EFEITO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE LACTATO E GLICOSE NO CRESCIMENTO DE CEPAS RUMINAIS DE MEGASPHAERA ELSDENII

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1 EFEITO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE LACTATO E GLICOSE NO CRESCIMENTO DE CEPAS RUMINAIS DE MEGASPHAERA ELSDENII EFFECT OF LACTATE AND GLUCOSE ASSOCIATIONS ON GROWTH OF RUMINAL STRAINS OF MEGASPHAERA ELSDENII Karina de Aquino Vicente (1) Leni Rodrigues Lima (1) Ana Paula da Silva Carvalho (1) Nelcino Francisco de Paula (1) Luciano da Silva Cabral 1) Resumo: A preferência por usar lactato como fonte de energia pela bactéria ruminal Megasphaera elsdenii é bastante conhecido, entretanto seu uso pode variar de acordo com as cepas. Portanto, este estudo foi realizado com o intuito de avaliar diferentes cepas de M. esldeni (4251, 4257, 4296, B159 e T81) em meio contendo lactato e glicose em solução com diferentes proporções (lact/glico: 10/15, 20/10 e 30/5 mm/l). As cepas foram mantidas durante 24 h a 39 ºC em tubos de cultura, sendo seu crescimento mensurado por meio da turbidez do meio com uso de espectrofotômetro. As cepas 4251 e B159 se destacaram das demais quanto à taxa de crescimento. Não houve interação entre cepas e níveis de lactato/glicose. A taxa de crescimento das cepas foi aumentado linearmente (P>0,0001= 0,3917; 0,3808; 0,3479; 0,3389; 0,3102 das bactérias B159, 4251, 4257, T81, 4296) em função do aumento de lactato no meio de cultivo. Todas as cepas avaliadas de M. elsdenii preferem usar lactato como fonte de energia ao invés de glicose, evidenciando o potencial desta bactéria no controle ou prevenção de casos de acidose ruminal em bovinos confinados. Palavras-chave: bactérias do rúmen; fonte de energia, glicose, lactato, Megasphaera elsdenii, taxa de crescimento. Abstract The use of lactate as a major energy source for rumen bacteria Megasphaera elsdenii is known since long time ago, however its preference can change according to strains. Thus, is 1 FAMEVZ, Universidade Federal de Mato Grosso, Avenida Fernando Corrêa da Costa, nº 237, Boa Esperança.

2 study was made aiming to evaluate different strains of M. esldeni (4251, 4257, 4296, B159 and T81) growing in media containing lactate and glucose with different combinations (lact/gluco: 10/15, 20/10 e 30/5 mm/l). The strains were kept at 39C during 24 h in cultures tubes, where the growth was measured by changes in turbid using a spectrophotometer. The strains 4251 and B159 had higher growing rate than other strains and there is not interactions effects between strains and lactate levels. The growing rates for all strains have been increased (P>0,0001= 0,3917; 0,3808; 0,3479; 0,3389; 0,3102 bacteria B159, 4251, 4257, T81, 4296) according to lactate levels in culture media. Thus, all strains of M. elsdenii have preference to lactate use as energy source instead glucose, which emphasizes the role this ruminal bacteria on control and to avoid rumen acidosis on feedlot cattle. Keywords: energy source, glucose, growth rate, lactate, Megasphaera elsdenii, rumen bacteria. Introdução Megasphaera elsdenii (anteriormente Peptostreptococcus elsdenii) é uma bactéria anaeróbica conhecida por habitar o rúmen de bovinos e ovinos, e é uma das principais fermentadoras de lactato no rúmen (Marounek et al., 1989). Lactato é o principal agente causador de acidose ruminal, esta pode ser definida como um distúrbio digestivo no rúmen associado à ingestão de elevada quantidade de carboidratos não fibrosos rapidamente fermentáveis, especialmente amido (Nagaraja e Leghtenberg, 2007). A M. elsdenii desenvolve-se e reproduz-se no rúmen, mesmo com baixo ph (<5,5), por ter a habilidade de fermentar tanto lactato produzindo acetato, propionato, butirato e valerato quanto glicose produzindo butirato, acetato e caproato (Weimer e Moen, 2013). Esta habilidade varia de acordo com as cepas utilizadas (Marounek et al. 1989) e, provavelmente, cepas com maior capacidade de fermentação de glicose sejam menos hábeis para usar lactato. Portanto, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o crescimento de cepas de M. elsdenii cultivadas em meio com diferentes concentrações de lactato e glicose. Material e Métodos A realização do experimento ocorreu no Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios do US Dairy Forage Research Center, localizado na Universidade de Wisconsin, na cidade de Madison, Wisconsin - USA. Foram avaliadas cinco cepas de Megasphaera elsdenii, dentre elas duas são cepas comerciais (B159 e T81) e três (4251, 4257 e 4296) foram isoladas do rúmen de vacas leiteiras pertencentes a fazenda do US Dairy Forage Research. O meio de cultivo usado tinha a seguinte composição (por L): 1,02 g extrato de levedura; 1,02 g de Tripetona (TSA); 1,17 g de NaCl e (NH 4 )SO 4 ; 0,065 g de CaCl 2.2H 2 O e MgSO 4.7H 2 O; 0,026 g de MnSO 4 H 2 O, FeSO 4.7H 2 O e ZnSO 4 2H 2 O; 0,0026 g CoCl 2.2H 2 O. Deste meio, 8,8 ml

3 foram adicionados em cada tudo de cultura sob aspersão de CO 2, onde imediatamente após, os tubos foram vedados com tampas de borracha e lacres de alumínio. Após, foram autoclavados e no dia da inoculação foram adicionadas soluções de KH 2 PO 4 (0,40 ml de 22.5 g/l -1 ), Na 2 CO 3 (0,40 ml de 80 g/l -1 ) e 0,2 ml da solução de lactato e glicose. As concentrações da solução de lactato e glicose foram lactato/glicose 10/15, 20/10 e 30/5 mm/l. Após, 0,1 ml de inóculo de cada cepa foi adicionado aos tubos. As incubações foram conduzidas sala quente a 39ºC durante 24 horas após a inoculação das cepas. O crescimento das cepas foi obtido pela mensuração da densidade óptica em 525 nm durante 24 h, usando um espectrofotômetro (Spectronic 20 - Bausch and Lomb). A taxa de crescimento máxima foi estimada por regressão linear da densidade óptica em função do tempo, na fase de crescimento exponencial (Weimer e Moen, 2013). Os dados foram analisados utilizando o procedimento MIXED do SAS (versão 9.3). Os efeitos principais (cepas e níveis de lactato ou glicose) e interação (cepas x níveis de lactato ou glicose) foram analisádos pelo teste-f da ANOVA. A opção LSMEANS foi utilizada para gerar as médias individuais para cada efeito. Efeitos foram declarados significativos quando P<0,05. Resultados e Discussão Foi observada diferença (P<0,0001) entre as cepas de M. elsddenii, bem como efeito dos níveis de lactato (P<0,0001) (Tabela 2) nas taxas de crescimento, mas não houve efeito de interação entre cepas e concentração de lactato/glicose. Pode ser observado na Tabela 1 que as cepas 4251 e B159 apresentaram maior taxa de crescimento médias do que as demais, sendo portanto potenciais alvos para o desenvolvimento de probióticos para uso na alimentação de ruminantes. Tabela 1 Taxas de crescimento méida (h -1 ) de cepas de Megasphaera elsdenii em meio contendo lactato associado a glicose Cepas Tx. Crescimento média ,3808ª ,3479 b ,3102 c B159 0,3917ª T81 0,3389 b *médias seguidas de letras diferentes minúsculas sobrescritas na coluna diferem entre si (P<0,05);

4 As cepas de M. elsdenii apresentaram aumento linear da taxa de crescimento em função do incremento da concentração de lactato e a diminuição da glicose no meio de cultivo (Tabela 2). O aumento da taxa de crescimento das cepas com o acréscimo da concentração de lactato no meio, de modo geral, reflete a habilidade desta bactéria, independente da cepa, em usar lactato como fonte de energia para o crescimento. Diferentemente de Selenomonas ruminantium, que também é utilizadora de lactato no rúmen, M. elsdenii não deixa ou reduz o uso de lactato na presença de glicose, o que a coloca em lugar de destaque no metabolismo de lactato no rúmen (Weimer e Moen, 2007). Tabela 2 Taxas de crescimento (h -1 ) de cepas de Megasphaera elsdenii em diferentes associações entre lactato e glicose no meio de crescimento Cepas Concentrações de lactato/glicose (mm/l) Valor P 10/15 20/10 30/5 EPM h ,2878 0,4460 0,4085 0,01571 < 0, ,3061 0,3532 0,3844 0,01571 < 0, ,2648 0,3126 0,3533 0,01571 < 0,0001 B159 0,3203 0,4120 0,4429 0,01571 < 0,0001 T81 0,2622 0,3541 0,4004 0,01571 < 0,0001 *EPM= Erro Padrão Médio. Weimer e Moen (2007) observaram taxa de crescimento para a cepa T81 de 0,85 h -1, valor este relativamente superior aos observados no presente estudo. Contudo, deve ser salientado que os autores citados usaram elevadas concentrações de lactato, tendo observado uso de lactato de 210 mm. Considerando que as concentrações ruminais de lactato observadas no rúmen são relativamente pequenas, provavelmente as taxas de crescimento observadas no presente estudo parecem mais realísticas do que àquelas obtidas em concentrações de lactato que provavelmente nunca serão mantidas no ambiente ruminal. Conclusões A associação entre lactato e glicose afeta a taxa de crescimento de cepas de Megasphaera elsdenii, onde o aumento da concentração de lactato, ou seja, redução na concentração de glicose no meio de cultivo, aumenta a taxa de crescimento de todas as cepas. Portanto, todas as cepas de M. elsdenii apresentaram preferência pelo uso de lactato em

5 relação a glicose, reafirmando a importante função desta bactéria no ambiente ruminal como utilizadora de lactato e, portanto, colaborando para prevenir a acidose ruminal. Agradecimentos/Apoio financeiro À UFMT, pela liberação para realização do pós-doutorado e pela manutenção do salário, ao CNPq pela concessão da bolsa de PDE e ao US Dairy Forage Research Center pelo treinamento. Referências COUNOTTE, G. H. M., PRINS, R. A., JANSSEN, R. H. A., DEBIE, M. J. A..Role of Megasphaera elsdenii in the Fermentation of DL-[2-'3C]lactate in the Rumen of Dairy Cattle.applied and environmental microbiology, Utrecht, v.42, n.4,p.652,1981. Disponivel em:< Acesso em: 29 mar MAROUNEK M.; FLEGROVA, K.; BARTOS, S. Metabolism and Some Characteristics of Ruminal Strains of Megasphaera elsdenii. Applied and environmental microbiology, Praga, v.5, n.6, Disponível em: < Acesso em: 29 mar NAGARAJA, T. G.; LECHTENBERG, K. F. Acidosis in feedlot cattle. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, Philadelphia, v. 23, n. 2, p , WEIMER, P.J; MOEN, G.N. Quantitative analysis of growth and volatile fatty acid production by the anaerobic ruminal bacterium Megasphaera elsdenii T81. Applied Microbiology Biotechnology, v.97, p , 2007.