podia ser detectada de forma mais precoce e com maior intensidade que a fixação do complemento.

27 O teste de IDGA pode ser utilizado tanto para a detecção de anticorpos anti- MVV no soro sangüíneo quanto no colostro de animais infectados, pode esta presença de anticorpos no colostro ser utilizada na detecção da infecção no rebanho (Alkan & Tan, 1998). As técnicas sorológicas são as mais amplamente utilizadas no diagnóstico de Maedi/Visna pela sua praticidade e possibilidade de realização de diagnósticos de rebanhos com maior facilidade funcionando como testes de triagem. Porém técnicas mais especificas de diagnóstico já foram desenvolvidas por laboratórios especializados, visando a identificação do vírus pela presença do seu ácido nucléico em células de animais infectados, sendo que o principais são a reação em cadeia de polimerase (PCR), hibridização in situ e Southern blotting (Johnson et al, 1992). No entanto para a realização destes testes é necessário o uso de equipamentos sofisticados o que muitas vezes pode inviabilizar o uso dos mesmos em muitas regiões do país por conta dos altos custos para a sua realização e pela própria falta de técnicos treinados para sua realização (OIE, 2002).

28 3.6 Controle e Profilaxia Métodos de controle da infecção pelo vírus Maedi/Visna incluem o sacrifício de todos os ovinos soropositivos (algumas vezes incluindo seus cordeiros) e repetição de testes a intervalos de aproximadamente seis meses, até que no mínimo três testes negativos sejam obtidos. Como alternativa, os cordeiros podem ser isolados ao nascimento, não tendo acesso ao colostro e leite de ovelhas positivas, e sendo submetidos a aleitamento artificial (Mooojen, 2001). Howers et al (1983) afirmam que a separação dos cordeiros no momento do nascimento das mães infectadas, contribui para a redução da expansão de maedi/visna, e que este método de controle pode ser aplicado quando se trata de animais de alto valor zootécnico pois os descarte das crias seria economicamente desaconselhado. A técnica de PCR pode ser utilizada na rotina quando um controle mais rigoroso da erradicação de Maedi/Visna está sendo almejado, de forma que, quando os animais de determinado rebanho apresentarem sorologia negativa para enfermidade este controle passe a ser feito com o PCR, que se constitui num método de diagnóstico mais eficaz na detecção de falsos negativos (Knowles, 1997).

29 3.7 Distribuição da infecção por Maedi/Visna vírus A infecção pelo MVV é endêmica em todo mundo, já tendo sido diagnosticada em países como o Reino Unido (Watt et al.., 1992), Islândia (Sigurdson et al, 1954), Etiópia (Tibbo et al, 2001), Brasil (Dal Pizzol et al, 1988) dentre outros países. A Tabela 1 resume a situação atual da disseminação da Maedi/Visna no mundo de acordo com os dados da Organização Internacional de Epizootia e traça a evolução da enfermidade nos últimos anos segundo os dados da instituição. Com relação a ocorrência de Maedi/Visna no Brasil esta teve seu diagnóstico sorológico ou isolamento do vírus comprovado em vários estados como: Ceará (Almeida et al, 2003), Pernambuco (Abreu, 1998), Minas Gerais, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e Paraná (Moojen, 2001)

30 Tabela 1. Evolução da infecção pelo Maedi/Visna Vírus nos principais países onde a enfermidade já foi diagnosticada. País África do Sul Alemanha Andorra ? Argentina ? Áustria + (1996) a (1996) (1996) (1996) (1996) Bélgica Brasil +? +? b Bulgária Canada ? +? +? Chile () +() Ciprus +? +? +? +? +? +? Dinamarca Eslováquia +? +? +? +? +? +? Espanha + (1996) +() +() +() +() Estado Unidos Estônia ? +? Etiópia Finlândia + (1996) (1996) (1996) (1996) (1996) França Grã Bretanha Grécia + +() +() +() +() +() Holanda Hungria Irlanda (1986) (1986) (1986) (1986) (1986) (1986) Islândia (1965) (1965) (1965) (1965) (1965) (1965) Israel (1991) (1991) (1991) (1991) (1991) + Luxemburgo +? +? + +? +? +? Noruega +() +() +() +?() +? + Polônia +? + (1997) (1997) (1997) (1997) Portugal República Theca Suécia Suíça Fonte: (ano) Ano em que foi registrada a última ocorrência da enfermidade. +? Levantamentos sorológicos e isolamento do agente mas sem manifestação clínica da enfermidade () Enfermidade restrita a certas zonas 0000 Enfermidade nunca registrada... Se dispõe de dados sobre a enfermidade - Enfermidade nunca registrada.

31 4 Justificativa No estado do Rio Grande do Norte a criação de ovinos assume relevante importância econômica para pequenos, médios e grandes criadores que começam a despontar nesta atividade. O Rio Grande do Norte conta hoje com um rebanho de cabeças (Brasil, 2000), porém nenhuma pesquisa a respeito da ocorrência de Maedi/Visna no rebanho deste Estado foi realizada, o que preocupa dado o seu alto poder debilitante, a doença pode provocar sérias perdas econômicas, comprometendo a viabilidade da produção. Sendo assim o levantamento sorológico a ser feito no presente trabalho se justifica, pela importância do rebanho ovino para o Estrado do Rio Grande do Norte e pela gravidade potencial da infecção pelo vírus Maedi/Visna.

32 5 Hipótese Científica A presença ou não do MVV no rebanho ovino do estado do Rio Grande do Norte precisa ser estabelecida visando a implementação de medidas de controle desta enfermidade, ou no caso de sua ausência para que sejam tomadas medidas profiláticas visando a não entrada deste vírus no estado.

33 6 Objetivos 6.1 Objetivo Geral Realizar o levantamento sorológico da infecção por MVV no rebanho do Estado do Rio Grande do Norte, através de teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA), utilizando-se um antígeno nacional. 6.2 Objetivos Específicos Determinar a soro prevalência de Maedi/Visna pelo teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) em diferentes cidades do Rio Grande do Norte. Verificar o a influência do tipo de manejo, da idade dos animais e do padrão zootécnico dos animais (raça pura ou SRD) na prevalência da doença entre os rebanhos. Averiguar a necessidade de serem adotados providências visando o esclarecimento do criador sobre os prejuízos causados pela Maedi/Visna e orientá-los junto as entidades visando medidas profiláticas que controlem a disseminação da enfermidade.

34 7 Material e Métodos 7.1 Amostras O número de amostras foi determinado com base nas orientações do Centro Pan Americano de Zoonoses (1979), para estudo da prevalência de enfermidades crônicas por amostragem e obedecendo as recomendações da Austudillo (1979), através da fórmula abaixo: n = p(100 p)g 2 (p.e/100) 2 n = número de amostras a serem trabalhadas p = prevalência estimada (25% obtida em pré-experimento) g 2 = fator determinante do grau de confiança de 95% (1,96 2 4) e = margem de erro admissível (20 %) da prevalência estimada n = 25.(100 25).4 2 = = 7500 = 300 (25.20/100) Desta forma foram coletadas 315 amostras de sangue ovino por venopunção jugular utilizando-se tubos vacuntainer descartáveis não-heparinizados, sendo mantidas sob refrigeração até chegarem ao laboratório de Microbiologia Veterinária da ESAM, onde foram centrifugadas para a obtenção do soro, sendo este aliquotado em frascos eppendorf, congeladas e mantidos a 20ºC até serem conduzidos ao Laboratório de Virologia Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), onde foram realizados os exames. No momento da coleta alguns dados dos animais como sexo, grupo racial e idade eram anotados visando posteriores análises epidemiológicas dos dados. A idade era determinada de acordo com o desenvolvimento da dentição dos animais tendo em vista a falta de dados cadastrais por parte dos criadores. Eram coletadas em média dez amostras por propriedad, sendo que três eram animais que ainda não haviam entrando no período de reprodução, um reprodutor e sei

35 eram fêmeas em período reprodutivo. Esta distribuição foi feita tentando imitar as distribuição característica dos rebanhos amostrados. Com relação a distribuição racial foram coletadas amostras de animais da raças Dopper, Somalis, Morada Nova, Santa Inêse animais sem padrão racial definido (SRD). O que totalizou 44 animais com padrão racial definido e 271 SRD.

36 7.2 Local da Coleta Os 315 animais utilizados no estudo pertenciam a 32 diferentes propriedades localizadas em treze municípios do Estado do Rio Grande do Norte, concentrados principalmente na região homogênea mossoroense que concentra a maior parte do rebanho ovino do Rio Grande do Norte, Fig. 1. Sendo que esta região possuia em 1997 de acordo com dados do IBGE cerca de 48,8% do total de ovinos criados no Rio Grande do Norte (SEBRAE, 2001). O sistema de manejo nas propriedade era do tipo extensivo com os animais pastando livremente na vegetação nativa. O clima predominante na região onde foram coletadas as amostras é o BSwh (muito seco) segundo a classificação de Koppen. A vegetação predominante é a do tipo caatinga arbustiva arbórea (SEBRAE, 2001a). Figura 1 Municípios com animais amostrados para o teste de IDGA para o diagnóstico de Maedi/Visna no Rio Grande do Norte.

37 7.3 Técnica de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) O levantamento sorológico para infecção pelo vírus Maedi Visna foi realizado pelo método de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA), que consiste na detecção de linhas de precipitação nos casos positivos, decorrentes da reação antígeno-anticorpo. Para a execução do teste de IDGA utilizaram-se placas de Petri descartáveis de 90x15mm com agarose a 1%. Após a solidificação das mesmas as placas eram perfuradas com roseta metálica padrão que possui sete perfurações. A disposição das perfurações, bem como dos soros a serem testados, dos anticorpos padrões positivos e do antígeno na placa estão representados na Fig.2. Eram depositados nos poços 25 OGH cada componente (antígeno, soro padrão e soro teste). Os Kits contendo o antígeno, soro padrão positivo e o ágar que foram utilizados no teste diagnóstico foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Roberto Soares de Castro, da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), sendo este confeccionado nesta universidade (Abreu et al, 1998). Após a deposição de todos os componentes nas placas estas foram acondicionadas em câmara úmida, a temperatura ambiente (25ºC) durante o período de realização dos exames. A leitura era feita em duas etapas: a primeira 48h e a segunda 72h depois do início do acondicionamento. A interpretação dos testes era feita de acordo com o esquema representado na Fig.2.

38 6 5 1 Ag Figura 2 Disposição dos soros na placa de imunodidfusão com as respectivas interpretações: Poços: 1 e 4 padrões positivos; 2 soro teste positivo, 6 reação inespecífica; 3 e 5 soros teste negativos 7.4 Análise Estatística Os resultados obtidos neste experimento serviram para avaliar a infecção pelo maedi/visna vírus no rebanho ovino do Rio Grande do Norte. Os fatores como: faixa etária, sexo e grupo racial foram submetidos a análise estatística com o teste de duas proporções, com distribuição normal, adotando-se o nível de significância igual a cinco porcento (valor crítico de Z = 1,96), conforme recomendado por Berquó et al (1981).

39 8 Resultados e Discussão O levantamento sorológico para infecção pelo MVV, realizado através do teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA), nos 315 ovinos, oriundos de 32 rebanhos pertencentes a 13 municípios do estado do Rio Grande do Norte, revelaram um percentual de 21,3% de animais soropositivos para a infecção pelo vírus Maedi/Visna. Estes resultados foram inferiores a taxa de infecção encontrada por Almeida et al (2001), em levantamento semelhante realizado no Estado do Ceará onde os autores encontraram uma prevalência de 31% de animais soropositivos para a infecção pelo MVV em animais que apresentavam algum tipo de sintomatologia respiratória. Estes resultados foram ainda superiores aos encontrados por Schaller et al (2000) Baumgartner et al (1990) que pesquisando a presença de anticorpos contra Maedi/Visna na Suíça e na Alemanha encontraram uma prevalência de nove e 12 %, respectivamente. Já Kita et al (1990) em pesquisa feita com amostras de soro ovino na Polônia encontraram resultados semelhantes aos nossos, com uma prevalência em torno de 24% de animais infectados. Nossos resultados foram também semelhantes aos encontrados por Simard & Morley (1991), que observaram uma prevalência ficando em torno de 19% em média sendo que a prevalência entre as províncias canadenses variou bastante. 21% Positivos Negativos 79% Figura 3: Resultado do IDGA para Maedi/Visna em relação aos 315 animais amostrados no estado do Rio Grande do Norte. Fortaleza, 2003.

40 Dos 32 rebanhos amostrados 28 (87%) apresentaram pelo menos um animal com sorologia positiva para Maedi/Visna, o que caracteriza a ampla distribuição da infecção por Maedi/Visna pelos rebanhos da área amostrada. Caporale et al (1983) estudando a distribuição da infecção pelo MVV na Itália diagnosticaram 39 rebanhos infectados num universo de 93 rebanhos estudados determinando uma prevalência de 41,3% dos rebanhos naquele país. Já Campbell et al (1994) encontraram 69,9% de rebanhos infectados em Ontário no Canadá, e associaram esta alta prevalência ao tipo de manejo dos rebanhos uma vez que estes autores observaram que havia uma correlação positiva entre a prevalência da infecção e: o tempo de permanência dos animais na propriedade, o uso de reprodutores de outras fazendas, a não separação dos cordeiros da mãe no momento do nascimento e a idade dos animais. Estes fatores também podem ter sido determinantes nesta alta prevalência encontrada em nosso estudo, tendo em vista que as práticas de manejo adotadas na região amostrada são precárias, não havendo nenhum tipo de separação dos animais por idade, sendo comum a aquisição de animais sem quaisquer atestado de sanidade, não havendo na maioria das vezes descarte orientado dos animais o que aumenta o tempo de permanência dos animais no plantel e sendo comum a manutenção de animais de idade já avançada no rebanho (Costa et al, 2001).

41 Não se observou diferença estatiscamente significativa (p > 0,05) entre os diferentes grupos etários (Tabela-2). Discordando, portanto do que foi afirmado por Simard & Morley (1991) que afirmaram que a incidência de Maedi/Visna aumentou com a idade nos rebanhos canadenses. O que também foi observado por Molitor et al (1979) que encontraram 23% de ovinos jovens infectados, enquanto esta taxa aumentava para 80% entre os animais acima de sete anos de idade, o que levou os autores a afirmarem que os animais mais velhos apresentam maior incidência da enfermidade. Tabela 2 Freqüência de ovinos soropositivos para Maedi/Visna, na população amostrada de acordo com a faixa etária, em animais criados no Rio Grande do Norte. Fortaleza, Faixa Etária Freqüência de Número de animais Número de animais soropositivos (%) soropositivos < 12 meses 10 a meses 23 a > 42 meses 27 a Total a Letras iguais numa mesma coluna significa que não houve diferença estatística. Teste de duas proporções. Valor crítico de Z = 1,96 (p < 0,005).