INFLUÊNCIA DAS CARACTERÍSTICAS TEXTURAIS

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1 INFLUÊNCIA DAS CARACTERÍSTICAS TEXTURAIS DE SÍLICAS MESOPOROSAS UTILIZADAS COMO SUPORTE ENZIMÁTICO NA SÍNTESE DE ÉSTERES ETÍLICOS A PARTIR DO ÓLEO DE NABO FORRAGEIRO (Raphanus sativus L.) S. M. P. MARCUCCI 1*, E. TREVISAN 1, L. S. da SILVA 1, P. S. THEODORO 1, R. Z. RAIA 1, P. A. ARROYO 1, G. M. ZANIN 1. 1 Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Engenharia Química *Autor correspondente para contato: silviomarcucci@gmail.com RESUMO: No presente trabalho, sílicas mesoporosas (MCM-41 e SBA-15) foram sintetizadas e utilizadas como suporte enzimático para imobilização de lipases. As sílicas e os biocatalisadores foram caracterizados por difratometria de raios X, adsorção/dessorção de nitrogênio e em relação à quantidade de proteína presente nos suportes e na enzima liofilizada. Por fim, os biocatalisadores imobilizados e a enzima livre foram avaliados na reação de transesterificação do óleo de Nabo Forrageiro. O biocatalisador preparado com a MCM-41 foi o mais eficiente (26 g ésteres/mg proteína) e os resultados sugeriram que o suporte que oferece menor restrição à difusão do substrato é o que proporciona melhor desempenho catalítico das enzimas imobilizadas. PALAVRAS-CHAVE: MCM-41; SBA-15; lipases; óleo de Nabo Forrageiro. ABSTRACT: In this work, mesoporous silicas (MCM-41 and SBA-15) were synthesized and used as support for lipase immobilization. Characterization of mesoporous and biocatalysts were performed by X-ray diffraction, nitrogen adsorption/desorption and amount of protein loading in the support. Finally, the immobilized biocatalysts and free enzyme were evaluated in the transesterification reaction of Forrage Turnip oil. The enzyme immobilized in the MCM-41 support was the most efficiently (26 g ester/mg protein) and the results suggested that the support has lower diffusivity restriction of substrates have a better performance in the transesterification reaction. KEYWORDS: MCM-41; SBA-15; lipases.; Forrage Turnip oil. 1. INTRODUÇÃO O Nabo Forrageiro é uma oleaginosa que possui em suas sementes, teor médio de óleo que varia entre 40 e 54% do seu peso, podendo este, ser extraído por prensagem mecânica com bons rendimentos quando comparado a outros tipos de oleaginosas, como, por exemplo, a soja. Além disso, seu custo de produção por hectare é menor que outros tipos de cultura e, por seu óleo apresentar características antinutricionais, não é um competidor do ponto de vista de matérias-primas comestíveis utilizadas como insumo para a produção de biodiesel (DOMINGOS et al., 2008).

2 O Biodiesel é definido como uma mistura de ésteres alquílicos, o qual pode ser usado como um substituto parcial ou total do óleo diesel de petróleo quando em conformidade com algumas normas de qualidade como, por exemplo, a ASTM D6751 e a EN Trata-se de um combustível biodegradável, não tóxico, que pode ser obtido por meio de matérias-primas renováveis, e sua combustão gera menos poluentes em relação ao petrodiesel (LÔBO e FERREIRA, 2009). Atualmente a rota de produção adotada para o biodiesel é, em sua maioria, a transesterificação catalítica fazendo-se o uso de um catalisador homogêneo alcalino (NaOH, KOH), porém, a utilização desses catalisadores na presença de matérias-primas com elevado teor de ácidos graxos livres pode levar à formação de sabão, reduzindo o rendimento em ésteres e dificultando a separação do glicerol formado. Para contornar esse problema, a catálise enzimática surge como uma alternativa, pois as enzimas são capazes de aturarem tanto na transesterificação dos triacilglicerídeos, como também na esterificação dos ácidos graxos livres não ocorrendo, portanto a formação de sabão (BANKOVIĆ-ILIĆ et al., 2012). As enzimas, em sua forma livre, quando utilizadas na reação de transesterificação apresentam algumas adversidades devido ao seu custo relativo elevado, baixa estabilidade e a não possibilidade de reutilização. A imobilização das enzimas em um suporte insolúvel e inerte em relação ao substrato oferece a possibilidade de melhoria na estabilidade e reuso desses biocatalisadores, diminuindo os seus custos e problemas operacionais (ZHANG et al., 2012). De acordo com Hartmann e Kostrov (2013), as sílicas mesoporosas, as quais possuem distribuição uniforme de poros, elevado volume específico de poros (1,5 cm 3 g -1 ), elevada área específica (de até 1500 m 2 g -1 ) e possibilidade de controle do tamanho médio de poros (1,5 nm até 30 nm), são materiais que possuem a capacidade de acomodar em seu interior, moléculas grandes como as proteínas. Além disso, as sílicas são insolúveis em água, química e mecanicamente estáveis, resistentes a ataques de microrganismos e suas superfícies podem ser modificadas. Todas essas características são favoráveis para que esses materiais sejam utilizados como suporte para imobilização enzimática. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Caracterização do óleo de Nabo Forrageiro Composição em Ácidos Graxos : Para a determinação da composição em ácidos graxos do óleo de Nabo Forrageiro foi adotado o método da derivatização de Hartman e Lago (1973). As amostras preparadas para a determinação da composição em ácidos graxos foram analisadas mediante cromatografia gasosa, utilizando-se Cromatógrafo Varian, modelo CP-380, equipado com ionizador de chama (DIC), coluna Agilent Technologies, modelo DB-23. A programação da coluna iniciou-se em 140 o C, com aquecimento até 250 o C, a uma taxa de 5 o C/min. A temperatura do detector foi de 220 o C e do injetor de 260 o C. Os cromatogramas obtidos foram comparados com um padrão de ésteres metílicos de ácidos graxos (Fatty Acid Methyl Esters, SUPELCO), para identificação e quantificação dos ácidos graxos presentes Determinação da Massa Molar do Óleo: A massa molar do óleo foi obtida por meio da composição em ácidos graxos e calculada de acordo com Filliéres et al. (1995).

3 2.2-Síntese das sílicas mesoporosas Síntese da MCM-41: O método utilizado foi o descrito por Grün et al. (1999), com gel de síntese com composição molar: 1,0 Tetraetilortossilicato (TEOS, SIGMA 98%): 0,152 Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTABr, VETEC 99%): 2,8 Hidróxido de Amônio (NH 3 OH, Synth 27%): 141,2 H 2 O. A MCM-41 calcinada foi classificada como MCM/CF Síntese da SBA-15: O método utilizado foi baseado no trabalho desenvolvido por Zhao et al. (2000) com gel de síntese de composição molar: 1,0 Tetraetilortossilicato (TEOS, SIGMA 98%): 0,016 Copolímero Pluronic P123 (P123, SIGMA): 5,65 HCl: : 185,1 H 2 O. A SBA-15 calcinada foi classificada como SBA/CE Imobilização das lipases A imobilização seguiu o método adotado por Soares et al. (1999. Assim, foi preparada uma solução de lipase de Burkholderia cepacia (Amano Lipase PS) em tampão de ph 7,0, com concentração de 0,03 g de enzima liofilizada por ml de solução. Os biocatalisadores imobilizados foram classificados como MCM/Imob. e SBA/Imob e o teor de umidade presente nos mesmos foi medido por meio de titulador automático Karl Fischer, marca Orion, modelo AF8. A análise de proteínas foi realizada de acordo com Bradford (1976) e a quantidade de proteína presente nos suportes foi determinada em base seca (mg proteína/g suporte seco) Caracterização das sílicas mesoporosas e dos biocatalisadores imobilizados Difratometria de raios X: As amostras foram analisadas em um difratômetro Bruker D-8 Advanced, com radiação Cu-Kα e varredura de 0,5 a 6 o 2, para as amostras SBA/CE e SBA/Imob. e varredura de 2 a 10 o 2 para MCM/CF e MCM/Imob Adsorção/dessorção de nitrogênio: As análises foram conduzidas em um equipamento da marca Micrometrics, modelo ASAP 202. As amostras MCM/CF e SBA/CE passaram por um prétratamento a 300 o C, sob vácuo, durante 3 horas, e as amostras MCM/Imob. e SBA/Imob. foram tratadas a 80 o C, durante 6 horas sob vácuo. A área específica foi determinada pelo método BET e o volume de poros juntamente com a distribuição de tamanho de poros foram obtidos por meio do método BJH. Utilizou-se o método t-plot para a determinação da área externa da MCM/CF Síntese de ésteres etílicos a partir do óleo de Nabo Forrageiro Para a síntese de ésteres etílicos, foram utilizados 2,5 g de óleo, 0,45 ml de etanol (razão molar óleo:etanol 1:3), e 0,1 g de biocatalisador. As reações foram conduzidas em tubos de ensaio a 50 o C e, em intervalos de tempo de 2, 4, 8, 12 e 24 horas, os tubos foram retirados e resfriados em banho de gelo. Após esta etapa, adicionaram-se 5 ml de água deionizada e os tubos foram centrifugados para a separação dos biocatalisadores, etanol e glicerol do óleo e ésteres formados. Assim, o sobrenadante foi utilizado para análise em cromatografia

4 gasosa nas condições descritas no item Os ésteres formados foram quantificados de acordo com o método descrito por Visentainer e Franco (2006) e Visentainer (2012). O padrão interno usado foi o éster metílico tricosanóico (SIGMA, 99%). Um controle foi feito nas mesmas condições reacionais, porém sem adição de biocatalisador. De posse das massas de ésteres formados durante a reação, com a finalidade de uma comparação igualitária entre os desempenhos dos diferentes biocatalisadores, foi calculada a eficiência catalítica dos mesmos em relação aos ésteres formados (g éster/mg proteína). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Caracterização do óleo de Nabo Forrageiro A composição em ácidos graxos para o óleo de Nabo Forrageiro encontrada foi de 5,53 ± 0,106% de ácido palmítico (C16:0), 2,09 ± 0,0410% de ácido esteárico (C18:0), 22,6 ± 0,631% de ácido oleico (C18:1), 14,9 ± 0,534% de ácido linoleico (C18:2), 8,97 ± 0,250% de ácido linolênico (C18:3), 1,32 ± 0,0241% de ácido araquidônico (C20:0), 10,9 ± 0,429% de ácido gadoleíco (C20:1), 31,4 ± 1,82% de ácido erúcico (22:1), 0,734 ± 0,00400% de ácido lignocérico (C24:0) e 1,63 ± 0,188% de ácido nervônico (C24:1). Os principais ácidos graxos presentes no óleo de Nabo Forrageiro foram o ácido oleico (C18:1, 22,6 ± 0,631%) e o ácido erúcico (C22:1, 31,4 ± 1,82%). A presença de grande quantidade de ácido erúcico torna o óleo impróprio para o consumo, sendo este, então, potencial fonte de matéria-prima para a produção de insumos não alimentares, tais como, por exemplo, biocombustíveis e biolubrificantes (CREMONEZ et al.,2013). A massa molar do óleo de Nabo Forrageiro foi de 863, 7 ± 2,758 g/mol Caracterização das sílicas e biocatalisadores imobilizados Difratometria de raios X: Os difratogramas para as sílicas utilizadas como suporte e também para as sílicas após a adsorção das lipases estão ilustrados na Figura 1. Figura 1. Difratogramas de raios X das sílicas utilizadas como suporte antes e após a imobilização: a) MCM/CF e MCM/Imob. e b)sba/ce e SBA/Imob.

5 De acordo com os difratogramas apresentados, as características do arranjo hexagonal de poros tanto da MCM/CF e SBA/CE podem ser confirmadas por meio dos três picos de Bragg identificados e que são indexados aos Índices de Miller (100), (110) e (200) (GRÜN et al., 1999; ZHAO et al., 200). Após a imobilização, biocatalisadores MCM/Imob. e SBA/Imob., apenas os picos indexados aos planos indexados ao Índice de Miller (100) estão presentes. De acordo com Marler et al. (1996), os picos formados nas análises de difratometria de raios X resulta da diferença entre o contraste de espalhamento entre as paredes de silicato e do material que compões os poros e a diminuição dos picos não implica necessariamente na perda da estrutura hexagonal tanto da MCM-41 quanto da SBA-15. Tal comportamento foi relatado no trabalho desenvolvido por Vinu et al. (2004), em que citocromo c foi imobilizada em MCM-41 e SBA-15. Segundo os autores, a diminuição da intensidade dos picos está associada ao maior contraste entre a densidade eletrônica das paredes de silício e dos poros vazios quando comparado ao contraste entre a densidade eletrônica das paredes de silício e dos poros preenchidos com a enzima Adsorção/dessorção de nitrogênio: As isotermas apresentadas na Figura 2a para a MCM/CF, de acordo com Llewellyn et al. (1994) seria um tipo de isoterma de transição entre o tipo I para materiais microporosos e do tipo IV para materiais mesoporosos e ocorrem para MCM-41 com diâmetro médio de poros inferiores a 2,5 nm. Já as isotermas para a SBA/CE, Figua 2b, são tipicamente do tipo IV, com histerese associada à condensação capilar, representando mesoporosidade com faixa estreita de distribuição de tamanho. A histerese apresentada é do tipo H1 característica de poros cilíndricos (SING et al., 1985). Figura 2. Isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio para: a) MCM/CF e MCM/Imob. e b) SBA/CE e SBA/Imob. Pode-se verificar que após a imobilização, a MCM/Imob. apresentou características de material microporoso enquanto que a SBA/Imob. manteve o mesmo comportamento apresentado antes da

6 imobilização, porém, com menor quantidade de nitrogênio adsorvido/dessorvido, conforme pode ser observado na Figura 2. Por meio dos dados obtidos na análise de adsorção/dessorção de nitrogênio foi possível determinar os parâmetros texturais das sílicas e biocatalisadores imobilizados, que estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1 Parâmetros texturais para as sílicas e biocatalisadores imobilizados Amostra Volume de poros a (cm 3 /g) Área específica b (m 2 /g) Diâmetro de poros a (nm) MCM/CF 0, ,25 MCM/Imob. 0, ,58 SBA/CE 0,82 540,4 6,12 SBA/Imob. 0,7 388,77 5,96 a BJH. b BET. De acordo com Li et al. (2010), o diâmetro médio das lipases de Burkholderia cepacia está entre 4 e 5 nm e por isso, não podem ser adsorvidas no interior dos mesoporos da MCM/CF, sendo então fisissorvidas na superfície externa desse material. Assim o bloqueio parcial dos mesoporos pequenos pode ter levado à diminuição do volume de poros e da área específica. Já a SBA/CE apresentou diâmetro médio de poros de 6,12 nm, tamanho suficiente para que as lipases fossem adsorvidas no interior dos seus canais. Este fato pôde ser confirmado por meio das análises de adsorção/dessorção de nitrogênio obtidas da amostra SBA/Imob., em que houve diminuição não tão pronunciada no volume de poros, e, também, diminuição da área específica e diâmetro de poros, sem a perda de sua característica de material mesoporo, com estreita faixa de distribuição de tamanho de poros, conforme isotermas mostradas na Figura 2b (HARTMANN, 2005). A área externa específica da MCM/CF foi de 37 m 2 /g determinada pelo método t-plot e considerou-se como sendo a área disponível para imobilização das lipases Quantidade de proteína nos biocatalisadores As quantidades de proteína presentes nos biocatalisadores, determinadas por meio do método desenvolvido por Bradford (1976) foram de 2,09 ± 0,0699 mg de proteína por grama de biocatalisador seco para a SBA/Imob., 1,76 ± 0,0707 mg de proteína por grama de biocatalisador seco para a MCM/Imob. e 5,75 ± 0,505 mg de proteína por grama de enzima liofilizada. O suporte SBA/CE foi o que reteve maior quantidade de proteína quando comparado ao suporte MCM/CF. Conforme relatado por Serra et al. (2008), o diâmetro de poros é o parâmetro que mais têm influência na eficiência de adsorção das enzimas, principalmente, a relação entre diâmetro de poros e o tamanho das moléculas da enzima. O diâmetro de poros apresentado pela SBA/CE permite o acesso das lipases ao interior de seus canais, e consequentemente à sua superfície interna e externa, as quais possuem área específica disponível para imobilização (540,4 m 2 /g) superior ao da MCM/CF, já que, por possuir tamanho de poros que não permite o acesso das lipases ao interior dos mesmos, possui área disponível para imobilização menor (37 m 2 /g), a qual corresponde somente a sua área externa.

7 3.3. Síntese de ésteres etílicos a partir do óleo de Nabo Forrageiro Os rendimentos em ésteres [(g éster/g óleo)*100], em função do tempo de reação para os diferentes biocatalisadores estão mostrados na Figura 3. Todos os biocatalisadores demonstraram-se ativos na reação de transesterificação a partir de etanol e do óleo de Nabo Forrageiro. Figura 3. Rendimento em ésteres para a reação de transesterificação do óleo de Nabo Forrageiro. Com os resultados obtidos para o rendimento em ésteres, a eficiência catalítica de cada biocatalisador, para o tempo de reação de 24 horas, foi calculado e os resultados estão na Figura 4, sendo que os valores médios da eficiência catalítica estão localizados na parte superior das barras. Figura 4. Eficiência catalítica (g éster/mg proteína) dos biocatalisadores na reação de transesterificação a 50 o C, no tempo de 24 horas.

8 De acordo com a Figura 4, nota-se que os biocatalisadores demonstraram maior eficiência catalítica quando comparados à enzima livre. Shimada et al. (2002) constataram que as enzimas livres na presença de alcoóis de cadeia curta como metanol e etanol não são estáveis. Este fato pode estar relacionado ao melhor desempenho apresentado pelos biocatalisadores imobilizados, sugerindo que a imobilização torna as lipases menos suscetíveis aos alcoóis de cadeia curta. Dentre os biocatalisadores imobilizados, o que foi preparado com o uso da MCM/CF como suporte, apresentou melhor desempenho catalítico em relação ao preparado por SBA/CE. Como as enzimas foram imobilizadas na superfície externa desse suporte, a restrição difusional do substrato, mesmo com a possível agregação das lipases, pode ter sido menor que a restrição imposta pelos poros da SBA/Imob. Hudson et al. (2008), concluíram que a hidrofibicidade do substrato tem grande influência na atividade catalítica de enzimas imobilizadas em sílicas hidrofílicas, como as utilizadas no presente trabalho. Segundo os autores, se o substrato é hidrofóbico, sua difusão interna através do suporte é lenta e isso prejudica o desempenho das enzimas imobilizadas no interior de seus canais. Zheng et al. (2006) encontraram resultados diferentes em relação aos apresentados no presente trabalho. Segundo os autores as lipases imobilizadas em SBA-15 (6,1 nm de diâmetro de poros) foram mais ativas que as imobilizadas em MCM-41 (1,6 nm de diâmetro médio de poros) na reação de hidrólise da tributirina (MM 302,36 g/mol). Esta discrepância entre os resultados pode ser explicada devido ao fato de que o substrato utilizado no presente trabalho, óleo de Nabo Forrageiro, possui massa molar (863 g/mol) superior ao da tributirina e o tamanho das moléculas dos triacligliceróis presentes podem levar a uma maior dificuldade de difusão no interior da SBA/Imob., afetando a ação catalítica das lipases, conforme discutido anteriormente. 5. CONCLUSÕES Para os biocatalisadores imobilizados, as análises de difratometria de raios X não puderem confirmar a adsorção das enzimas no interior dos canais dos suportes, pois mesmo as enzimas estando fisissorvidas em sua superfície, há alteração nos picos característico do arranjo hexagonal. As análises por adsorção/dessorção de nitrogênio confirmaram a entrada das lipases no interior dos canais do suporte preparado por SBA/CE e, também, que as enzimas foram imobilizadas apenas na superfície da MCM/CF. O suporte que teve como base a sílica SBA/CE foi o que apresentou maior capacidade de retenção das proteínas, devido ao acesso das mesmas ao interior de seus poros, e também à sua área interna superior à área externa da MCM-41, que foi a área disponível para imobilização apresentada por esta. Por fim, o biocatalisador (MCM/Imob.) que apresentou características texturais tais que permitissem menor restrição à difusão dos substratos, foi o mais eficiente na reação de transesterificação do óleo de Nabo Forrageiro. 6. REFERÊNCIAS BANKOVI C-ILI C, I. B.; STAMENKOVI C, O. S.; VELJKOVI C, V. B.. Biodiesel Production from Non-Edible Plant Oils. Renewable and Sustainable Energy Reviews. vol. 16, p , 2012.

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