FORMAÇÃO DE COACERVATOS COMPLEXOS DE QUITOSANA E PROTEÍNAS DO SORO DO LEITE E OBTENÇÃO DE MICROCÁPSULAS
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- Ayrton Lemos Sousa
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1 FORMAÇÃO DE COACERVATOS COMPLEXOS DE QUITOSANA E PROTEÍNAS DO SORO DO LEITE E OBTENÇÃO DE MICROCÁPSULAS Bianca N. Barreto 1-2, Hiléia K. S. Souza 2, Cristina T. Andrade 1 *, Maria do Pilar F. Gonçalves 2 1- Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano, IMA- Universidade Federal do Rio de Janeiro, Caixa Postal 68525, Rio de Janeiro, Brasil- ctandrade@ima.ufrj.br 2- REQUIMTE, Departamento de Engenharia Química, Faculdade de Engenharia, Universidade do Porto Rua Dr. Roberto Farias, Porto, Portugal- pilarg@fe.up.pt A coacervação complexa envolve a associação reversível de dois polímeros e apresenta algumas vantagens frente a outras técnicas como a ausência de solvente orgânico e condições brandas de temperatura. O presente estudo teve como objetivo a investigação sobre a formação de coacervatos complexos entre um isolado de proteínas do soro do leite (WPI) e quitosana. A faixa de formação foi determinada por análises turbidimétricas. A influência do ph das soluções e da proporção proteína:polissacarídeo foram determinadas experimentalmente. A condição que apresentou um maior rendimento, a proporção quitosana:wpi de 1:5 em ph 5,5 foi empregada na obtenção de microcápsulas de óleo de girassol. Palavras-chave: Coacervação complexa, Quitosana, Proteínas do soro do leite, Microencapsulação. Formation of chitosan/whey protein complex coacervates and microcapsules The complex coacervation involves the reversible association (ionic) of two polymers and presents some advantages in comparison to other techniques such as the absence of organic solvent and mild temperatures. The purpose of this study was to prepare complex coacervates between whey protein isolate (WPI) and chitosan. The coacervation range was determined by turbidity analysis. The solutions ph and the protein:polysaccharide ratio were determined experimentally. The condition that led to the highest yield, chitosan:wpi ratio of 1:5 at ph 5.5 was used to obtain sunflower oil microcapsules. Keywords: Complex coacervation, Chitosan, Whey protein isolate, Microencapsulation. Introdução Complexos intermoleculares em macromoléculas podem ser estabilizados por interações eletrostáticas, ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e ligações covalentes. Tais interações originam zonas de junção intermoleculares e a intensidade dessas forças dependerá tanto da composição quanto da conformação molecular [1]. O comportamento das fases de sistemas de biopolímeros em soluções aquosas desempenha um importante papel na química de colóides. Em muitos casos, misturas de biopolímeros são instáveis e podem apresentar segregação com a formação de duas fases distintas [2]. As interações entre biopolímeros podem ter natureza repulsiva; nesse caso, o sistema será formado por duas fases, cada qual rica em um dos biopolímeros e pobre no outro [3-6]. Por outro lado, as interações podem ter natureza atrativa, na qual o sistema apresentará duas fases, uma delas rica em polímeros, fase concentrada ou coacervato, e a outra pobre em polímeros [7]. Este fenômeno é denominado coacervação, resulta de interações fracas e interações não-específicas entre polímeros
2 (eletrostáticas, van der Waals, ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas) e dá origem a complexos solúveis ou insolúveis [8-12]. O fenômeno de coacervação pode ser denominado como simples ou complexo. A coacervação simples é caracterizada por sistemas formados por apenas um polímero, se esse biopolímero for misturado a um mau-solvente ou a um não-solvente ocorrerá separação de fases, já que as interações polímero-polímero são favorecidas [1]. A coacervação complexa ocorre quando há a mistura de dois ou mais polímeros e um solvente. No caso dos dois polímeros serem altamente compatíveis, como no caso de duas moléculas opostamente carregadas, elas interagirão e se concentrarão na fase pobre em solvente, sob a forma de complexo [1]. As principais interações entre os biopolímeros são de natureza eletrostática, e são dependentes do ph e da força iônica. A presença de cargas opostas é o fator mais importante na coacervação complexa. No caso de os biopolímeros não apresentarem cargas opostas, a coacervação complexa não ocorrerá [13]. Deste modo, a densidade de cargas das macromoléculas é também um fator crítico. A coacervação complexa apresentará baixo rendimento se a densidade de cargas for baixa e, ao contrário, o rendimento máximo será alcançado quando existir equivalência entre as cargas opostas (atingida por ajustes no valor de ph) dos polímeros em questão. O ph tem um importante papel na formação dos complexos devido ao efeito do grau de ionização sobre os grupos funcionais dos biopolímeros (principalmente grupamentos amino e grupamentos carboxílicos). Por esta razão, ao considerar-se uma mistura que contenha um polissacarídeo catiônico e uma proteína, o rendimento máximo de coacervato será obtido acima do ponto isoelétrico da proteína, mais precisamente no ph de equivalência elétrica das cargas da proteína. Nesse valor de ph, os dois biopolímeros apresentam cargas opostas em igual número, o que resulta em um máximo de atração eletrostática [1]. A obtenção de coacervatos depende ainda da relação das frações molares dos biopolímeros na mistura. Para cada sistema considerado, um ponto máximo de rendimento é obtido de acordo com um índice específico. Além disso, parâmetros externos físicos e mecânicos podem influenciar o processo de coacervação complexa e afetam tanto a formação quanto a estabilidade dos complexos intermoleculares [1]. Certas propriedades do par proteína/polissacarídeo nos complexos são geralmente melhores do que as propriedades dos materiais sozinhos. Assim, junto ao interesse no fenômeno biológico, a coacervação complexa é pragmaticamente empregada em alimentos [14,15], recuperação de proteínas a partir de subprodutos [16-18], cosméticos, fármacos (micro e nanoencapsulação) [19-20] e medicina, como biomateriais [21].
3 A quitosana é um polissacarídeo linear resultante da desacetilação parcial da quitina em presença de solução alcalina. Quando o grau de desacetilação é maior ou igual a 50%, o produto é denominado quitosana. Sua estrutura química é formada por unidades constitucionais repetitivas de 2-amino-2-desoxi-β-(1,4)-D-glicose (poli(d-glicosamina)) e 2-acetamida-2-desoxi-β-(1,4)-Dglicose (N-acetil-D-glicosamina). O isolado do soro de leite (WPI) é um dos subprodutos resultantes da fabricação do queijo e da caseína, contém aproximadamente 20% das proteínas totais do leite de vaca. As duas principais proteínas encontradas no soro do leite são a β-lactoglobulina e a α-lactoalbumina. Além destas, são encontradas em menores proporções a soroalbumina bovina, imunoglobulinas, peptonas, lactoferrina, transferrina, lisozima e enzimas [22]. Nesse trabalho, foi estudada a formação de coacervatos no sistema quitosana/ WPI. As melhores condições para a formação dos coacervatos foram usadas na microencapsulação de óleo de girassol. Experimental Materiais A quitosana foi obtida a partir da desacetilação de quitina proveniente de cascas de camarão cinza (Penaus schmitti). A quitina foi submetida ao processo de desacetilação alcalina realizada em duas etapas. A primeira etapa ocorreu em presença de solução de NaOH a 30% por 5 horas, sob agitação a temperatura ambiente. A segunda etapa foi realizada em solução de NaOH a 60%, por 5 horas sob refluxo e atmosfera de N 2. O WPI (comercialmente denominado como LACPRODAN 80) foi fornecido pela Arla Food Ingredients (Viby, Dinamarca). Todos os demais reagentes analíticos foram fornecidos pela Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). Determinação da faixa de formação dos coacervatos A faixa de formação dos complexos quitosana/wpi foi determinada por análise turbidimétrica. Foram preparadas soluções de quitosana e WPI em tampão ácido acético/acetato de sódio 100 mm em ph4,0; 5,0; 5,5 e 6,0. As medidas de absorbância da amostra de WPI em presença de diversas concentrações de quitosana foram realizadas em espectrofotômetro UV/Vis da marca Jasco modelo V-630 BIO (Hachioji, Japão) calibrado a 500 nm. A absorbância medida foi utilizada para plotar curvas de absorbância em função da concentração de quitosana na mistura. Determinação do rendimento dos coacervatos O rendimento dos complexos formados foi determinado em função da relação quitosana:wpi e do ph das soluções. As misturas foram obtidas a partir de soluções a 1% (p/p) de proteína e do polissacarídeo com um mesmo valor de ph em proporções que variaram de 1:25 a 1:3
4 (quitosana:wpi). As soluções de WPI e de quitosana foram misturadas e deixadas em repouso por 24 h. Após este período as soluções foram centrifugadas e o sobrenadante descartado. As massas de coacervato formadas em cada uma das condições foram pesadas e o cálculo de rendimento foi feito com base na massa úmida e na massa seca. Para a determinação da massa seca, o complexo coacervato foi submetido à secagem em estufa a 105 C até peso constante. As análises de cada uma das amostras foram feitas em triplicata. Obtenção de microcápsulas Os complexos formados por misturas de quitosana/wpi foram analisados quanto à capacidade de encapsular substâncias oleosas. A composição avaliada apresentava ph 5,5 e foi preparada a partir de soluções de proteína e polissacarídeo a 1% (p/p) na proporção de 5:1. O óleo microencapsulado foi o óleo de sementes de girassol de marca comercial. As soluções foram preparadas como descrito anteriormente e a dispersão do óleo de girassol (0,5% em relação à massa de WPI empregada) na solução de WPI foi realizada com o auxílio de um homogeneizador do tipo Turrax. Em seguida, a solução de quitosana foi adicionada à emulsão de WPI com óleo de girassol sob agitação constante. As misturas foram deixadas em repouso sob temperatura ambiente por 24 h e ao fim deste período uma alíquota do precipitado foi submetida à análise em um microscópio óptico Leica DMLB acoplado a câmara fotográfica MPS 30 Leica, cujo aumento variou de 5 a 40 vezes com uma lente objetiva n 7. Resultados e Discussão A turbidimetria pode ser empregada para avaliar as melhores condições em que ocorre a interação eletrostática entre os polímeros. A faixa de concentração para o polissacarídeo em relação ao volume total de solução foi de 0,001 a 0,028g/dL. A Figura 1 mostra as curvas de turbidez em função da concentração de quitosana para os diferentes valores de ph. A influência da concentração de quitosana na mistura foi investigada para misturas, cuja faixa de ph variou entre 4,0 e 5,5. Não foi possível determinar a faixa de formação de coacervatos em ph 6 porque, neste valor de ph, a quitosana utilizada não se dissolveu completamente. Inicialmente, a adição de quitosana aumentou a absorbância da solução em todas as faixas de ph Figura 1 Curvas de turbidez da mistura das soluções em função da concentração de quitosana analisadas. Porém, em ph 4, a partir da concentração de 0,006 g/dl houve um decréscimo na
5 turbidez da solução, esse fato pode ser explicado por este valor de ph encontrar-se abaixo do ponto isoelétrico das proteínas de maior incidência no WPI. Deste modo, os complexos formados não são estáveis e a adição de quitosana à solução promove a diluição da solução de WPI, o que diminui a turbidez da solução e, por conseqüência, o valor da absorbância. As mistura formadas pelas soluções em ph 5,0 e 5,5 apresentaram um comportamento similar. Inicialmente, com a adição de quitosana à solução, houve um aumento na turbidez. Para as misturas em ph 5,0, a partir da concentração aproximada de 0,010 g/dl de quitosana na solução, a curva turbidimétrica apresentou um comportamento de estabilidade, no qual a absorbância permaneceu idêntica, ainda que tenha havido um aumento na concentração de quitosana. No caso da mistura em ph 5,5, este comportamento foi menos evidente e tornou-se visível a partir da concentração de 0,018 g/dl. Apenas com base nas curvas turbidimétricas das misturas em ph 5,0 e 5,5 não foi possível definir-se qual dos valores de ph apresentava uma maior formação de complexos. A mistura com ph 5,0 apresentou uma maior turbidez em presença de quitosana do que aquela formada por soluções em ph 5,5. Porém, a ph 5,0 a mistura já apresentava uma maior turbidez inicial da solução de WPI sem a adição de quitosana. O estudo de formação e rendimento dos coacervatos foi realizado para soluções com ph 5,0 e 5,5. A Figura 2 mostra os coacervatos formados em diferentes proporções de quitosana:wpi. Os coacervatos obtidos em ph 5,5 apresentaram um rendimento aparente maior do que aqueles obtidos em ph 5,0. Dentre as amostras em ph 5,0, a proporção quitosana:wpi que mostrou uma maior formação de precipitado foi a de 1:10, enquanto que para as amostras em ph 5,5 esta proporção foi de 1:5, como mostra a Figura 3. Figura 2 Coacervatos formados em diferentes proporções quitosana:wpi para ph 5,0 e ph 5,5 A formação de precipitado apresentou um comportamento não linear em ambos os valores de ph. Para as misturas com proporções de quitosana:wpi de 1:25 e 1:20, o rendimento em coacervato
6 Figura 3 Formação de coacervato úmido em função das diferentes proporções quitosana:wpi em ph 5,0 e 5,5 úmido foi semelhante nas duas faixas de ph analisadas. Foi observado um aumento na massa de precipitado com o decréscimo da proporção quitosana:wpi. Para o ph 5,0, este aumento ocorreu até a proporção de 1:10, a partir da qual houve um decréscimo no rendimento. Já para o ph 5,5 o aumento na formação de precipitado ocorreu até a proporção de 1:5 e foi ligeiramente menor para a proporção 1:3. Os maiores rendimentos foram observados nestas duas proporções. Estes resultados sugerem que a composição dos coacervatos sofre alteração tanto em função da variação do ph, quanto em função da quantidade de quitosana adicionada ao meio. Além disso, os complexos formados em ph 5,0 apresentaram uma maior fluidez do que aqueles formados em ph 5,5. Essa característica deverá ser estudada futuramente por análises reológicas. Os precipitados obtidos foram analisados quanto ao rendimento em base seca e os resultados estão representados na Figura 4. O rendimento em matéria seca dos precipitados obtidos em ph 5,0 não seguiu os resultados obtidos em massa úmida. O maior rendimento em matéria seca neste ph foi encontrado para os complexos formados pela proporção quitosana:wpi de 1:15. Desse modo, supõe-se que o teor de umidade, nesta faixa de ph, é independente da proporção de mistura e deve estar relacionado com a composição do coacervato. Já para os complexos formados em ph 5,5, apesar de as amostras apresentarem um grau de umidade não linear, o maior rendimento em matéria seca foi obtido para a proporção quitosana:wpi de 1:5, assim como o encontrado para a massa úmida. Figura 4 Rendimento em massa de coacervato seco por 100 g de mistura em função das diferentes proporções quitosana:wpi em ph5,0 e 5,5 Os resultados obtidos sugerem que, nas condições utilizadas, dentre os valores de ph e proporções analisadas, a proporção de 1:5 (quitosana:wpi) em ph 5,5 é a composição que apresentou um maior rendimento em coacervatos, tanto em massa úmida quanto em massa seca.
7 Portanto, essa foi a composição escolhida para a avaliação da capacidade do complexo formado pelo par quitosana/wpi de microencapsular substâncias oleosas. Os precipitados formados em presença do óleo de girassol foram analisados por microscopia óptica. As micrografias revelaram a presença de partículas esféricas, semelhantes às microcápsulas com tamanho variável entre 6 e 10 µm como mostra a Figura 5. Figura 5 Micrografia óptica do precipitado formado em ph 5,5 na proporção quitosana:wpi de 1:5 em presença de óleo de girassol: aumento de 5x sob luz não polarizada (A) e luz polarizada (B); aumento de 10x sob luz não polarizada (C) e luz polarizada (D); aumento de 40x sob luz não polarizada (E) e luz polarizada (F) A análise da superfície das partículas esféricas formadas pode ser feita a partir da técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV), já a dispersão do tamanho das partículas pode ser determinada com maior precisão pela técnica de espalhamento de luz. Conclusões O par quitosana/wpi é capaz de formar complexos coacervados quando o polissacarídeo e as proteínas apresentam cargas opostas. Deste modo, os valores de ph nos quais ocorre a formação dos complexos estão compreendidos acima do ponto isoelétrico das proteínas e abaixo do pka do polissacarídeo. Nas condições avaliadas, o melhor rendimento em formação de coacervatos foi obtido em ph 5,5 em uma proporção quitosana:wpi de 1:5. Os coacervatos assim formados permitiram a formação de partículas esféricas, capazes de microencapsular substâncias oleosas. São necessários mais estudos para a determinação da composição e caracterização reológica dos coacervatos, assim como da eficiência de retenção de substâncias oleosas por parte destes complexos.
8 Agradecimentos Os autores agradecem a CAPES (Brasil) e à Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) pelo apoio financeiro (Convênio FCT/CAPES 2008). H. K. S. de Souza agradece a bolsa de Pós-Doutorado concedida pela FCT (SFRH/BPD/37514/2007). Referências Bibliográficas 1. C. Schmitt; C. Sanchez; S. Desobry-Banon; J.Hardy Critical Reviews in Food Science and Nutrition 1998, 38, K. Zhang;G. Karlstrom; B. Lindman Journal of Physical Chemistry 1994, 98, P.A Albertsson, Partition off cell particles and macromolecules, Wiley Interscience, New York, V.B. Tolstoguzov in Functional properties of protein-polysaccharides mixtures, J.R. Mitchell; D.A. Ledward, Ed.; Elsevier Applied Science Publishers, Londres, 1986, p V.B. Tolstoguzov Food Hydrocolloids 1986, 4, C. Sanchez; C. Schimitt; V.G. Babak; J. Hardy Nahrung, 1997,41, H.G. Bungenberg de Jong; H.R. Kruyt, Colloid Science, Elsevier, Londres, L. Picullel; B. Lindman Advances in Colloid Interface 1992, 41, A.P Imeson; D.A Ledward; J.R Mitchell Journal of Science of Food Agricultural 1977, 28, A.P Imenson; P.R. Watson; J.R. Mitchell; D.A. Ledward Journal of Food Technology 1978, 13, L. Picullel; K. Bergfeldt; S. Nilsson in Biopolymer Mixtures, S.E. Harding; S.E. Hill; J.R. Mitchell, Ed.; Nottingham University Press, Nottingham, 1995, p J. Xia; P.L. Dubin in Protein-polyelectrolyte complexes, P.L. Dubin; J. Bock; R. Davis; D.N. Schulz; C. Thies, Ed. Springer-Verlag, Berlin, 1994, p W.S. Chen; G.A. Henry; S.M. Gaud; M.S. Miller; J.M. Kaiser; E.A. Balmadeca; R.G. Morgan; C.C. Baer; R.P. Borwankar; L.C. Hellgeth; J.J. Strandholm; G.L. Hasenheuttl; P.J. Kerwin; C.C. Chen; J.F. Kratochvil; W.L. Lloyd, European Patent , 1989; Application, Kraft, Inc M. Vikelouda; V. Kiosseoglou Food Hydrocolloids 2004, 18, K. Damianou; V. Kiosseoglou Food Hydrocolloids 2006, 20, H.F. Alomirah; I. Alli International Dairy Journal 2004, 14, F. Xing; G. Cheng; B. Yang; L. Ma Journal of Applied Polymer Science 2004, 91, F. Xing; G. Cheng; B. Yang; L. Ma Journal of Applied Polymer Science 2005, 96, C.P. Champagne; P. Fustier Current Opinion on Biotechnology 2007, 18, S.K. Daniel Biotechnology and Bioengineering 2007, 96, C. Schimitt; C. Sanchez; S. Desobry-Banon; J.Hardy Critical Reviews in Food Science and Nutrition 1998, 38, V.C. Sgarbieri, Proteínas em alimentos protéicos: propriedades, degradações, modificações, Livraria Varela, São Paulo, 1996.
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