Ácidos orgânicos como aditivos nutricionais para ruminantes

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1 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DE SAÚDE CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU EM PRODUÇÃO DE BOVINOS DE CORTE Ácidos orgânicos como aditivos nutricionais para ruminantes Guarapuava-PR 2011

2 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DE SAÚDE CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU EM PRODUÇÃO DE BOVINOS DE CORTE Ácidos orgânicos como aditivos nutricionais para ruminantes Organic acids as feed additive for ruminants Revisão apresentada no Curso de Pós- Graduação Lato Sensu em Produção de Bovinos de Corte da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Orientador: Prof. Dr. Mikael Neumann Guarapuava-PR 2011

3 2 Título: Revisão Bibliográfica Ácidos orgânicos como aditivos nutricionais para ruminantes Instituição Executora: Universidade Tuiuti do Paraná Órgão Executor: Pró-Reitoria de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão- PROPPE Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde Curso de Pós-Graduação Lato Sensu em Produção de Leite Duração: 2 meses Município: Guarapuava - Pr Equipe: Fabiano Marafon João Artêmio Marin Beltrame Orientador: Prof. Dr. Mikael Neumann

4 3 SUMÁRIO RESUMO...4 ABSTRACT...5 INTRODUÇÃO ÁCIDOS ORGÂNICOS COMO ADITIVOS NUTRICIONAIS OS ÁCIDOS ORGÂNICOS E A DIMINUIÇÃO DA PRODUÇÃO DE METANO OS ÁCIDOS ORGÂNICOS E A CAPTAÇÃO DE LACTATO...13 CONCLUSÃO...17 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...18

5 4 RESUMO Há muitos anos que os nutricionistas vêm buscando alternativas para a manipulação ruminal, com o intuito de diminuir os problemas relacionados com a produção de ruminantes, como a poluição ambiental pela eliminação de metano, e os distúrbios metabólicos causados pela grande inclusão de concentrado nas dietas. Porém nos últimos 30 anos os estudos têm se concentrado na utilização de ionóforos e antibióticos promotores de crescimento. Atualmente, a utilização dessas substâncias está sendo vista com desdenho pelos consumidores, devido a problemas relacionados com resistência a antibióticos, fazendo com que a busca por possíveis substitutos seja crescente. Os ácidos orgânicos são substancias potenciais para a utilização como aditivos nutricionais para ruminantes, visando melhoras na utilização de nutrientes, e nos parâmetros ruminais. Existem resultados em testes in vitro bastante favoráveis para a utilização do ácido málico com o intuito de aumentar a transformação do lactato em propionato, diminuindo assim a queda abrupta do ph ruminal, e para o ácido fumárico, aumentando a competição com as bactérias metanogênicas pelo H 2, reduzindo a produção de metano, e aumentando a produção de ácidos graxos voláteis. Ao que parece a utilização do ácido fumárico como redutor da produção de metano in vivo, é limitada pela necessidade de adição de grandes quantidades dessa substância para que ocorra resultados satisfatórios. A adição de ácido málico visando uma maior utilização do lactato e diminuição na queda abrupta do ph ruminal, parece ser bastante promissora, porém esbarra em questões econômicas, devido ao alto custo para a utilização dessa tecnologia. Palavras Chave: Ácidos orgânicos, Acidose ruminal, Aditivos nutricionais, Fumarato, Malato, Metano.

6 5 ABSTRACT For many years, nutritionists have sought alternatives to the manipulation of rumen in order to reduce the problems associated with the production of ruminants, such as environmental pollution by the elimination of methane, and metabolic disturbances caused by high concentrate inclusion in diets. But in the last 30 years studies have focused on the use of ionophores, antibiotics and growth promoters. Currently, the use of these substances is being viewed with disdain by consumers due to problems with antibiotic resistance, making the search for possible replacements is increasing. The organic acids are potential substances for use as nutritional additives for ruminants, seeking improvements in nutrient use, and ruminal parameters. There are in vitro results in very favorable for the use of malic acid in order to increase the conversion of lactate into propionate, thus reducing the abrupt decline of Ph, and fumaric acid, increasing competition with methanogenic bacteria for H 2, reducing methane production, and increasing the production of volatile fatty acids. It seems that the use of fumaric acid as reducing methane production in vivo is limited by the necessity of adding large quantities of this substance satisfactory to occur. The addition of malic acid towards greater use of lactate and decrease in the sharp drop in rumen ph, looks quite promising, but stumbles on economic issues, given the high cost for using this technology. Keywords: Organic acids, ruminal acidosis, feed additives, malate, fumarate, methane.

7 6 INTRODUÇÃO A produção animal baseada na exploração de ruminantes tem grande importância social e econômica, pois é uma das principais fontes de carne e leite para a alimentação humana, além de gerar grandes divisas financeiras. O Brasil possui atualmente um rebanho de 1,15 milhões de bubalinos, 14 milhões de caprinos e 16,8 milhões de ovinos, porém a criação que se destaca é a bovinocultura, que possui um rebanho de aproximadamente 205 milhões de cabeças sendo esse o maior rebanho comercial do mundo (MAPA, 2010), com uma produção de mil toneladas de leite fluido (USDA, 2009), e mil toneladas de equivalente carcaça (ABIEC, 2010), juntas, a produção de leite e a de carne bovina do Brasil geraram uma receita bruta de R$ 67 bilhões no ano de Porém, mesmo possuindo o maior rebanho comercial, o Brasil ocupa a segunda posição no ranking mundial de produtores de carne bovina, e a quinta posição mundial entre os produtores de leite (USDA, 2009), com índices zootécnicos muito aquém do real potencial das atividades, como a taxa de lotação das pastagens, que é de apenas 1,08 UA/ha. (IBGE, 2006). Parte dessa ineficiência se deve ao fato de que 2 a 15% dos nutrientes ingeridos pelos bovinos podem ser perdidos na forma de CH 4 (metano) (VAN NEVEL & DEMEYER, 1996). Durante a fermentação anaeróbia dos carboidratos no rúmen ocorre a liberação de hidrogênio, este hidrogênio liberado pode ser utilizado na síntese de ácidos graxos voláteis e da matéria orgânica microbiana. O excesso de hidrogênio é eliminado, principalmente na forma de metano (BEAUCHEMIN, 2006). O metano, além de ser causa de ineficiência na produção, é ainda considerado o vilão da pecuária, pois é um importante gás do efeito estufa, participando com cerca de 15% do total de gases que causam esse efeito, e os ruminantes respondem por

8 7 aproximadamente 22% da emissão deste gás (USEPA, 2000), portanto são responsáveis por 3,3% do aquecimento global. Outro fator que faz com que os índices zootécnicos da pecuária brasileira sejam baixos é a forma extensiva com que os bovinos aqui são criados, sendo assim uma das formas de melhorar a produtividade é intensificando a produção, utilizando melhor os recursos disponíveis. Porém muitas das vezes para essa intensificação é necessário lançar mão de recursos para elevar o consumo de nutrientes como, por exemplo, dietas ricas em concentrados, que juntamente com a melhoria dos índices, podem levar a alguns distúrbios metabólicos, como a acidose ruminal (CASTILHO et al., 2004). A acidose ruminal acontece quando o ph ruminal fica inferior a 5,5, na maioria das vezes isso acontece devido ao acúmulo de ácido lático ou ácidos graxos voláteis no rúmen, principalmente após a ingestão de grandes quantidades de carboidratos rapidamente fermentáveis (NAGAJARA & TITGEMEYER, 2007). A acidose pode ocorrer de forma clínica ou o mais comum na forma de acidose subclínica, ou seja, sem sinais clínicos aparentes, o que é um grande problema, pois apesar de ser silenciosa, gera grandes perdas produtivas, principalmente no que diz respeito à diminuição da digestibilidade da matéria seca ingerida e consequentemente um menor aporte de nutrientes ao animal (CASTILHO et al., 2004). A melhora do ambiente ruminal através da utilização de aditivos nutricionais tem concentrando esforços dos pesquisadores mundiais, principalmente com o objetivo de diminuir a emissão de poluentes e aumentar a eficiência de conversão de nutrientes pelos animais, diminuindo assim o impacto da produção de bovinos ao ambiente. Durante os últimos 30 anos os estudos de manipulação ruminal tem se concentrado em torno da utilização de ionóforos e antibióticos promotores de crescimento, porém a utilização dessas substâncias para fins nutricionais está sendo proibida em alguns locais

9 8 como, por exemplo, a união européia (CASTILLO et al., 2004). Por esse motivo nos últimos anos acentuou-se a busca por possíveis substitutos a esses compostos (MCGINN et al., 2004). O objetivo desta revisão é descrever os mecanismos de ação e os possíveis efeitos da utilização de ácidos orgânicos como aditivos nutricionais, no desempenho e saúde dos ruminantes. 1. ÁCIDOS ORGÂNICOS COMO ADITIVOS NUTRICIONAIS Existem alguns ácidos orgânicos que podem ser considerados como alternativas aos ionóforos e antibióticos promotores de crescimento utilizados como aditivos na nutrição de ruminantes. Alguns dos ácidos orgânicos com potencial para essa utilização são o aspartato, cítrico, succínico, pirúvico, málico e fumárico (MARTIN, 1998). O primeiro estudo nesta área foi realizado in vitro, por Lineahn et al. utilizando a adição de malato e fumarato, à meios de cultura pura de Selenomonas ruminantium, onde observaram que a inclusão desses aditivos auxiliavam propiciava um maior crescimento bacteriano. Essas substâncias são consideradas seguras, uma vez que não apresentam resíduos na carcaça (MARTIN, 1998), pois se tratam de elementos que participam do ciclo natural de produção de ácidos graxos voláteis no processo fermentativo ruminal. O uso dos ácidos orgânicos como aditivos na nutrição de ruminantes pode levar a benefícios semelhantes aos encontrados com a utilização dos ionóforos e antibióticos promotores de crescimento (CASTILHO et al., 2004), por exemplo, prevenindo a queda acentuada do ph ruminal (MONTANO et al., 1999), e reduzindo a produção e emissão de metano (ASANUMA et al., 1999).

10 9 A maior parte dos estudos realizados com ácidos orgânicos como aditivos nutricionais concentram-se na utilização do ácido málico e/ou o ácido fumárico. Os ácidos málico e fumárico são dicarboxílicos tetracarbonados, presentes nos tecidos biológicos intermediários do ciclo do ácido cítrico (KHAMPA & WANAPAT, 2007). O ácido málico promove a utilização de lactato pelas bactérias Selenomonas ruminantium, que são as bactérias anaeróbias predominantes no rúmen com até 51% do total de bactérias, levando a um crescimento in vitro desses microorganismos (NISBET & MARTIN, 1993b), além da diminuição na concentração de ácido lático e por consequência elevação do ph (MARTIN et al., 2000). O ácido fumárico é considerado um dreno ativo de hidrogênio, pois os microorganismos utilizadores de fumarato, competem com as bactérias metanogênicas pelo H 2, diminuindo, portanto a produção de metano (ASANUMA et al., 1999), juntamente com a diminuição da metanogênese, ocorre um aumento na produção de propionato e acetato (LÓPEZ et al., 1999). 2 OS ÁCIDOS ORGÂNICOS E A DIMINUIÇÃO DA PRODUÇÃO DE METANO As bactérias metanogênicas, promovem no ambiente ruminal a incorporação de quatro moléculas de hidrogênio a uma de CO 2, resultando na fomação de uma molécula de metano e duas de água (CO 2 + 4H 2 = CH H 2 O) (CASTILLO et al., 2004). Esta é a principal forma de eliminação do H 2 produzido no rúmen durante os processos fermentativos (ASANUMA et al., 1999).

11 10 Portanto uma forma de reduzir a produção de metano seria aumentando a utilização de H 2 por bactérias não metanogênicas (ASANUMA et al., 1999). Para que isso ocorra, deve estar disponível às bactérias não metanogênicas substratos que dependam da incorporação de H 2 para sua metabolização (UNGERFELD et al., 2007).. Essa redução na produção de CH 4, além de diminuir os impactos ambientais da produção de ruminantes, resulta em um acréscimo de energia disponível aos animais, através do aumento na produção de Ácidos Graxos Voltáteis, principalmente o propionato (CARRO & RANILLA, 2003a). Vários elementos foram testados como aditivos nutricionais com o intuito de diminuir a metanogênese ruminal, principalmente os precursores propionato (Figura 1), como: piruvato sódio, L-lactato (sal de sódio), acrilato (sal de sódio), DL-aspartato (sal de potássio), DL-fumarato (sal dissódico), DL-malato (sal dissódico), citrato (sal trissódico), 2-oxoglutarato, L-tartarato e propionato (NEWBOLD et al., 2005).

12 11 Figura 1 Vias de formação de propionato e seus precursores (adaptado de: NEWBOLD, et al., 2005) A Figura 1, mostra as principais vias de formação de propionato no rúmen, sendo elas a via do acrilato, que faz a fermentação do lactato, e a via succinato-propionato, onde estão presentes os ácidos orgânicos testados como aditivos nutricionais. Nota-se que durante a transformação de fumarato à succinato ocorre a incorporação de H 2 do meio ruminal. Dentre os ácidos orgânicos já testados com o intuito de diminuir a produção de metano, o mais promissor parece ser o ácido fumárico, ou fumarato (MARTIN, 1998). Existem resultados variados para a utilização do ácido fumárico como aditivo nutricional (in vitro), porém todos demonstraram haver redução significativa na diminuição da produção de CH 4 (CARRO et al. 1999; LÓPEZ et al. 1999; CARRO & RANILLA, 2003a).

13 12 Esta variação nos resultados para a diminuição de CH 4 com a adição de fumarato, provavelmente se deve a variação existente também no tipo de cultura realizada (pura, mista, contínua) bem como quanto aos substratos utilizados (GARCÍA-MARTÍNEZ et al., 2005). García-Martínez et al. (2005) utilizando três diferentes níveis de concentrado, provou haver interação entre o tipo de substrato e a eficiência da adição do fumarato em culturas in vitro, sendo que os melhores resultados foram encontrados nas dietas com maior nível de inclusão de concentrado. Gómez et al. (2005) realizou a incubação in vitro de duas dietas, uma de média outra de alta inclusão de concentrado, adicionado de malato dissódico, encontrou resultados favoráveis para ambas as dietas tanto para elevação do ph, quanto para produção de ácidos graxos voláteis. Levando em consideração que 1 mol de fumarato convertido em propionato requer a incorporação de 1 mol do equivalente redutor (H 2 ), então para cada mol de fumarato convertido em propionato deveria ocorrer uma diminuição de 0,25 mols de CH 4 (CO 2 + 4H 2 = CH H 2 O) (CASTILLO et al., 2004). Newbold et al.(2005) mostraram que 1 mol de fumarato convertido para propionato teria estequiometricamente que diminuir a produção de CH 4 em 5,6 L (1 mol de gás ~ 22,4 L em condições normais de temperatura e pressão), para uma vaca leiteira, com produção de 500 L/d de CH 4. No entanto, para obter 10% de redução na produção de metano exigiria que o animal ingerisse um mínimo de 1,45 kg de fumarato dissódico (8,92 mol) por dia, isso se 100% do fumarato fosse convertido em propionato. Newbold et al. (2005) e Ungerfeld et al. (2007), encontraram valores de 50% e 48% para a taxa de fumarato que é convertido em propionato, portanto, para o mesmo exemplo, seria necessário o dobro da ingestão de fumarato dissódico. Em 2 kg desse sal

14 13 contém 550g de Na, o que é bem mais que os valores de ingestão de Na recomendado peçp NRC (2001), e que certamente induziria a toxicidade (NEWBOLD et al., 2005). Ungerfeld et al. (2007) mostraram que concomitantemente com o a produção de propionato, há um aumento de 0,2 mol de acetato por mol de fumarato adicionado. Sabe-se que para cada mol de acetato produzido a partir do fumarato há a produção de 2 mol de equivalentes redutores (H 2 ), um na transformação de malato em oxaloacetato, e outro na transformação de piruvato em acetato (Figura 1). Se para cada mol de fumarato adicionado, apenas 48% é convertido em propionato, e ocorre um acréscimo de 0,2 mol de acetato, então há a redução de 0,48 mol de H 2 pela produção de propionato, porém há a produção de 0,4 mol de H 2 pela produção de acetato, sendo assim apenas 0,08 mols de H 2 deixarão de ser convertidos em metano, ocorrendo então uma redução teórica de apenas 0,02 mols de CH 4 /mol de fumarato adicionado. Portanto a redução real da produção de metano é ainda menor que o esperado estequiométricamente de 0,25 mol/mol de fumarato adicionado. 3 OS ÁCIDOS ORGÂNICOS E A CAPTAÇÃO DE LACTATO Apesar dos ruminantes possuírem a capacidade de digestão de alimentos fibrosos, muitos animais são alimentados com grandes quantidades de concentrados na dieta, com o intuito de melhorar o desempenho, através de um maior aporte de energia. Os concentrados em geral, são rapidamente fermentáveis, e servem como substratos para a proliferação de bactérias como a Streptococcus bovis, que produzem grandes quantidades de lactato. As altas produções de lactato levam a uma redução no ph ruminal, a acumulação de ácido lático no rúmen está associada a acidose ruminal (NAGARAJA & TITGEMEYER, 2007).

15 14 No rúmen existem bactérias capazes de utilizar o lactato como fonte de carbono e energia por exemplo, a Selenomona ruminantium (LINEHAN et al., 1978). O mesmo autor citou que durante o processo de fermentação do lactato para a gliconeogênese, as bactérias necessitam de outros substratos, como,por exemplo, o oxaloacetato. De acordo com Linehan et al. (1978) a ausência de oxaloacetato pode ser superada com a inclusão de precursores do propionato, como o malato e fumarato, pois estes poderiam seguir o ciclo reverso da via succinato-propionato e fornecer o oxaloacetato necessário, ou ainda poupar parte da quantidade de oxaloacetato presente já presente no rúmen. Segundo Martin (1998), há muito tempo que o bicarbonato de sódio é utilizado como tamponante em dietas de ruminantes, e seu efeito consiste em parte, pelo aumento do CO 2 no líquido ruminal. López et al. (1999) e Asanuma et al. (1999) encontraram aumentos no nível de CO 2 em ensaios de digestibilidade in vitro utilizando ácidos orgânicos. A fermentação de lactato no rúmen tem como resíduos finais também os ácidos graxos voláteis, principalmente o ácido propiônico (JALC et al., 2002), resultando assim em melhoras na utilização dos nutrientes ingeridos, além de elevação no ph, tanto pela redução da quantidade de lactato, quanto pela produção de CO 2. Nisbet & Martin, (1990) testaram a inclusão de aspartato, malato e fumarato em meios de cultura pura de Selenomonas ruminantium, em substratos de lactato, e encontraram maiores resultados para a captação de lactato com adição de malato, comparativamente ao fumarato e aspartato, conforme ilustrado na Figura 2.

16 15 Figura 2 Captação de lactato em efeito a inclusão de Aspartato, Fumarato e Malato (adaptado de: NISBET & MARTIN, 1990) Desde então, os estudos tem se concentrado na utilização do malato como aditivo nutricional, visando o aumento na resistência a redução do ph em dietas com alto potencial de fermentação. Em meio de cultura pura de Selenomonas ruminantium, com ph de 6,8, diferentes concentrações de lactato e sem adição de malato, ocorreu a fermentação do lactato e consequentemente a produção de acetato e propionato, e quanto maior era a concentração de lactato, maior foi o crescimento microbiano. Quando o ph foi reduzido para 5,5, com concentrações semelhantes de lactato e sem adição de malato, houve pouca produção de acetato e propionato, porém não houve aumento no crescimento bacteriano. Com a adição de malato aos meios de cultura com ph de 5,5, ocorreu uma absorção de até 80% do lactato, e houve produção de propionato, lactato e succinato,

17 16 além do crescimento bacteriano da Selenomonas ruminantium.(evans & MARTIN, 1997). Isso indica que a S.ruminantium é capaz de crescer em meios com ph semelhante ao encontrado na acidose ruminal, e reduzir a concetração de lactato aumentando o ph. Carro & Ranilla (2003) realizaram testes de digestibilidade in vitro com quatro cereais sendo: milho, trigo, cevada e sorgo adicionados de malato dissódico; encontraram aumento no ph, aumento na produção de acetato e propionato, diminuição na relação acetato:propionato, além de diminuição na concentração de lactato, para os quatro substratos testados. Callaway & Martin (1996), testaram a utilização conjunta entre monensina sódica e ácidos orgânicos em ensaios de digestibilidade in vitro de milho quebrado, e encontraram resultados melhores no uso conjunto que na utilização isolada da monensina ou dos ácidos orgânicos para aumento do propionato, diminuição do lactato e aumento do ph final. Os autores explicaram que a melhora se deve pela soma dos efeitos, da diminuição da produção de lactato pelo Streptococcus bovis e do aumento da utilização de lactato pelas Selenomonas ruminantium. Em estudo in vivo utilizando vacas leiteiras Sniffen et al. (2006), encontraram um aumento significativo (p>0,05) para o aumento na produção de leite, com os resultados indo de 36,8 para 38,3 litros/dia para os tratamentos sem a adição de malato, ou com 50g de malato dissódico por animal dia, respectivamente, sem que houvesse grandes alterações na composição do leite. Montaño et al. (1999) relataram que o efeito da suplementação com malato em novilhos confinados recebendo dietas de alto concentrado, pode ser benéfica, pois promove um aumento no ph ruminal, nos horários que coincide com a maior produção

18 17 de ácidos (uma a duas horas após a alimentação), sem que haja quaisquer prejuízos na digestibilidade do material ingerido. Ao que tudo indica, o uso do malato como aditivo nutricional para ruminantes parece ser favorável pelos benefícios que pode trazer, porém mais estudos in vivo são necessários para que isso possa ser afirmado. Porém, o custo parece ser um fator limitante ao uso do malato como aditivo nutricional, este gira em torno de 0,11 dólares por animal dia, inviabilizando sua utilização (SNIFEN, et al. 2006). Uma alternativa para utilizar o malato nas dietas de ruminantes, seria incorporar nas dietas forrageiras ricas em malato, como por exemplo algumas variedades de alfafa, coastcross, tifton 78 e tifton 85, com concentrações variando de 2,9 a 4,5% dessa substância (CALLAWAY et al, 1997). O mesmo autor citou ainda que a concentração de malato nas forrageiras varia de acordo com o estádio de maturação, e que quanto mais velha a planta, menor a concentração. CONCLUSÃO A utilização de ácidos orgânicos como aditivos nutricionais para ruminantes parece ser promissora, porém, a grande maioria dos estudos realizados na área foi in vitro e com resultados favoráveis, porém bastante variáveis, que talvez não se repitam in vivo. Portanto mais estudos são necessários para a utilização de ácidos orgânicos como aditivos nutricionais em ruminantes.

19 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABIEC: Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carne, Disponível em: acesso abril de ASANUMA, N., IWAMOTO, M., HINO, T. Effect of the addition of fumarate on methane production by ruminal microorganisms in vitro Journal of Dairy Science 82: , BEAUCHEMIN, K. A., MCGINN, S. M. Methane emissions from beef cattle: Effects of fumaric acid, essential oil, and canola oil. Journal of Animal Science 84: , CALLAWAY, T. R., MARTIN, S. A. Effects of organic acid and monensin treatment on in vitro mixed ruminal microorganism fermentation of cracked corn. Journal of Animal Science 74: , CALLAWAY, T. R., MARTIN, S. A., WAMPLER, J. L., HILL, N. S., HILL, G. M. Malate content of forage varieties commonly fed to cattle. Journal of Dairy Science. 80: , CASTILLO, C., BENEDITO, J. L., MÉNDEZ, J., PEREIRA, V., LÓPEZ-ALONSO, M., MIRANDA, M., HERNÁNDEZ, J. Organic acids as a substitute for monensin in diets for beef cattle. Animal Feed Science and Technology. 115: , CARRO M. D., LÓPEZ, S., VALDÉS, C., OVEJERO, F. J. Effect of DL-malate on mixed ruminal microorganism fermentation using the rumen simulation technique (RUSITEC). Animal Feed Science and Technology 79, , CARRO, M.D., RANILLA, M. J. Influence of different concentrations of disodium fumarate on methane production and fermentation of concentrate feeds by rumen microorganisms in vitro. British Journal of Nutrition 90, , 2003a. CARRO, M.D., RANILLA, M. J. Effect of the addition of malate on in vitro rumen fermentation of cereal grains. British Journal of Nutrition 89, , 2003b. EVANS, J. D., MARTIN, S. A. Factors affecting lactate and malate utilization by Selenomonas ruminantium. Applied Environmental Microbiology 63: , GARCÍA-MARTÍNEZ, R., RANILLA, M. J., TEJIDO, M. L., CARRO, M. D. Effects of disodium fumarate on in vitro rumen microbial growth, methane production and fermentation of diets differing in their forage:concentrate ratio. British Journal of Nutrition 94:71 77, GÓMEZ, J. A., TEJIDO, M. L., CARRO M. D. Influence of disodium malate on microbial growth and fermentation in rumen-simulation technique fermenters receiving medium- and high-concentrate diets. British Journal of Nutrition 93, , IBGE Istituto brasileiro de geografia e estatística, Disponível em: acesso em maio de 2011.

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