ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA TESE DE DOUTORADO ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO ORIENTADORA: Profª Dra. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA RECIFE 2012

2 TESE DE DOUTORADO THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais ORIENTADORA: Profª Dra. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA RECIFE 2012

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4 Thiago Henrique Napoleão Atividade inseticida e mecanismos de ação de lectinas de Myracrodruon urundeuva contra Nasutitermes corniger, Aedes aegypti e Sitophilus zeamais Tese apresentada para o cumprimento parcial das exigências para obtenção do título de Doutor em Bioquímica e Fisiologia pela Universidade Federal de Pernambuco. Aprovado por: Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva Presidenta Profa. Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia Profa. Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro Prof. Dr. Roberto Araújo Sá Data: 27 / 06 / 2012

5 Dedico esta Tese aos meus pais, aos meus irmãos, a toda minha família e a todos os meus amigos, por serem a minha razão e inspiração. para seguir sempre em frente.

6 AGRADECIMENTOS A Deus, por me presentear com mais esta oportunidade de evolução neste planeta, pela família a qual me confiou, pelos amigos maravilhosos que recruta para acompanharem minha jornada, pela inspiração de serenidade nos momentos necessários, pelos caminhos que me são apresentados, pelas dificuldades encontradas, pelos desafios, pelos sonhos realizados, pela esperança mantida, enfim, por tudo e todas as coisas. Aos meus pais, Rosângela e Luiz Carlos, pelo amor, carinho, paciência, apoio e incentivo; por me compreenderem e apoiarem sempre meus objetivos; pelos valores ensinados; pelo desafio diário e por toda dedicação com que cuidaram e cuidam de mim. Aos meus irmãos Daniella e Guilherme, pelo amor e convívio; pelos desafios enfrentados juntos; pelas tantas emoções divididas; pelo companheirisimo e pela presença e apoio sempre; por compartilharem a imaginação, as invenções e os sonhos; pela paciência e compreensão; por fazerem a minha vida mais alegre, divertida e preciosa; enfim, por tudo. A toda minha família pelo amor, incentivo e confiança; à minha avó Irani e meu avô Alcides, pelos ensinamentos e por todo amor, cuidado, carinho e incentivo transmitidos; à minha bisavó, Maria de Lourdes (in memorian), pelo exemplo, pelo carinho e por todo o tempo em que iluminou nossas vidas e que hoje continua iluminando a todos lá de cima; às minhas tias Anita, Elisabete, Raquel e Sandra e ao meu tio Roberto por sempre acreditarem em mim e por todo carinho, apoio e incentivo constantes; aos meus primos Ilka, Talys e Tacianna, pelo carinho e pela convivência harmoniosa e divertida. À professora Patrícia Paiva, pelos imensuráveis apoio, estímulo, dedicação, exemplo, amizade e orientação durante toda a Graduação, Mestrado e Doutorado. E pela confiança e batalha incessante para me ajudar a alcançar meus objetivos. À minha amiga Nataly, pela amizade inabalável e sincera; por toda consideração e toda confiança; pela sua imensa alegria que, infalivelmente, contagia e coloca pra cima em

7 qualquer momento; pela sua garra, energia e força, que são exemplos para todos nós; por ser uma das mulheres mais admiráveis que conheço; por toda sua participação ao longo desses anos de trabalho; pelo olhar vibrante e lindo sorriso; pela cumplicidade; por me honrar com sua amizade e por todo apoio. Ao meu amigo Francis, pelo companheirismo, pela confiança, e pela amizade; por toda sua dedicação e competência nos experimentos dessa Tese e ao longo de toda a jornada acadêmica desde nossa Graduação. Ao meu amigão Emmanuel, por ser uma luz em minha vida; pela sua compreensão, gentileza, lealdade e generosidade; pela enorme paciência, por sua sinceridade e honestidade; por me ajudar a crescer e ser a cada dia uma pessoa melhor; pelo seu ombro e amigo e seu sorriso com os quais posso sempre contar; por acreditar em minhas idéias e meus sonhos, me estimular e me ajudar a executá-los; pelo seu apoio inestimável nos experimentos realizados para essa Tese e em tantos outros mais; enfim, por presentear meu coração com sua amizade. À minha amiga Lidiane, pelo carinho e pela compreensão tão preciosos; pelo apoio e pela mão amiga e gentil; pela paciência; pela doce companhia em tantos momentos importantes; enfim, pela sua amizade tão importante para mim. À minha amiga Thâmarah, pelo imenso carinho, confiança e incentivo; pelo entusiasmo de sempre e pela força em momentos difíceis; pela sua imensa dedicação, pela sua compreensão e por embarcar comigo e a professora Patrícia em nossas aventuras pelo mundo da Bioquímica. Às queridas amigas Luciana, Tati, Thamara, Maiara, Kézia e Belany, pelo carinho, apoio e incentivo, por embelezarem, suavizarem e alegrarem meu dia-a-dia. Ao meu amigo Afonso, pela amizade extremamente agradável, pelo companheirismo, por sua gentileza e por todo apoio. Aos amigos e alunos Bernardo e Lívia, por todo apoio e pela confiança e paciência; por me proporcionarem o exercício e desenvolvimento de importantes etapas. Aos

8 grandes amigos Edna, Andreza, Paulo Victor, Emmanuela, Taísa, Nathália e Liana pela amizade que nos uniu, nos une e unirá para sempre. A todos os amigos que fazem ou fizeram parte do Laboratório de Glicoproteínas durante esses sete anos de convivência, em especial: Giselly, Fernando, Michele, Igor, Priscila, Dalila, Kaleen, Erika, Andréa Sales, Chrisjacele, Idila, Léo, Carlos Bob, Felipe, Regina, Rodrigo, Adriana, Lucíola, Ana Luiza, Juliene, Cris, Vanessa, Mariana, Andréa Santos, Raiana, Mary, Cássia, Mychely, Larissa, Amanda, Cynarha, Marília, Mércia, Carina e Mariana Reflita!. Minha gratidão por todo carinho e consideração, sempre. A todos os demais amigos, de todos os lugares e épocas: Lígia, Inabelle, João, Edson, Carla, Carol, Paulo, Syllas, Breno, Thiago Buonafina, Artur, Sheila, Meyriene, e todos os demais. Às professoras Luana Coelho, Tereza Correia do Departamento de Bioquímica da UFPE pelo apoio, incentivo, confiança e consideração. À professora Márcia Vanusa, também do Departamento de Bioquímica, pelo apoio, incentivo e imenso esforço dedicados. Ao professor Roberto Sá, do Centro Acadêmico do Agreste da UFPE, pela amizade, incentivo e confiança, por me introduzir na vida científica e por tudo que proporcionou para o meu crescimento como pessoa e pesquisador. À professora Daniela Navarro, do Departamento de Química Fundamental da UFPE, pela disponibilidade, simpatia, exemplo e por sempre abrir com tanta alegria as portas de seu laboratório e de sua sala para nos receber e nos orientar. Aos demais professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFPE, em especial Maria Reis, João Virgínio, Neide, Miron, Djalma e professor Ranilson. À professora Vera Menezes, e novamente à professoa Patrícia, por toda dedicação e esforço na coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Fisiologia da UFPE durante seus respectivos mandatos.

9 À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro para realização dos trabalhos desta Tese À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de Bolsa de Estudos através do Programa de Fomento à Pós-Graduação (PROF), durante meu Curso de Doutorado.

10 Nenhum caminho é longo demais quando amigos nos acompanham. (Autor desconhecido) Aprende humildemente Ensina praticando Administra educando Obedece prestativo Ama edificando Teme a ti mesmo Sofre aproveitando Fala construindo Ouve sem malícia Ajuda elevando Ampara levantando Passa servindo Ora serenamente Pede com juízo Espera trabalhando Crê agindo Confia vigiando Recebe distribuindo Atende com gentileza Coopera sem apego Socorre melhorando Examina salvando Esclarece respeitoso Semeia sem aflição Estuda aperfeiçoando Caminha com todos Avança auxiliando Age no bem geral Corrige com bondade Perdoa sempre. André Luiz (psicografia de Chico Xavier)

11 RESUMO Lectinas, proteínas que ligam específica e reversivelmente a carboidratos, isoladas da entrecasca (MuBL) e do cerne (MuHL) da aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) foram agentes inseticidas contra operários e soldados de Nasutitermes corniger (MuHL) e larvas de Aedes aegypti (MuBL e MuHL). A presente Tese descreve a purificação da lectina de folha de M. urundeuva (MuLL), a atividade termiticida de MuBL e MuLL sobre N. corniger, a atividade larvicida de MuLL sobre larvas de A. aegypti no quarto estágio (L4), o efeito de MuLL sobre o gorgulho do milho (Sitophilus zeamais) e o estudo dos potenciais mecanismos de ação inseticida. O procedimento de purificação de MuLL incluiu extração de proteínas das folhas com NaCl 0,15 M, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de quitina. MuLL foi caracterizada quanto ao perfil eletroforético em condições nativas e desnaturantes, bem como quanto ao efeito de carboidratos, temperatura e ph sobre a atividade hemaglutinante. Ensaio de determinação da atividade termiticida de MuBL e MuLL foi realizado em placas de Petri contendo discos de papel de filtro impregnados com diferentes quantidades de lectina. Quanto aos mecanismos de ação sobre os cupins, foram investigados a resistência das lectinas à degradação proteolítica e os efeitos das mesmas sobre bactérias simbiontes do trato intestinal. Para determinação da atividade larvicida contra A. aegypti, larvas L4 foram incubadas por 24 h em soluções contendo diferentes concentrações do extrato de folhas ou de MuLL isolada. A resistência de MuLL à proteólise e o efeito da lectina sobre as atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina e α-amilase) das larvas foram investigados. Para determinação da atividade inseticida contra S. zeamais adultos o extrato ou MuLL foram incorporados a discos de farinha de trigo que serviram como dieta para os insetos durante 7 dias. Os parâmetros avaliados foram sobrevivência, índice de deterrência alimentar, taxa de consumo relativo, taxa de crescimento relativo, eficiência na conversão do alimento ingerido e atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina, celulases, fosfatases e α-amilase). MuLL, uma lectina ligadora de quitina, é um polipeptídeo catiônico, glicosilado, de massa molecular 14,2 kda cuja atividade hemaglutinante é inibida por glicoproteínas e estável ao aquecimento a 100 C e em ampla faixa de ph. Atividade termiticida foi detectada para MuBL (CL 50 de 0,974 mg/ml sobre operários e 0,787 mg/ml sobre soldados) e MuLL (CL 50 de 0,374 mg/ml sobre operários e 0,432 mg/ml sobre soldados). As atividades hemaglutinantes de MuBL, MuHL e MuLL foram resistentes a extratos de intestino de N. corniger contendo atividade de tripsina e as três lectinas apresentaram ação bacteriostática (concentração mínima inibitória de 62,5 µg/ml para bactérias de operários e 125 µg/ml para bactérias de soldados). MuBL e MuHL foram agentes bactericidas mais eficientes sobre simbiontes de operários (concentração mínima bactericida de 125 µg/ml) do que MuLL (250 µg/ml), enquanto as três lectinas apresentaram atividade bactericida similar sobre as bactérias do intestino dos soldados (concentração mínima batericida de 250 µg/ml). O extrato de folhas e MuLL foram larvicidas contra A. aegypti com CL 50 de 10,9 e 0,202 mg/ml, respectivamente. Estes resultados indicam MuLL como princípio ativo do extrato de folhas. MuLL foi resistente a hidrólise pelas enzimas do intestino das larvas, inibiu a atividade proteolítica total e de tripsina (K i : 2,8 µm) e estimulou a atividade de α-amilase das larvas. O extrato de folhas matou S. zeamais (CL 50 de 72,4 mg de proteínas/g de farinha de trigo) e apresentou efeito deterrente alimentar moderado enquanto MuLL apenas exerceu forte efeito deterrente (índices de deterrência de 82% a 91% em concentrações de 45 a 150 mg/g). A toxicidade do extrato e o efeito deterrente de MuLL resultaram em perda de biomassa pelos insetos, o que foi refletido em valores negativos para as taxas de crescimento relativo e eficiências de conversão do alimento ingerido. As atividades de proteases, tripsina, fosfatase ácida e amilase em extratos do intestino de adultos alimentados com dieta contendo o extrato ou a lectina foram significativamente (p<0,05)

12 menores que aquelas detectadas em extratos do intestino de insetos do grupo controle. A ingestão de dieta contendo MuLL resultou também em diminuição das atividades de endoglucanase e fosfatase alcalina. Em conclusão, os resultados obtidos revelam (1) MuHL, MuBL e MuLL como potenciais candidatos a inseticidas biodegradáveis para controle de N. corniger, A. aegypti e S. zeamais; (2) resistência das lectinas ao ambiente proteolítico do intestino de N. corniger e A. aegypti; (3) modulação de atividades de enzimas digestivas do intestino de insetos pelas lectinas; (4) atividade antibacteriana de MuHL, MuBL e MuLL sobre microorganismos intestinais simbiontes de N. corniger; (5) atividade inseticida contra N. corniger e A. aegypti por ingestão das lectinas e contra S. zeamais por rejeição da dieta contendo MuLL. A Tese contribui para o estado da arte no estudo da atividade inseticida de lectinas, fornecendo os primeiros dados para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos efeitos deletérios exercidos por estas proteínas sobre N. corniger, A. aegypti e S. zeamais. Palavras-chaves: Myracrodruon urundeuva; lectina; Nasutitermes corniger; Aedes aegypti; Sitophilus zeamais; mecanismo de ação inseticida.

13 ABSTRACT Lectins, proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates, isolated from bark (MuBL) and heartwood (MuLL) of the aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) were insecticidal agents against workers and soldiers of Nasutitermes corniger (MuHL) and Aedes aegypti larvae (MuBL and MuHL). This Thesis describes the purification of M. urundeuva leaf lectin (MuLL), the termiticidal activity of MuBL and MuLL against N. corniger, the larvicidal activity of MuLL on A. aegypti larvae in the fourth stage (L4), the effect of MuLL on the maize weevil (Sitophilus zeamais), and the study of the potential mechanisms of insecticidal action. The MuLL isolation procedure included extraction of leaf proteins with 0.15 M NaCl, precipitation with ammonium sulphate and chromatography on chitin column. MuLL was characterized for electrophoresis profile on native and denaturing conditions, as well as for the effect of carbohydrates, temperature and ph in hemagglutinating activity. Assay for determination of termiticidal activity of MuBL and MuLL was performed on Petri dishs containing filter paper disks impregnated with different amounts of lectin. Regarding the mechanisms of action on termites, it was investigated the resistance of lectins to proteolytic degradation and their effects on symbiotic bacteria from intestinal tract. To determine the larvicidal activity against A. aegypti, L4 larvae were incubated for 24 h in solutions containing different concentrations of leaf extract or isolated MuLL. The MuLL resistance to proteolysis and its effect on the activity of digestive enzymes (proteases, trypsin and α-amylase) of larvae were investigated. For determination of insecticidal activity against S. zeamais, the extract or MuLL was incorporated to wheat flour disks that served as diet for the insects during 7 days. The parameters evaluated were survival, feeding-deterrence index, relative consumption rate, relative growth rate, efficiency in conversion of ingested food, and activities of digestive enzymes (proteases, trypsin, cellulases, phosphatases and α-amylase). MuLL, a chitin-binding lectin, is a cationic and glycosylated polypeptide with molecular mass 14.2 kda, which hemagglutinating activity is inhibited by glycoproteins and stable towards heating at 100 C and broad ph range. Termiticidal activity was detected for MuBL (LC 50 of mg/ml on workers and mg/ml on soldiers) and MuLL (LC 50 of mg/ml on workers and mg/ml on soldiers). The hemagglutinating activities of MuBL, MuHL and MuLL were resistant to N. corniger gut extracts containing trypsin-like activity and the three lectins showed bacteriostatic action (minimal inhibitory concentrations of 62.5 µg/ml on worker s bacteria and 125 µg/ml on soldier s bacteria). MuBL and MuHL were bactericide agents more effective on worker s symbionts (minimal bactericide concentration of 125 µg/ml) than MuLL (250 µg/ml) while the three lectins showed similar bactericide activity on bacteria from soldier gut (minimal bactericide concentration of 250 µg/ml). M. urundeuva leaf extract and MuLL were larvicidal against A. aegypti with LC 50 of 10.9 and mg/ml, respectively. These results indicate MuLL as active principle of leaf extract. MuLL was resistant to hydrolysis by larval gut enzymes, inhibited total protease and trypsin (K i : 2.8 µm) activities and stimulated α-amilase activity. Leaf extract killed S. zeamais (LC 50 of 72.4 mg of proteins per g of wheat flour) and showed moderate feeding-deterrent effect while MuLL only exerted strong deterrent effect (feeding-deterrence indices from 82% to 91% in concentrations of 45 to 150 mg/g). The extract toxicity and MuLL feeding-deterrent effect resulted in loss of biomass by insects, which was reflected in the negative values for relative growth rates and effciencies in conversion of ingested food. The protease, trypsin-like, acid phosphatase and amylase activities in gut extracts from adults fed on diet containing extract or lectin were significantly (p<0.05) lower than those detected in gut extract from insects of control group. The ingestion of diet containing MuLL also resulted in decrease of endoglucanase and alkaline phosphatase activities. In conclusion, the results obtained reveal (1) MuHL, MuBL and MuLL as potential candidates to biodegradable insecticides for control of N. corniger, A.

14 aegypti and S. zeamais; (2) resistance of lectins to the proteolytic environment of N. corniger and A. aegypti gut; (3) modulation of digestive enzyme activities at insect gut by lectins; (4) antibacterial activity of MuHL, MuBL and MuLL on gut symbiont microorganisms of N. corniger; (5) insecticidal activity against N. corniger and A. aegypti by lectin ingestion and against S. zeamais by rejection of diet containing MuLL. The thesis contributes to the stateof-art in the study of insecticidal activity of lectins, yielding the first data for the comprehension of the mechanisms involved in the deleterious effects exerted by these proteins on N. corniger, A. aegypti and S. zeamais. Keywords: Myracrodruon urundeuva; lectin; Nasutitermes corniger; Aedes aegypti; Sitophilus zeamais; insecticidal action mechanisms.

15 LISTA DE FIGURAS FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Figura 1. Esquema representando a aglutinação de eritrócitos promovida por lectinas. (A) Rede de aglutinação formada pela ligação de uma lectina aos carboidratos da superfície dos eritrócitos. (B) Inibição da formação da rede de aglutinação por carboidratos livres. Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do Cerrado que já perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E) flores. Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de aroeira. Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) e MuHL (B). Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de poliacrilamida em condições nativas para proteínas básicas (1) e em condições desnaturantes (2). Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Rainha de Nasutitermes euphratae (A). Operário (B) soldado (C) e ninho construído no solo (D) de Nasutitermes corniger. Figura 6. Ensaio termiticida. O disco de papel de filtro (d), de 4 cm de diâmetro, é impregnado com solução da amostra a ser avaliada. Figura 7. (A) Ciclo de vida do A. aegypti. (B). Larva de A. aegypti no estágio L4. Figura 8. Sitophilus zeamais. (A) Inseto adulto explorando grão de milho, com destaque para o rostro (1). (B) Inseto adulto, com destaque para o rostro (1) e as manchas avermelhadas (2) nos élitros. (C) Adultos em infestação de grãos de milho armazenados. (D) Fêmea ovipositando dentro do grão de milho (3), larva em desenvolvimento (4) e pupa (5). Pág ARTIGO 1 Fig. 1. Chromatography of 60-80% precipitate from leaf extract on chitin column. Washing step used 0.15 M NaCl; arrows represent eluents added. Fractions (2.0 ml) were collected and evaluated for hemagglutinating activity (HA). Absorbance (ABS) at 280 nm ( ) and log HA ( ) are represented. Electrophoresis profiles of MuLL (fractions 90 to 166) on PAGE for native basic proteins (a), and SDS-PAGE stained with Coomassie Brilliant Blue (b). Fig. 2. Contact effect of MuBL (A and B) and MuLL (C and D) on N. corniger workers (A and C) and soldiers (B and D). Treatments of MuLL [0.125 ( ), 0.25 ( ), 0.35 ( ), and 0.5 ( ) mg ml -1 ] as well as MuBL [0.1 ( ), 75 77

16 0.2 ( ), 0.4 ( ), 0.6 ( ) and 0.8 ( ) mg ml -1 ] were used; 0.15 M NaCl was the negative control ( ). Each point represents the mean ± SD of five experiments. ARTIGO 2 Fig. 1. Mortality of A. aegypti L 4 incubated with M. urundeuva leaf extract (A) and MuLL (B). Lethal protein concentration required to kill 50% (LC50) of larvae in 24 h was determined by probit analysis with a reliability interval of 95%. Fig. 2. Effect of MuLL on A. aegypti L 4 digestive enzymes. (A) Protease activity from L 4 gut extract in presence of MuLL; inset: zymography for proteases of L 4 gut extract (1) and L 4 gut extract incubated with lectin (2). Arrows indicated the polypeptides bands with reduced intensity of the lytic zone after incubation of L 4 gut extract with MuLL. The 100 % activity of L 4 gut protease corresponded to absorbance of ± (B) Trypsin-like activity from gut extract towards 8 mm BApNA in presence of MuLL. The 100 % activity of L 4 gut trypsin corresponded to absorbance of ± (C) Effect of MuLL on α-amylase activity from L 4 gut extract ARTIGO 3 Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S. zeamais adults by determination of feeding-deterrence indices. The insects were reared on artificial diet consisting on wheat flour disks containing leaf extract at 10 to 150 mg of protein per g of wheat flour (A) and MuLL at 3 to 150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments. Fig. 2. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in wheat flour disks (control) or M. urundeuva leaf extract (10 to 150 mg of protein per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments. Fig. 3. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in wheat flour disks (control) or MuLL (3 to 150 mg per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments

17 LISTA DE TABELAS Pág. ARTIGO 1 Table 1. Properties of MuBL, MuHL, and MuLL. Table 2. Trypsin-like activity in gut extracts from N. corniger and hemagglutinating activity of MuBL, MuHL and MuLL after incubation with termite gut extracts ARTIGO 2 Table 1. Protease and MuLL specific haemagglutinating activity from MuLL and L 4 gut extract mixture. 85 ARTIGO 3 Table 1. Survival rates of S. zeamais adults reared for 7 days on diets containing M. urundeuva leaf extract or MuLL. Table 2. Digestive enzyme activities in gut extracts from S. zeamais adults reared on diets consisting on wheat flour disks containining M. urundeuva leaf extract or MuLL

18 LISTA DE ABREVIATURAS AH: atividade hemaglutinante BApNA: N-α-benzoil-DL-arginil-ρ-nitroanilida Bs: Bacillus sphaericus Bti: Bacillus thuringiensis var. israelensis CL 50 (LC 50 ): concentração letal necessária para matar 50% dos insetos Con A: concanavalina A (lectina de sementes de Canavalia ensiformis) DNS: ácido 3,5-dinitrosalicílico (do inglês 3,5-dinitrosalycilic acid) FDI: índice de deterrência alimentar (do inglês feeding-deterrence index) MBC: concentração mínima bactericida (do inglês minimal bactericide concentration) MIC: concentração minima inibitória (do inglês minimal inhibitory concentration) MuBL: lectina de entrecasca de Myracrodruon urundeuva (do inglês M. urundeuva bark lectin) MuHL: lectina de cerne de M. urundeuva (do inglês M. urundeuva heartwood lectin) MuLL: lectina de folha de M. urundeuva (do inglês M. urundeuva leaf lectin) NA: meio Ágar Nutriente (do inglês Nutrient Agar) NB: meio Caldo Nutriente (do inglês Nutriente Broth) PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida (do inglês polyacrylamide gel electrophoresis) ρnp: ρ-nitrofenol SDS: sulfato sódico de dodecila (do inglês dodecyl sodium sulphate) Tris: Trishidroximetilaminometano WGA: aglutinina de gérmen de trigo (do inglês wheat germ agglutinin)

19 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Substâncias naturais envolvidas na defesa das plantas Controle de insetos Lectinas Purificação e caracterização de lectinas Atividades biológicas e aplicações biotecnológicas de lectinas Lectinas inseticidas e seus mecanismos de ação A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) Lectinas de M. urundeuva Cupins O gênero Nasutitermes Aedes aegypti O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS Purificação de MuLL e caracterização das lectinas de M. urundeuva Estudo da atividade inseticida contra N. corniger Estudo da atividade larvicida de MuLL contra A. aegypti Estudo da atividade inseticida do extrato de folhas e MuLL contra S. zeamais REFERÊNCIAS ARTIGO

20 Termiticidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva against Nasutitermes corniger and its mechanisms ARTIGO Effect of Myracrodruon urundeuva leaf lectin on survival and digestive enzymes of Aedes aegypti larvae ARTIGO Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil, Sitophilus zeamais (Coleoptera, Curculionidae) CONCLUSÕES ANEXO Insecticide Activity of Lectins and Secondary Metabolites

21 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva INTRODUÇÃO Insetos e plantas mantêm complexos mecanismos de interações na natureza que podem ser benéficos para ambos ou para apenas um deles. Dentre estas interações, estão polinização, abrigo e alimentação. Ao mesmo tempo, as plantas também estão expostas ao ataque de fitopatógenos, geralmente microorganismos, que causam doenças por meio de distúrbios no metabolismo celular (através de enzimas, toxinas e fitorreguladores, por exemplo) e absorção de nutrientes da célula vegetal para seu próprio crescimento. Ainda, diversos insetos e outros animais se alimentam das partes não-reprodutivas e reprodutivas das plantas. A fim de aumentar as chances de sobrevivência e reprodução, as plantas desenvolveram então um vasto arsenal de estratégias de defesa em resposta à pressão de herbívoros e patógenos (EDWARDS & WRATTEN, 1981; AGRIOS, 1997; DEL-CLARO & SILINGARDI, 2001). As estratégias de defesa das plantas contra herbívoros envolvem a participação de fatores físicos, tais como tricomas e espinhos. Em paralelo, grande parte da evolução das interações entre insetos e plantas tem ocorrido ao nível químico. A defesa química é proporcionada por substâncias tóxicas e repelentes produzidas pela planta. As toxinas de origem vegetal podem ser compostos do metabolismo primário, como algumas proteínas de defesa, ou do metabolismo secundário, tais como alcalóides, taninos, flavonóides e aminoácidos não-protéicos, como a canavanina e a cianoalanina (HARBORNE, 1993). Lectinas, proteínas que se ligam reversivelmente a carboidratos, são amplamente encontradas em plantas e tem sido descritas como participantes da defesa contra microorganismos e insetos (PEUMANS & VAN DAMME, 1995; PAIVA et al., 2010, 2011a). Lectinas encontradas em tecidos vegetais naturalmente resistentes ao ataque de insetos constituem potenciais candidatos a agentes inseticidas eficazes e biodegradáveis. A aroeirado-sertão, Myracrodruon urundeuva, é uma árvore madeira-de-lei, resistente ao ataque dos

22 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva principais agentes biodeterioradores, tais como os cupins, insetos que degradam a celulose com o auxílio de simbiontes (bactérias e protozoários flagelados) presentes no trato digestivo. Lectinas ligadoras de quitina foram isoladas do cerne (MuHL: M. urundeuva heartwood lectin) e entrecasca (MuBL: M. urundeuva bark lectin) desta planta (SÁ et al., 2008; SÁ et al., 2009b). MuHL foi capaz de induzir a mortalidade de operários e soldados de Nasutitermes corniger, espécie de cupim considerada praga urbana (SÁ et al., 2008). MuHL e MuBL apresentaram atividade inseticida sobre o quarto estágio larval de Aedes aegypti, mosquito vetor da dengue (SÁ et al., 2009b). Diferentes mecanismos de ação têm sido propostos para as lectinas inseticidas. Geralmente, essas proteínas são resistentes à degradação proteolítica, sendo capazes de exercer seus efeitos deletérios quando ingeridas pelos insetos. Essa resistência pode ser considerada como um fator defensivo conservado por algumas plantas (MACEDO et al., 2007). Uma vez presentes no trato digestivo do inseto, as lectinas podem interagir com glicoconjugados presentes na superfície da membrana de células epiteliais. Quitina e proteínas glicosiladas contendo resíduos de N-acetilglicosamina presentes na matriz peritrófica são alvos para lectinas ligadoras de quitina. Lectinas também podem interferir na atividade de enzimas e afetar indiretamente os mecanismos regulatórios de algumas enzimas devido à perturbação da organização da membrana peritrófica e da borda escovada (FITCHES & GATEHOUSE, 1998; FITCHES et al., 2008; PAIVA et al., 2012). Ainda, as lectinas podem exercer uma ação deterrente sobre a alimentação dos insetos por um efeito pré-ingestão, envolvendo sensores gustatórios, ou por um efeito pós-ingestão, ao promoverem intoxicação (SAUVION et al., 2004; MICHIELS et al., 2010; SPRAWKA & GOŁAWSKA, 2010). Contudo, o mecanismo de ação de lectinas com atividade termiticida sobre N. corniger e larvicida sobre A. aegypti ainda precisa ser elucidado.

23 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais, é uma praga cosmopolita do milho, sendo capaz de atacar grãos armazenados, bem como antes da coleta, ainda no campo. Os grãos atacados apresentam valor nutricional e peso reduzidos, baixa porcentagem de germinação e valor de mercado consideravelmente reduzido (YUYA et al., 2009; TEFERA et al., 2011). Não são encontrados na literatura estudos concernentes à atividade inseticida de lectinas sobre S. zeamais. Os estudos apresentados nesta Tese descrevem os esforços iniciais na identificação de possíveis mecanismos de ação de lectinas contra N. corniger e A. aegypti, bem como a primeira avaliação do efeito de uma lectina sobre adultos de S. zeamais. A primeira investigação reporta o isolamento de uma nova lectina ligadora de quitina extraída das folhas de M. urundeuva (MuLL: M. urundeuva leaf lectin), a atividade termiticida de MuBL e MuLL sobre operários e soldados de N. corniger e possíveis mecanismos da ação termiticida das três lectinas isoladas da aroeira. O segundo trabalho descreve a atividade larvicida de MuLL sobre o quarto-estágio larval de A. aegypti e seu efeito sobre a atividade de enzimas digestivas das larvas. A terceira investigação discorre sobre o efeito do extrato de folhas de M. urundeuva e de MuLL na sobrevivência e comportamento alimentar de S. zeamais, avaliando as alterações promovidas em parâmetros nutricionais e na atividade de enzimas digestivas deste inseto.

24 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1. Substâncias naturais envolvidas na defesa das plantas A evolução do conhecimento dentro da Bioquímica Ecológica tem iluminado os diversos degraus de complexas interações e adaptações co-evolucionárias que ocorrem entre plantas, animais e microorganismos. As plantas desenvolveram mecanismos de resposta e defesa a agressões de predadores e infecções por microrganismos. Dessa forma, elas sempre conseguiram dominar as paisagens do planeta (HARBORNE, 1993; RICKLEFS, 2003). A dimensão dos danos causados por fitopatógenos e pestes de insetos depende do hábito e do tamanho da população do agente causador e da resistência da planta ao tipo de ataque (KOGAN, 1994). Adaptações morfológicas relacionadas à defesa das plantas contra herbívoros incluem, por exemplo, espinhos, acúleos, tricomas, caules rígidos e superfícies foliares mais espessas ou mais lisas (KENNEDY & BARBOUR, 1992; RAVEN et al., 2004). A defesa química das plantas ao ataque de microorganismos e herbívoros pode ser mediada por diversas substâncias, incluindo metabólitos primários (por exemplo, proteínas de defesa) e secundários (por exemplo, alcalóides, flavonóides, saponinas, taninos, terpenos e rotenóides). Esses compostos agem de diferentes maneiras, apresentando efeitos repelente, deterrente alimentar, deterrente de oviposição, inibidor de crescimento e tóxico (HARBORNE, 1993; CAVALCANTE et al., 2006). Proteínas de plantas que podem estar envolvidas em mecanismos de defesa são as lectinas, as proteínas inativadoras de ribossomos, os inibidores de proteases e glicohidrolases, as arcelinas, as quitinases, a canatoxina e formas modificadas de proteínas de reserva. Muitas das proteínas de reserva acumuladas em sementes e frutos também desempenham função de

25 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva defesa contra patógenos e pragas de invertebrados, além de sua função de armazenamento. As proteínas de defesa podem ser de natureza constitutiva ou sua expressão pode ser induzida em reposta ao ataque, sendo relativamente conservadas durante o curso da evolução. A maioria das plantas produzem ou acumulam proteínas protetoras semelhantes estrutural e funcionalmente, independentemente de suas diferenças morfológicas (VAN LOON et al., 1999; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2003). Os metabólitos secundários parecem não participar diretamente no crescimento e desenvolvimento das plantas, mas estão associados com a adaptação, transporte de íons metálicos e estabelecimento de simbioses, atuando também como hormônios, efetores diferenciais e moléculas de defesa (DEMAIN & FANG, 2000). A síntese de metabólitos secundários com papel de defesa pode ser induzida por estresse hídrico, variações sazonais de temperatura e luminosidades, ataque de herbívoros e infecção por patógenos (BRAY et al. 2000; BULBOVAS et al., 2005). Após ingestão por herbívoros, os metabólitos secundários podem afetar o processo de neurotransmissão, induzir modificações no DNA, complexar com proteínas e afetar a integridade de membranas, induzindo formação de poros e causando distúrbios na permeabilidade (WINK, 2003). A variedade de compostos produzidos pelas plantas envolvidos em mecanismos de defesa contra herbívoros e patógenos pode ser explorada na busca por produtos naturais que possam ser utilizados na manutenção da fitossanidade e no controle de insetos (REGNAULT- ROGER et al., 2004) Controle de insetos Uma substância que seja letal, repelente, deterrente ou inibidora para insetos é classificada como inseticida (ADDOR, 1994). Os inseticidas são amplamente utilizados para

26 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva controlar populações de espécies-praga que atacam construções e plantações, bem como de espécies que transmitem agentes etiológicos de doenças que acometem humanos e podem inclusive levar à morte. Substâncias inorgânicas sintéticas foram utilizadas em larga escala a partir da Segunda Guerra Mundial para controlar insetos. Em seguida, vários compostos orgânicos passaram a ser sintetizados, muitos a partir de produtos que ocorrem naturalmente em algumas plantas (como os análogos de piretróides). O uso de inseticidas químicos sintéticos, tais como organofosforados, carbamatos (organofosfatos), organoclorados e piretróides, ainda constitui a principal estratégia para controlar insetos. Entretanto, o uso contínuo em larga escala desses produtos tem levado à emergência de populações de insetos resistentes, danos ambientais persistentes, efeitos deletérios sobre organismos não-alvo, bem como distúrbios graves à saúde humana, principalmente em trabalhadores de grandes lavouras (PRIMACK & RODRIGUES, 2001; VIEGAS JÚNIOR, 2003; BARROS et al., 2006; LEITE et al., 2007; LIU et al., 2011). Neste cenário, a busca por inseticidas naturais e biodegradáveis representa uma alternativa ecológica promissora e tem sido estimulada visando identificar novos compostos que promovam a mortalidade dos insetos resistentes (REGNAULT-ROGER et al., 2004; BERNARDI et al., 2010). Embora os inseticidas naturais (ou bioinseticidas) muitas vezes não sejam tão efetivos quanto os inseticidas químicos sintéticos, sua utilização minimiza os riscos de efeitos deletérios sobre espécies não-alvo e reduz os riscos de danos à saúde humana (MENEZES, 2005; PAIVA et al., 2011a). Ainda, a ampliação do leque de substâncias naturais inseticidas aumenta as possibilidades de rotatividade, minimizando a aquisição de resistência pelos insetos (VIEGAS JÚNIOR, 2003; CAVALCANTE et al., 2006). Os inseticidas de origem vegetal (fitoinseticidas) têm sido intensivamente estudados em programas de manejo de pragas. Esses produtos geralmente apresentam baixa persistência

27 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva e ação residual, sendo rapidamente degradados. A utilização de extratos de plantas contendo diferentes princípios ativos pode dificultar a seleção de insetos resistentes, pois a variedade de compostos presentes se reflete em vários mecanismos de ação (REGNAULT-ROGER et al., 2004). O uso direto de extratos é também considerado viável quando aplicados de forma integrada, associado a outros métodos de controle, e particularmente útil em países em que a planta em estudo tem ampla utilização popular e/ou é encontrada em abundância (ISMAN, 2006). A identificação e isolamento dos componentes ativos do extrato são importantes para que os tratamentos se baseiem na aplicação dos componentes ativos de maior eficiência. Taninos, óleos essenciais, rotenóides, limonóides, flavonóides, terpenos, esteróis, fenilpropanóides, quinonas e saponinas apresentam efeito deletério sobre insetos. Atividade inseticida de lectinas de plantas tem sido descrita contra insetos de diversas ordens, como Lepidoptera (mariposas e borboletas), Coleoptera (besouros), Diptera (moscas e mosquitos), Homoptera (cigarras, pulgões e cochonilhas) e Isoptera (cupins), dentre outras (PAIVA et al., 2011a) Lectinas As lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam a carboidratos, sendo capazes de induzir a aglutinação de células ao interagirem com glicoconjugados presentes na superfície celular (PAIVA et al., 2010). A detecção de lectinas em uma amostra é feita através do ensaio de hemaglutinação, em que a lectina se liga aos carboidratos da superfície dos eritrócitos, promovendo a formação de uma rede entre eles (Figura 1A). O ensaio de inibição da atividade hemaglutinante (Figura 1B) em presença de carboidratos livres em solução

28 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva (monossacarídeos, dissacarídeos ou glicoproteínas) confirma o caráter lectínico do fenômeno de aglutinação. Figura 1. Esquema representando a aglutinação de eritrócitos promovida por lectinas. (A) Rede de aglutinação formada pela ligação de uma lectina aos carboidratos da superfície dos eritrócitos. (B) Inibição da formação da rede de aglutinação por carboidratos livres. Fonte: PAIVA et al. (2011b) As lectinas estão presentes em todos os reinos da natureza, sendo encontradas em bactérias (IMBERT et al., 2004), algas (HAN et al., 2010), fungos (KHAN et al., 2007), liquens (SILVA et al., 2009), invertebrados esponjas (MOURA et al., 2006), cnidários (FENTON-NAVARRO et al., 2003), moluscos (KONG et al., 2011), crustáceos (XU et al., 2010) e insetos (OURTH et al., 2005) e vertebrados peixes (TERADA et al., 2007), répteis (NUNES et al., 2011), aves (HOGENKAMP et al., 2006) e mamíferos (OLA et al., 2007). Em plantas, as lectinas têm sido detectadas em cascas (NASCIMENTO et al., 2008; SÁ et al., 2009b; VAZ et al., 2010; ARAÚJO et al., 2012), cerne (SÁ et al., 2008), cladônias (SANTANA et al., 2009), flores (SANTOS et al., 2009), folhas (COELHO & SILVA, 2000; COSTA et al., 2010), raízes (SOUZA et al., 2011), rizomas (BAINS et al., 2005; SANTANA et al., 2012) e sementes (COELHO et al., 2009; SANTOS et al., 2009).

29 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Nas plantas, vários papéis fisiológicos têm sido atribuídos às lectinas, dentre os quais se destacam a possível ação defensora contra microorganismos patógenos e insetos, a participação no mecanismo de nodulação em leguminosas, a estocagem e mobilização de proteínas e carboidratos de reserva e o alongamento da parede celular (KENNEDY et al., 1995; HIRSCH, 1999; ISIDRO et al., 2001; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; LIMPENS & BISSELING, 2003). Além disso, as lectinas têm se mostrado importantes na ativação de algumas enzimas, como fosfatases (AOYAMA et al., 2001), galactosidades (BRECHTEL et al., 2001) e manosidases (KESTWAL et al., 2007) Purificação e caracterização de lectinas A primeira etapa na purificação de lectinas é a extração de proteínas em solução salina ou tampão. Caso apresentem atividade hemaglutinante inibida por carboidratos (monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos ou glicoproteínas), os extratos são submetidos ao fracionamento de proteínas utilizando sulfato de amônio (SANTANA et al., 2012) ou desnaturação pelo calor (SANTANA et al., 2008), por exemplo. Em seguida, as frações obtidas são submetidas à diálise exaustiva, para eliminar pequenas moléculas, como carboidratos e sal. Técnicas cromatográficas purificam as lectinas de acordo com tamanho da molécula (cromatografia de exclusão molecular), carga (cromatografia de troca iônica) e afinidade específica de ligação a carboidratos (cromatografia de afinidade). Métodos eletroforéticos são utilizados para a caracterização estrutural das lectinas, assim como para estabelecer o grau de pureza das mesmas. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas nativas revela a natureza de carga líquida da proteína purificada e PAGE sob condições desnaturantes (na presença de dodecilsulfato de sódio) e redutoras (na presença de β-mercaptoetanol ou

30 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva ditioteitrol, por exemplo) desdobra a proteína em suas subunidades constituintes e revela a massa molecular das mesmas. Além disso, coloração específica com o reativo de Schiff no gel de poliacrilamida pode indicar a natureza glicoprotéica da proteína (PAIVA et al., 2011a). As massas moleculares acuradas podem ser obtidas por espectrometria de massas e a estrutura primária (seqüência de aminoácidos) definida por espectrometria ou degradação de Edman, por exemplo. Estudos da composição de estruturas secundárias e de conformação (estruturas terciária e quaternária) podem ser realizados através de técnicas como dicroísmo circular e cristalografia de raios X (SHIRAI et al., 2009; ROCHA et al., 2011). O ensaio de hemaglutinação é um método simples, versátil e de baixo custo que possibilita caracterizar a lectina quanto à especificidade de ligação a carboidratos, estabilidade em diferentes valores de ph e após aquecimento a temperaturas elevadas, bem como na presença de enzimas e outras substâncias que podem alterar a atividade da proteína. Ainda, devido às diferenças nos tipos de carboidratos presentes na superfície do eritrócito, as lectinas podem apresentar uma afinidade maior por células de determinado animal (KENNEDY et al., 1995; PAIVA et al., 2011a) Atividades biológicas e aplicações biotecnológicas de lectinas Devido às suas diversas propriedades biológicas, as lectinas apresentam uma vasta gama de aplicações biotecnológicas, com os mais diversos fins. Atualmente, as lectinas aparecem como ferramentas de destaque no campo da tecnologia de bioreconhecimento. Na área conhecida como lectinômica, técnicas de microarrays utilizando lectinas têm sido desenvolvidas como ferramentas eficientes para decifrar o glicocódigo que reflete o estado fisiológico da célula (GEMEINER et al., 2009). Com base na elevada capacidade de reconhecimento de carboidratos, as lectinas se tornaram importantes ferramentas no

31 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva isolamento, em estudos estruturais e no mapeamento de oligossacarídeos e glicoconjugados (HAYUNGA et al., 1986; MONZO et al., 2007; XIE et al., 2009). Colunas das lectinas imobilizadas de Canavalia ensiformis (QIU et al., 2007) e de Cratylia mollis (LIMA et al., 1997) foram eficientes na separação de glicoproteínas de soro humano. Uma proteína de soja (Glycine max) com ação anti-agregante sobre plaquetas foi isolada utilizando matriz de afinidade contendo a lectina de C. mollis imobilizada em Sepharose 4B (SILVA et al., 2011). O reconhecimento entre lectinas e carboidratos permite a utilização das lectinas na Histologia e Patologia como ferramentas em ensaios citoquímicos para localização de glicoconjugados e resíduos glicosilados e como ferramentas histoquímicas para análises de estruturas de tecidos humanos normais e alterados (FRANCESCHINI et al., 2000; PEDINI et al., 2001; LIMA et al., 2010). As lectinas apresentam diversas atividades biológicas, como: estimulação da proliferação de linfócitos (MACIEL et al., 2004), macrófagos (ANDRADE et al., 1999) e neutrófilos (TIMOSHENKO et al., 1995), estimulação da produção de interferon γ por linfócitos (MELO et al., 2010), atividade antiinflamatória (MELO et al., 2010), antitumoral (FANG et al., 2010; NUNES et al., 2012), antifúngica (SÁ et al.; 2009a; SANTANA et al., 2009; SOUZA et al., 2011) antibacteriana (OLIVEIRA et al., 2008; SÁ et al., 2009a; NUNES et al., 2011), antiviral (SATO et al., 2011), hipotensiva (WANG et al., 1996), antinociceptiva (FIGUEIREDO et al., 2009) e inseticida Lectinas inseticidas e seus mecanismos de ação Atividade inseticida de lectinas tem sido descrita contra estágios de desenvolvimento e formas maduras de insetos das Ordens Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera e Neuroptera (PAIVA et al., 2011a). Os mecanismos pelos quais as lectinas exercem seus efeitos inseticidas são pouco

32 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva conhecidos e tem ganhado interesse nos últimos anos. Lectinas entomotóxicas são geralmente resistentes à degradação proteolítica no trato digestivo de insetos (OLIVEIRA et al., 2011). A ligação de lectinas a moléculas glicosiladas do trato intestinal dos insetos pode interferir nas funções de enzimas digestivas e proteínas assimilatórias, inibindo a digestão e absorção de nutrientes (COELHO et al., 2007). Quando ingeridas, as lectinas podem interferir nas atividades enzimáticas por: (1) ligação à porção glicídica de enzimas glicosiladas; (2) ligação às enzimas através de sítios diferentes do sítio de ligação ao substrato; (3) ligação ao substrato; (4) ligação tanto à enzima quanto ao substrato, aumentando a afinidade entre eles (MACEDO et al., 2007). A lectina de folha de Bauhinia monandra estimulou in vitro a atividade de α-amilase em larvas de Callosobruchus maculatus (MACEDO et al., 2007). Fitches & Gatehouse (1998) reportaram que, em curto prazo, a lectina de Galanthus nivalis apresentou efeito estimulatório sobre tripsina, α-glicosidase e aminopeptidase de larvas de Lacanobia oleracea causando, em longo prazo, uma diminuição na atividade de α-glicosidase. Larvas da mosca do melão (Bactrocera cucurbitae) apresentaram redução nas atividades de fosfatases ácidas e alcalinas quando alimentadas com a lectina de tubérculos de Arisaema helleborifolium, enquanto a atividade de esterases aumentou consideravelmente (KAUR et al., 2006). A matriz peritrófica constitui uma membrana encontrada no intestino médio de insetos, exceto os das ordens Hemiptera e Homoptera (BANDYOPADHYAY et al., 2001; DAMASCENO-SÁ & SILVA, 2007), que separa o conteúdo do lúmen intestinal das células epiteliais digestivas. A matriz contém uma rede composta por quitina (polímero de N- acetilglicosamina) e glicoproteínas, como as peritrofinas (TELLAM et al., 1999). Sua integridade é importante, pois a matriz peritrófica compartimentaliza os processos digestivos, bem como atua na proteção contra infecções por microorganismos e danos mecânicos provocados por partículas alimentares abrasivas (HEGEDUS et al., 2009). Lectinas de plantas

33 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva com afinidade por N-acetilglicosamina e propriedade de ligação à quitina são inseticidas para muitos insetos por se ligarem à quitina e proteínas glicosiladas da matriz peritrófica, interferindo nos processos de digestão e absorção de nutrientes (PEUMANS & VAN DAMME, 1995; ZHU-SALZMAN et al., 1998; ZHU-SALZMAN & SALZMAN, 2001; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2004; MACEDO et al., 2007). Estudos ultraestruturais mostraram anormalidades na formação da matriz peritrófica de insetos alimentados com a lectina ligadora de quitina de Triticum vulgaris (WGA), tais como a hipersecreção de muitas camadas desorganizadas em larvas de Ostrinia nubilalis e alterações morfológicas nas microvilosidades de larvas de Drosophila (HARPER et al., 1998; LI et al., 2009; VANDENBORRE et al., 2011). Lectina das sementes de Canavalia ensiformis (Con A) promoveu redução da permeabilidade da matriz peritrófica, assim como restrição no movimento de nutrientes e enzimas digestivas através dos poros da membrana peritrófica (EISEMANN et al., 1994) Lectinas podem cruzar a barreira epitelial por transcitose e entrar no sistema circulatório do inseto, interferindo com moléculas de autodefesa presentes na hemolinfa (FITCHES et al., 2001). Lectinas podem também ser internalizadas em vesículas nas células epiteliais por endocitose e bloquear a proliferação celular (YU et al., 1999). No caso de afídeos (Homoptera), que não possuem matriz peritrófica, foi demonstrado que a lectina de Allium sativum se ligou a resíduos de carboidratos de proteínas receptoras específicas presentes nas vesículas da membrana em borda escovada, o que pode resultar na diminuição da permeabilidade (BANDYOPADHYAY et al., 2001). Banerjee et al. (2004) sugeriram que o alvo da lectina de A. sativum sobre o afídeo da mustarda (Lipaphis erysimi) não é uma molécula produzida pelo próprio inseto, mas uma chaperonina conhecida como simbionina que é produzida pela bactéria Buchnera aphidicola, um simbionte obrigatório dos afídeos.

34 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) Myracrodruon urundeuva (Figura 2), descrita por Francisco Allemão & Cysneiro em 1862, é uma anacardiácea que pode ser encontrada desde o México até a Argentina (BARKLEY, 1968; GARRIDO & POGGIANI, 1979). No Brasil, é conhecida como aroeira, aroeira-do-sertão, aroeira-preta, aroeira-do-campo, aroeira-verdadeira ou urundeúva, entre outras denominações. A denominação aroeira é uma corruptela de arara e eira, com significado de árvore da arara. Já o termo urundeúva é de origem tupi-guarani e possui o significado não se deteriora na água (LORENZI, 2000; ALMEIDA-CORTEZ et al., 2007). Apesar de ser considerada típica de regiões da Caatinga e do Cerrado formando agrupamentos densos, é também encontrada em formações muito úmidas e fechadas, incluindo florestas pluviais com até 2000 mm de precipitação anual. Distribui-se em ampla faixa do território brasileiro, desde o Maranhão até o Paraná, sendo mais freqüente nos estados de Minas Gerais, Bahia, São Paulo, Mato Grosso e Goiás (LORENZI, 2000). A aroeira-do-sertão não é encontrada na Floresta Amazônica (RECORD & HESS apud LEITE, 2002). Na Caatinga e no Cerrado, os indivíduos alcançam de 5 a 15 m de altura e 15 a 60 cm de diâmetro, enquanto alguns podem chegar a 30 m de altura e 100 cm de diâmetro em regiões de florestas tropicais (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS PARA AGRICULTURA E ALIMENTAÇÃO, 1986). A aroeira-do-sertão é encontrada regularmente em solos ricos e sobrevive a longos períodos de baixa umidade (GARRIDO & POGGIANI, 1979; LEITE, 2002). O tamanho da árvore é diretamente proporcional à disponibilidade de água (MUÑOZ, 1990).

35 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva A aroeira-do-sertão é uma árvore decídua (Figura 2B) com um tronco reto e cilíndrico (LÓPEZ, 1987). As folhas são compostas imparipinadas (Figura 2C), com 10 a 30 cm de comprimento, ápice ligeiramente acuminado e borda serreada. As inflorescências consistem em racemos (Figura 2D), formando cachos nas pontas de ramos sem folhas. As flores (Figura 2E) são unissexuais e hipóginas e apresentam 5 pétalas. As sépalas são persistentes e permanecem ao redor do fruto, uma drupa esférica com 3 a 4 mm de diâmetro (LEITE, 2002). A B C D E Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do Cerrado que já perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E) flores. A, C e D: retirado de Lorenzi (2000). B e E: Fernando Tatagiba. A floração ocorre geralmente após a queda das folhas, entre os meses de Novembro e Janeiro, no Brasil. Abelhas da espécie Trigona spinips foram descritas como agentes polinizadores e as sementes são dispersas pelo vento. O tempo de dormência pode variar entre as variedades encontradas (M. urundeuva var. urundeuva e M. urundeuva var. candollei), com a germinação ocorrendo após 4 a 7 dias, ou somente após 2 semanas, dependendo das condições do local (LEITE, 2002).

36 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva A casca é marrom-escura (Figura 3A), apresentando escamas nos indivíduos mais velhos, sendo mais lisa nos mais jovens (RIZZINI, 1978). A infusão da entrecasca é um dos remédios mais utilizados na medicina popular contra doenças respiratórias e urinárias (NAPRALERT, 2001). Extratos aquosos da casca apresentaram também atividades antiulcerogênica, anticolinérgica (MENEZES et al., 1986), antiinflamatória (RAO et al., 1986), antidiarréica e analgésica (ALMEIDA-CORTEZ et al., 2007). A madeira de M. urundeuva (Figuras 3B e 3C) não apresenta listras, é muito densa (densidade de 1,19 g/cm 3 ) e com elevada resistência mecânica, sendo incluída entre as madeiras-de-lei. O alburno é bem diferenciado do cerne e pode ser facilmente decomposto. O cerne de M. urundeuva é uniforme, de coloração vermelho-cereja ou, quando exposto ao ar, vermelho-amarronzado escuro. A madeira é extremamente resistente à biodeterioração, mesmo quando caída no solo, sendo uma das mais tradicionalmente escolhidas na indústria de móveis e construção civil, naval e hidráulica. Também é utilizada na produção de carvão vegetal (LÓPEZ, 1987; MORAIS et al., 1999; LORENZI, 2000). A B C Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de aroeira. A e B: retirado de Lorenzi (2000). C: Porto Seguro Madeiras. Devido à intensa exploração de suas propriedades, principalmente para confecção de cercas, estacas e postes, a aroeira-do-sertão se tornou uma das espécies de plantas lenhosas mais ameaçadas no mundo, figurando na lista de espécies ameaçadas de organizações

37 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva (governamentais ou não) de defesa do meio ambiente. Os principais fatores que ameaçam a aroeira-do-sertão são a destruição do habitat (principalmente no Cerrado e na Caatinga, que têm sofrido com a devastação e o uso excessivo e/ou inadequado da terra) e a superexploração da madeira (LEITE, 2002; OLIVEIRA et al., 2007). A ameaça de extinção e o interesse mundial em fitoterápicos têm estimulado o desenvolvimento de estratégias de conservação de plantas medicinais. O grande valor da aroeira-do-sertão relacionado à produção de fármacos e à sua madeira faz dela uma das espécies que mais precisam de medidas de conservação. Nesse sentido, estudos visando à obtenção de informações sobre a biologia, ecologia, manejo e silvicultura da aroeira-do-sertão que sejam relevantes para sua conservação genética e valorização como um recurso sustentável têm se tornado cada vez mais necessários (OLIVEIRA et al., 2007). Resultados obtidos no estudo da possibilidade de desenvolvimento de M. urundeuva em plantações se mostraram contraditórios e o uso de plantações comerciais da aroeira-dosertão não tem sido considerado a principal estratégia de conservação, ainda que existam possibilidades. Leite (2002) considera que a conservação efetiva de M. urundeuva em território brasileiro se encontra ameaçada devido à falta de conhecimentos sobre a biologia reprodutiva da espécie e à ausência de medidas mais eficazes das instituições responsáveis que visem regulamentar a conservação dessa espécie Lectinas de M. urundeuva Extratos salinos da casca, cerne e alburno de M. urundeuva foram avaliados quanto à atividade hemaglutinante. Apenas o extrato de alburno não foi capaz de aglutinar eritrócitos (SÁ et al., 2009c). Sá et al. (2009b) isolaram as lectinas de casca (MuBL) e cerne (MuHL) de M. urundeuva através de cromatografia de afinidade em coluna de quitina e determinaram

38 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva seus padrões eletroforéticos (Figura 4). As lectinas se apresentaram como proteínas básicas formadas por subunidades de massas moleculares 14,4 (MuHL) e 14,0 (MuBL) kda. MuBL e MuHL também adsorveram em matriz contendo N-acetilglicosamina imobilizado em Agarose (SÁ et al., 2009b). Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) e MuHL (B). Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de poliacrilamida em condições nativas para proteínas básicas (1) e em condições desnaturantes (2). Fonte: SÁ et al. (2009b). MuHL apresentou elevada toxicidade para cupins da espécie N. corniger (com maior efeito nos soldados), mas não promoveu efeito repelente (SÁ et al., 2008). A atividade inseticida detectada assinala a possibilidade da participação de MuHL na resistência do cerne de M. urundeuva à biodeterioração por cupins. Adicionalmente, MuHL foi capaz de inibir o crescimento de espécies de fungos do gênero Fusarium (SÁ et al., 2009a). MuBL e MuHL apresentaram potente atividade inseticida sobre o quarto estágio larval de A. aegypti com CL 50 de 0,125 e 0,04 mg/ml, respectivamente (SÁ et al., 2009b), mosquito

39 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva de grande importância na saúde pública por ser o vetor de vírus causadores de doenças como a dengue, a febre amarela e a febre chikungunya Cupins Os cupins ou térmitas (Ordem Isoptera) constituem um grande grupo de insetos eusociais que vivem em colônias compostas por várias castas e indivíduos em diferentes estágios de desenvolvimento (HOJO et al., 2005). Os cupins vivem em ninhos ou cupinzeiros e as tarefas relacionadas à reprodução, defesa e limpeza estão divididas entre as castas, que são diferenciadas morfologicamente (BERTI FILHO, 1993). A cabeça é livre, de forma e tamanho variáveis. Olhos compostos estão presentes nas formas aladas e, nos cupins superiores, em lugar dos ocelos, há uma depressão chamada fontanela, que possui um poro central no qual se abre uma glândula cefálica que secreta um líquido com função de defesa. O aparelho bucal é mastigador e bem desenvolvido e o tórax achatado, com o protórax destacado. O órgão auditivo está situado na tíbia anterior. O abdome é volumoso, séssil e com 10 segmentos. Os dois pares de asas são membranosos e o desenvolvimento é por paurometabolia (ovo ninfa adulto) (GALLO et al., 1988). Os indivíduos alados (aleluias) são temporários e responsáveis pela reprodução sexuada da colônia. Os reprodutores voam do ninho no crepúsculo. Após o vôo, caem no chão, livram-se de suas asas e então realizam a primeira cópula, ao encontrarem um parceiro. Formado o casal real, eles encontram um local adequado e iniciam a instalação do ninho, que inicialmente consiste em poucas galerias e uma câmara nupcial, onde a fêmea realiza as posturas e o casal copula outras vezes. Os novos indivíduos constituirão as demais castas e o cupinzeiro cresce rapidamente, podendo atingir milhões de indivíduos. A rainha, que quando completamente desenvolvida pode apresentar uma relação entre o abdome e o resto do corpo

40 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva de 200:1 em algumas espécies, pode viver de 6 a 10 anos, ovipositando até cerca de 50 mil ovos em toda sua vida (ZANETTI et al., 2002). As formas ápteras são permanentes e podem ser férteis ou estéreis. Dentre as férteis, estão o casal real após o vôo e as rainhas e os reis de substituição, que substituem o casal quando esse morre ou uma colônia é fragmentada. Dentre os indivíduos gerados, encontramse algumas ninfas que se desenvolverão em formas aladas, as quais, por sua vez, formarão novas colônias. As formas estéreis constituem as castas de operários e soldados. Os soldados defendem a colônia. São cegos e apresentam mandíbulas bem desenvolvidas, que são utilizadas para defesa e não para mastigação. Os operários são também, normalmente, cegos e cuidam da prole, forrageiam alimento e constroem o ninho. Por serem fototrópicos negativos, desenvolvem suas atividades na escuridão (PFDAT, 1985; GALLO et al., 1988; BERTI FILHO, 1993; ZANETTI et al., 2002). Os cupins são capazes de se alimentar de materiais ricos em celulose como madeira, papel, plantas vivas e de matéria orgânica em decomposição. A capacidade de aproveitar a celulose como fonte energética se deve à presença de uma comunidade simbiótica de microrganismos encontrada no trato intestinal dos cupins (FRÖHLICH et al., 2007). Essa microbiota é capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose, fermentar e despolimerizar produtos a ácidos graxos de cadeia curta, que são absorvidos pelo hospedeiro, e fixar nitrogênio, além de estar envolvida no metabolismo de hidrogênio (BRUNE, 1998; FRÖHLICH et al., 2007; WARNECKE et al., 2007). A Ordem Isoptera compreende sete famílias: Mastotermitidae, Kalotermitidae, Termopsidae, Hodotermitidae, Serritermitidae, Rhinotermitidae e Termitidae, que estão subdivididas em quatorze subfamílias (GRASSÉ, 1986; KAMBHAMPATI & EGGLETON, 2000). Os cupins das seis primeiras famílias são chamados cupins inferiores, enquanto que os cupins da família Termitidae são denominados cupins superiores. Essa designação

41 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva refere-se à presença de protozoários flagelados simbiontes que auxiliam na degradação da celulose no trato digestivo de térmitas inferiores, enquanto nos térmitas superiores, apenas bactérias simbiontes estão presentes (COSTA-LEONARDO, 2002). O papel ecológico dos térmitas é dos mais importantes. Juntamente com as formigas, atuam na reciclagem dos nutrientes acumulados em enorme parte da biomassa nos ecossistemas tropicais, funcionando como consumidores primários e decompositores. Também promovem benefícios no solo, aerando, drenando e transportando nutrientes (VASCONCELLOS et al., 2005). Por outro lado, cerca de 10% das espécies conhecidas de isópteros estão registradas como pragas. Os cupins estão entre os mais severos agentes destruidores da madeira (PAES & VITAL, 2000) e também danificam uma variedade de materiais que variam de telas de papel a materiais não-celulósicos tais como o betume do asfalto e folhas de metal (BULTMAN et al. apud CHENG et al., 2007). Os cupins atacam madeiras não-resistentes penetrando no tronco da árvore através de duas rotas principais: a casca e as raízes. Alguns cupins são capazes de penetrar pelas raízes das árvores e construir galerias no interior do tronco, destruindo o cerne e deixando as árvores ocas. Quando mortas, essas madeiras se tornam ainda mais suscetíveis ao ataque. Estimou-se que os prejuízos causados pela ação de cupins sobre madeiras e outros materiais contendo celulose excederiam US$ 50 bilhões anuais mundialmente (KORB, 2007). O controle de cupins tem sido convencionalmente feito com inseticidas organofosforados e piretróides, que podem ser tóxicos para outros seres vivos e apresentam considerável risco de contaminação ambiental. Extratos de diversas partes das plantas, extrativos de madeiras e entrecascas, feromônios, análogos do hormônio juvenil e inibidores da síntese de quitina são tidos como potenciais componentes de produtos alternativos para combater espécies-praga de cupins, sem oferecer grande perigo ao meio ambiente (SOGABE et al., 2000; CABRERA et al., 2001; CHEN et al., 2004).

42 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva O gênero Nasutitermes Os cupins nasutos da subfamília Nasutiterminae (Família Termitidae), a mais diversificada da ordem Isoptera (KAMBHAMPATI & EGGLETON, 2000), são assim chamados porque a cabeça dos soldados se estreita na parte anterior, em uma projeção semelhante a um nariz, que é utilizada para defesa, emitindo substâncias adesivas ou tóxicas (HOJO et al., 2005). O gênero Nasutitermes (Figura 5) tem distribuição mundial e é um dos mais ricos em espécies. O número de indivíduos em um ninho (Figura 5A) pode chegar a 3 milhões e a longevidade máxima das colônias de Nasutitermes varia de 40 a 80 anos (KAMBHAPATTI & EGGLETON, 2000). Constroem ninhos no tronco ou no sistema radicular de árvores e acima ou abaixo do nível do solo (SCHEFFRAHN et al., 2002; ALBUQUERQUE et al., 2005). Enquanto gênero, os Nasutitermes são morfologicamente bem diferenciados da grande maioria dos cupins pelo aspecto bem característico da cabeça nos soldados (Figura 5C), mas a classificação ao nível de espécie não é uma tarefa fácil (CONSTANTINO, 1992; MIURA et al., 2000; SCHEFFRAHN et al., 2002). A B C D Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Ninho (A), operário (B) e soldado (C) de Nasutitermes corniger. (D) Rainha de Nasutitermes euphratae. Fontes: A: Reginaldo Constantino. B e C: Thiago H. Napoleão. D: Michele D.C. Silva.

43 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Os Nasutitermes têm sido favorecidos pelo desequilíbrio ambiental, demonstrando acentuados sinais de nocividade. Por isso, têm sido considerados como uma nova ameaça aos centros urbanos. Buscam preferencialmente as partes altas das edificações, sendo visíveis em telhados, forros e vãos estruturais (FIGUEIREDO, 2004). No Semi-Árido brasileiro, os Nasutitermes têm invadido o meio urbano, atacando móveis e estruturas de construções (PAES et al., 2002). Colônias de N. corniger também foram encontradas atacando estruturas de madeira de museus (BRAZOLIN et al., 2004). Atividade inseticida sobre operários e soldados de N. corniger tem sido descrita para a lectina do cerne de M. urundeuva (MuHL), bem como para as lectinas isoladas do líquen Cladonia verticillaris, das raízes secundárias de B. monandra e dos cladódios de Opuntia fícus indica (SÁ et al., 2008; SILVA et al., 2009; PAIVA et al., 2011c; SOUZA et al., 2011). Nos testes, os cupins soldados e operários são colocados em contato com discos de papel impregnados com a solução líquida das lectinas em diferentes concentrações (Figura 6). d Figura 6. Ensaio termiticida. O disco de papel de filtro (d), de 4 cm de diâmetro, é impregnado com solução da amostra a ser avaliada. Foto: Thiago H. Napoleão 2.6. Aedes aegypti O mosquito A. aegypti é originário do norte da África e é uma espécie cosmopolita, amplamente distribuída em regiões tropicais e subtropicais (FORATTINI & BRITO, 2003).

44 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva O desenvolvimento do A. aegypti ocorre através dos estágios de ovo, larva (quatro estágios: L1, L2, L3 e L4), pupa e adulto (Figura 7A). Em condições favoráveis de temperatura, umidade e disponibilidade de alimento, o período entre o estágio de ovo e a emergência do adulto varia entre 10 a 13 dias (FORATTINI, 1965). Figura 7. (A) Ciclo de vida do A. aegypti. (B). Larva de A. aegypti no estágio L4. Fontes: A: Secretaria de Saúde e Defesa Civil do Estado do Rio de Janeiro. B: Nataly D.L. Santos & Thiago H. Napoleão. O corpo da larva é composto de cabeça, tórax e abdômen (Figura 7B). O abdômen das larvas L4 é dividido em oito segmentos, com brânquias anais presentes no último segmento. Um sifão ou tubo de sucção ou de ar é utilizado para a respiração. Para respirar, a larva vem até superfície da água fazendo movimentos em forma de S durante seu deslocamento. As larvas são sensíveis a movimentos bruscos na água e se movem rapidamente em reposta a feixes de luz, procurando refúgio no fundo do recipiente. O tamanho do corpo do mosquito é dependente de fatores genéticos, bem como da alimentação das larvas e da temperatura durante o período de desenvolvimento (KAMIMURA et al., 2002; ALTO et al., 2008).

45 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Após a fase larvária, surgem as pupas, que não se alimentam. A pupa tem um par de tubos respiratórios ou trompetas, que atravessam a água e permitem a respiração. Logo após emergir do estágio pupal, o inseto adulto procura pousar sobre as paredes do recipiente, assim permanecendo durante várias horas, o que permite o endurecimento do exoesqueleto e das asas. O macho se distingue essencialmente da fêmea por possuir antenas plumosas e palpos mais longos (SERVICE, 1996; SANTOS, 2009). O macho alimenta-se de carboidratos extraídos dos vegetais. As fêmeas se alimentam mais freqüentemente de sangue (repasto sangüíneo). A maior parte dos animais vertebrados constitui fonte de repasto, mas há uma grande afinidade pelo homem. O repasto sangüíneo das fêmeas fornece proteínas para o desenvolvimento dos ovos (SANTOS, 2009). A. aegypti é o vetor dos vírus causadores da febre amarela e da febre da dengue. A febre amarela é uma arbovirose caracterizada por hepatite grave, insuficiência renal, hemorragia e eventos terminais rápidos, com choque e falência de múltiplos órgãos. A prevenção é feita através da vacina e de medicamentos antivirais, tais como ribavirina, tiazofurina, carboxamida e pirazolina (MONATH, 2008). A dengue é uma infecção re-emergente no Brasil causada por quatro sorotipos do arbovírus DEN (Flavivirus), que se manifesta em diferentes formas clínicas (TAUIL, 2002; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2009). A forma clássica é uma doença de baixa mortalidade, enquanto pacientes com a febre da dengue hemorrágica apresentam manifestações hemorrágicas, hepatomegalia, insuficiência circulatória e mortalidade elevada (MELTZER & SCHWARTZ, 2009). A dengue é uma importante questão de saúde pública nos países tropicais e subtropicais. Fatores socioeconômicos e outras variáveis relacionadas à organização do espaço urbano estão envolvidos na expansão da doença (BRAGA & VALLE, 2007).

46 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva O controle físico, mais conhecido como controle ambiental ou mecânico consiste na substituição, drenagem ou redução dos locais de reprodução dos insetos. A participação da população é fundamental na localização e eliminação dos criadouros, principalmente intradomiciliares e peridomiciliares, que funcionam como os principais focos para proliferação desse inseto (CONSOLI & OLIVEIRA, 1994; HEMME et al., 2009). A exposição à luz solar, com conseqüente aumento na temperatura da água afeta negativamente o ciclo de vida do inseto e esta estratégia pode ser adotada como uma medida adicional para controlar a população de mosquitos (HEMME et al., 2009). Estratégias para o controle biológico de mosquitos utilizam organismos predadores (peixes e copépodas), patógenos e parasitas naturais. Algumas linhagens de bactérias entomopatogênicas, do gênero Bacillus, produzem toxinas protéicas com um alto grau de especificidade a insetos vetores que, quando ingeridas, provocam mortalidade das larvas. As duas espécies mais utilizadas como larvicidas são o Bacillus sphaericus (Bs) e Bacillus thuringiensis serovar israelensis (Bti). O Bti é estável sob condições normais de armazenamento e demonstrou excelente persistência em ensaios que mimetizaram condições de campo (ARAÚJO et al., 2007). O controle químico de mosquitos com os inseticidas organofosforados, piretróides e organofosforados é a principal medida adotada em programas de saúde pública. No entanto, o uso contínuo desses inseticidas tem selecionado larvas resistentes e efeito genotóxico do organofosforado temefós tem sido reportado em concentrações normalmente utilizadas no controle de larvas (AIUB et al., 2002; POUPARDIN et al., 2008; MELO-SANTOS et al., 2010). Dessa forma, a busca por inseticidas naturais, biodegradáveis e isentos de toxicidade para organismos não-alvo tem crescido. Extratos vegetais, óleos essenciais, saponinas, flavonóides, limonóides, rotenóides, terpenos, fenilpropanóides, quinonas e lectinas têm sido avaliados como alternativas aos inseticidas sintéticos (PAIVA et al., 2011b).

47 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais Os gorgulhos do gênero Sitophilus (Ordem Coleoptera, Família Curculionidae) são insetos cosmopolitas ao longo das regiões tropicais e infestam alguns dos grãos de maior importância mundialmente: arroz (Sitophilus oryzae), trigo (Sitophilus granaries) e milho (Sitophilus zeamais). Os Sitophilus são também capazes de atacar sorgo e alimentos processados, tais como macarrão e biscoitos (FAZOLIN et al., 2010). Os insetos adultos da espécie S. zeamais (Figura 8A) apresentam um comprimento variando de 2,5 a 4 mm e manchas avermelhadas nas asas anteriores, denominadas élitros (Figura 8B). A cabeça se projeta para frente na forma de um rostro curvado (Figuras 8A e 8B), o qual é mais curto e grosso nos machos e mais longo e fino nas fêmeas. São capazes de voar, infestando rapidamente as espigas no campo e nos locais de armazenamento. Apesar de bastante similar à espécie S. oryzae, os gorgulhos do milho diferem pelas manchas avermelhadas mais claramente definidas e pelo tamanho maior, além de diversos outros detalhes em características anatômicas externas (ANTUNES & DIONELLO, 2010). Os adultos utilizam os grãos como alimento (Figura 8C) e as formas imaturas se desenvolvem dentro dos grãos, os quais funcionam como fonte de nutrientes e abrigo (Figura 8D). As fêmeas abrem orifícios nos grãos com a mandíbula e, em seguida, depositam seus ovos e selam as perfurações com uma secreção produzida por glândulas associadas ao sistema ovipositor (Figura 8D). As fêmeas podem viver até 140 dias, 104 destes correspondendo ao período de oviposição, e o número médio de ovos por fêmea é de 282 (BOTTON et al., 2005). Após a eclosão dos ovos, as larvas se desenvolvem, passando por quatro estágios, e alcançando o estágio de pupa (Figura 8D). Apenas uma larva conseguirá se desenvolver por grão, mesmo que mais de um ovo tenha sido depositado. Após completado o desenvolvimento do adulto dentro do grão, ele emerge e cresce até atingir a maturidade, reiniciando o ciclo

48 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva biológico (ANTUNES & DIONELLO, 2010). Tendo o milho como hospedeiro, o ciclo biológico do ovo até a emergência do adulto dura em média 34 dias (BOTTON et al., 2005). Figura 8. Sitophilus zeamais. (A) Inseto adulto explorando grão de milho, com destaque para o rostro (1). (B) Inseto adulto, com destaque para o rostro (1) e as manchas avermelhadas (2) nos élitros. (C) Adultos em infestação de grãos de milho armazenados. (D) Fêmea ovipositando dentro do grão de milho (3), larva em desenvolvimento (4) e pupa (5). Fontes: (A) (B) (C) Via Rural. (D) S. zeamais, juntamente com outras pragas de grãos estocados, causam uma perda estimada de 20 a 30% da produção de milho (TEFERA et al., 2011). As perdas ocasionadas por S. zeamais no armazenamento de grãos são muitas vezes mais graves do que as que ocorrem na cultura em campo, pois são definitivas e irrecuperáveis. Miranda et al. (1995) afirmam que a infestação desta praga pode gerar perdas em até 30% de grãos armazenados em

49 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva fazendas. S. zeamais também tem sido encontrado atacando frutos de macieira, pessegueiro e videira, geralmente no período próximo à colheita (BOTTON et al., 2005). Estudos relatam prejuízos provocados pelos inseticidas atualmente utilizados no controle de S. zeamais a organismos não-alvo e ao homem, além da persistência no ambiente. Ainda, resistência de S. zeamais a inseticidas como Malation, Lindane, deltametrina e fosfinas (extremamente voláteis e tóxicas) já foi descrita (PEREZ-MENDOZA, 1999). Embora os níveis de resistência no Brasil ainda sejam considerados baixos, é esperado um considerável aumento devido ao uso massivo de inseticidas como o fenithorion (PEREIRA et al., 2009; BRAGA et al., 2011). Os inseticidas utilizados podem atuar por contato ou serem aplicados através de fumigação. Alternativamente e/ou paralalelamente ao uso de inseticidas, o controle de pragas de grãos armazenados tem sido realizado a partir da limpeza e secagem dos grãos, manutenção da aeração e regulação da temperatura. Outras estratégias alternativas aos inseticidas sintéticos para controle de S. zeamais incluem fungos entomopatogênicos, uso de pó de diferentes folhas e diferentes compostos de origem vegetal (ADANE et al., 1996; KEHINDE & ANGELA, 2004; ILELEJI et al., 2007; NOOMHORM et al., 2009; UKEH et al., 2009; YUYA et al., 2009; BETANCUR et al., 2010; NUKENINE et al., 2010; COITINHO et al., 2011). Procópio et al. (2003) observaram uma repelência de 96% sobre S. zeamais causada por pó da folha de Eucalyptus citriodora e mortalidade total provocada pelo pó da folha de Chenopodium ambrosioides. Mortalidade acima de 70% foi detectada após fumigação de óleos essenciais de Piper hispidinervum e Piper aduncum, bem como após exposição tópica a estes mesmo óleos (ESTRELA et al., 2006). Apesar de constituírem inseticidas alternativos amplamente investigados contra diversos insetos, as proteínas bioativas extraídas de plantas

50 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva (tais como lectinas, inibidores de protease, inibidores de amilase, arcelinas, quitinases, entre outras) ainda não foram investigadas quanto ao efeito sobre S. zeamais.

51 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva OBJETIVOS 3.1. GERAL Avaliar a atividade inseticida de lectinas isoladas de M. urundeuva sobre N. corniger, A. aegypti e S. zeamais e possíveis mecanismos de ação envolvidos ESPECÍFICOS Purificação e caracterização das lectinas de M. urundeuva Purificar a lectina de folha (MuLL) através de fracionamento salino e cromatografia em coluna de quitina. Avaliar o perfil eletroforético de MuLL em eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas e desnaturantes. Isolar as lectinas de entrecasca (MuBL) e cerne (MuHL) de M. urundeuva seguindo procedimentos previamente estabelecidas. Caracterizar MuLL, MuBL e MuHL quanto à inibição da atividade hemaglutinante (AH) por monossacarídeos e glicoproteínas, especificidade de ligação a eritrócitos (coelho e humanos), efeito do aquecimento e ph sobre a AH e conteúdo de carboidratos. Avaliar a interação de MuLL com matriz de N-acetilglicosamina imobilizado em agarose Estudo da atividade inseticida das lectinas de M. urundeuva contra N. corniger Determinar a atividade inseticida de MuBL e MuLL sobre operários e soldados de N. corniger através de ensaios de atividades termiticida e repelência.

52 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Avaliar a presença de atividade de tripsina em extratos de intestinos de operários e soldados. Determinar o efeito dos extratos de intestino sobre a AH de MuBL, MuHL e MuLL. Obter culturas das bactérias presentes em extratos de intestino de operários e soldados de N. corniger. Investigar o efeito de MuBL, MuHL e MuLL sobre as bactérias simbiontes Estudo da atividade larvicida de MuLL contra A. aegypti Investigar o efeito do extrato de folhas de M. urundeuva e de MuLL na sobrevivência de larvas L4. Obter extratos de intestinos de larvas e avaliá-los quanto às atividades proteolítica, de tripsina e de α-amilase. Avaliar a atividade proteolítica em extratos de intestinos das larvas através de zimografia para proteases. Determinar o efeito dos extratos do intestino de larvas contendo proteases sobre a AH de MuLL. Determinar o efeito de MuLL sobre as atividades enzimáticas detectadas por ensaios in vitro e através de zimografia para proteases Estudo da atividade inseticida do extrato de folhas e MuLL contra S. zeamais Avaliar a toxicidade por ingestão de dieta artificial contendo o extrato de folhas ou MuLL. Determinar o índice de deterrência alimentar para as dietas contendo extrato e lectina. Calcular os parâmetros nutricionais taxa de crescimento relativo, taxa de consumo relativo e eficiência de conversão do alimento ingerido.

53 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Obter extratos de intestino de S. zeamais alimentados ou não com o extrato ou lectina. Determinar as atividades de proteases, tripsina, α-amilase, celulases (endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase) e fosfatases ácidas e alcalinas nos extratos obtidos.

54 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva REFERÊNCIAS ADAMS, E.S.; ATKINSON, L.; BULMER, M.S. Relatedness, recognition errors, and colony fusion in the termite Nasutitermes corniger. Behavioral Ecology and Sociobiology, v. 61, p , ADANE, K.; MOORE, D.; ARCHER, S.A. Preliminary studies on the use of Beauveria bassiana to control Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) in the laboratory. Journal of Stored Products Research, v. 32, p , ADDOR, R.W. Insecticides. In: GODFERY, C.R.A. (ed.). Agrochemicals from natural products. New York: Marcel Dekker Inc., pp AGRIOS, G.N. Plant Pathology. 4 a ed. New York: Academic Press, AIUB, C.A.F. et al. Genotoxic evaluation of the organophosphorous pesticide temephos. Genetic and Molecular Research, v. 1, p , ALBUQUERQUE, A.C. et al. Patogenicidade de Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Metarhizium acridum var. acridum sobre Nasutitermes coxipoensis (Holmgren) (Isoptera: Termitidae). Neotropical Entomology, v. 34, p , ALMEIDA-CORTEZ, J.S. et al. Caatinga. Coleção Biomas do Brasil. 1ª ed. São Paulo: Harbra, ALTO, B.W.; REISKIND, M.H.; LOUNIBOS, L. Size alters susceptibility of vectors to dengue virus infection and dissemination. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 79, p , ANDRADE, J.L. et al. Lectin-induced nitric oxide production. Cellular Immunology, v. 194, p , ANTUNES, L.E.G.; DIONELLO, R.G. Bioecologia de Sitophilus zeamais Motschulsky 1885 (Coleoptera: Curculionidae) Artigo em Hypertexto. Disponível em: < Acesso em: 14/06/2012. AOYAMA, H. et al. Endogenous lectin as a possible regulator of the hydrolysis of physiological substrates by soybean seed acid phosphatase. Phytochemistry, v. 58, p , 2001.

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72 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva ARTIGO 1 Termiticidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva against Nasutitermes corniger and its mechanisms ARTIGO PUBLICADO NO PERIÓDICO International Biodeterioration and Biodegradation (Volume 65, Issue 1, p , 2011) Fator de Impacto: (JCR-2010)

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81 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva ARTIGO 2 Effect of Myracrodruon urundeuva leaf lectin on survival and digestive enzymes of Aedes aegypti larvae ARTIGO PUBLICADO NO PERIÓDICO Parasitology Research Fator de Impacto: (JCR-2010)

82 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 81

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90 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva ARTIGO 3 Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil, Sitophilus zeamais (Coleoptera, Curculionidae) ARTIGO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology Fator de Impacto: (JCR-2010)

91 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil, Sitophilus zeamais (Coleoptera, Curculionidae) Thiago Henrique Napoleão a, Bernardo do Rego Belmonte a, Emmanuel Viana Pontual a, Lidiane Pereira de Albuquerque a, Roberto Araújo Sá b, Laura Mesquita Paiva c, Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho a, Patrícia Maria Guedes Paiva a,* a Departamento de Bioquímica-CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, , Recife, Pernambuco, Brasil. b Centro Acadêmico do Agreste, Universidade Federal de Pernambuco, Nova Caruaru, , Caruaru, Pernambuco, Brasil. c Departamento de Micologia-CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, , Recife, Pernambuco, Brasil. *Corresponding author. Tel: ; fax: address: ppaivaufpe@yahoo.com.br

92 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva ABSTRACT This work reports the effects of diets containing Myracrodruon urundeuva leaf extract ( mg/g) and lectin (MuLL; mg/g) on survival, feeding, and nutrition of storage pest Sitophilus zeamais. Digestive enzyme activities of gut extracts from insects reared on extract (25 mg/g) or MuLL (15 mg/g) diets were also evaluated. Leaf extract induced mortality (LC 50 : 72.4 mg/g) while MuLL (30 to 150 mg/g) exerted strong feeding-deterrence. Extract and MuLL promoted loss of biomass, as reflected in the negative values for relative growth rates and efficiencies in conversion of ingested food. Protease, trypsin-like, acid phosphatase and amylase activities from insects reared on extract or MuLL diet were significantly (p<0.05) lower than in control insects. Ingestion of MuLL also reduced significantly (p<0.05) endoglucanase and alkaline phosphatase activities. In conclusion, leaf extract and MuLL have potential for S. zeamais control by killing adults and preventing the use of a food source, respectively. Deleterious effects of extract and lectin on S. zeamais may be linked to enzyme inhibition and consequent supression of digestive processes. Keywords: Myacrodruon urundeuva; Sitophilus zeamais; lectin; insecticidal activity; antifeedancy; digestive enzymes.

93 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Introduction Protection of food crops against attack of storage insect pests and pathogens is a major concern for the food industry, farmers, landowners, subsistence smallholders, public health organs and environment agencies. Deterioration, degradation and contamination of grains by insects and fungi during storage lead to loss of several billion dollars, affect food security and have a great ecological impact since energy, land, water and non-renewable resources were used for production of grains that will never be consumed (FAO, 2009). The weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera, Curculionidae) is a cosmopolitan insect pest of maize (Zea mays) being also able to attack sorghum, rice and wheat as well as processed food products like pasta and biscuits (Fazolin et al., 2010). S. zeamais, together with other storage insect pests, cause an estimated 20 30% loss of maize and the damaged grains have reduced nutritional value and weight, low percentage germination and low market value (Yuya et al., 2009; Tefera et al., 2011). The maize weevil is able to infest the maize already in the field (Giles and Ashman, 1971). Populations of S. zeamais have developed moderate to high levels of resistance to chemical synthetic insecticides such as lindane and malathion in Mexico (Perez-Mendoza, 1999) although it is considered that the resistance levels to organophosphates in Brazil are still low (Pereira et al., 2009). However, an increase in the levels of resistance is expected due to the massive use of insecticides mainly fenitrothion (Braga et al., 2011). Enhanced activities of α-amylase, cellulase as well as serine and cysteine proteinase have been associated with mitigation of physiological costs associated with the resistance mechanisms in S. zeamais strains (Araújo et al., 2008; Lopes et al., 2010; Silva et al., 2010a,b). Alternative strategies for control of S. zeamais populations include the use of entomopathogenic fungi, plant extracts, essential oils, seed oils, leaf powders as well as pressurized carbon dioxide and temperature management techniques (Adane et al., 1996; Kehinde and Angela, 2004; Ileleji et al., 2007;

94 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Noomhorm et al., 2009; Ukeh et al., 2009; Yuya et al., 2009; Betancur et al., 2010; Nukenine et al., 2010; Coitinho et al., 2011) Plant lectins (carbohydrate-binding proteins) are biodegradable insecticidal agents against insects from several orders with socio-economic importance (Lam and Ng, 2011; Paiva et al., 2011). Plant lectins promoted deleterious effects on survival, growth, oviposition and reproduction of insect storage pests such as the moths Anagasta kuehniella and Corcyra cephalonica and the weevils Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus (Zhu- Salzman et al., 1998; Macedo et al., 2002; Sadeghi et al., 2006; Coelho et al., 2007; Macedo et al., 2007; Oliveira et al., 2011). The mechanisms by which lectins kill insects have been studied and can involve the interaction with glycoconjugates along the digestive tract, resistance to proteolysis, and binding to digestive enzymes. These effects may result in morphological damages at digestive tract, disruption of gut epithelium and peritrophic matrix, and inhibition or stimulation of enzyme activities promoting metabolic imbalance and impairing nutrition and feeding behavior (Zhu-Salzman et al., 1998; Carlini and Grossi-de-Sá, 2002; Sauvion et al., 2004; Macedo et al., 2007; Coelho et al., 2009; Napoleão et al., 2012). Myracrodruon urundeuva (Anacardiaceae) is a tree broadly distributed in Brazil, popularly known as aroeira-do-sertão or urundel. The chitin-binding lectin isolated from M. urundeuva leaf (MuLL) showed insecticidal activity against termite Nasutitermes corniger (Isoptera) and larvae of Aedes aegypti (Diptera), the dengue mosquito vector. The insecticidal mechanisms of MuLL were investigated and the authors reported that the lectin was resistant to degradation by proteases from gut of N. corniger and A. aegypti, were able to kill symbiotic bacteria found at N. corniger gut and was able to stimulate α-amylase activity and inhibit protease and trypsin-like enzymes from gut of A. aegypti larvae. In addition, it was suggested that chitin-binding property of MuLL allows its interaction with the peritrophic matrix of both insects (Napoleão et al., 2011, 2012).

95 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva This work evaluated the potential of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) in affect the survival and feeding of S. zeamais adults when incorporated into an artificial diet. Also, their effects on nutritional (relative consumption rate, relative growth rate, and efficiency in conversion of ingested food) and biochemical (gut protease, trypsin-like, α- amylase, cellulase and phosphatase activities) parameters were determined. 2. Materials and methods 2.1. Plant material Leaves of M. urundeuva (Engl.) Fr. All. (Family Anacardiaceae) were collected in the State of Maranhão, northeastern Brazil. A voucher specimen (identified by Mr. Gonçalo Mendes da Conceição) is deposited under number 054 at the Herbarium Aluisio Bittencourt, Centro de Estudos Superiores de Caxias, Universidade Estadual do Maranhão, Brazil. The leaves were dried for 7 days (27 ± 2 C; relative humidity of 70 ± 5%), powdered, passed through 40 mesh screen, and stored at 28 ºC Insects S. zeamais adults were obtained from colonies maintained at the Departamento de Micologia from Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brazil, and reared in the Laboratório de Glicoproteínas, Departamento de Bioquímica from the same university. The colonies were maintained at 28 ± 2 C in glass containers (1 L capacity) sealed with thin TNT-type tissue to permit aeration. The diet consisted of maize grains (100 g per container), selected according to integrity, sanity, size, and absence of contamination with other insects.

96 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Chemicals Asialofetuin, Avicel, azocasein, N-benzoyl-DL-arginyl-ρ-nitroanilide (BApNA), bovine serum albumin, carboxymethylcellulose, chitin powder from shrimp shells, 3,5- dinitrosalicylic acid (DNS), D(+)-glucose, glutaraldehyde, ρ-nitrophenyl-β-dglucopyranoside, ρ-nitrophenyl phosphate, ρ-nitrophenol, sodium bicarbonate, trichloroacetic acid and Trishydroximethylaminomethane (Tris) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetic acid, ammonium sulphate, chloridric acid, dibasic sodium phosphate, monobasic sodium phosphate, and sodium chloride were purchased from Vetec (Rio de Janeiro, Brazil). Calcium chloride, sodium acetate, sodium hydroxide, soluble starch, and Triton X-100 were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). All reagents were of analytical grade Isolation of MuLL MuLL was isolated according to the procedure described by Napoleão et al. (2011). Powdered leaves (10 g) were suspended in 0.15 M NaCl (100 ml) and the mixture was homogenized in a magnetic stirrer (16 h at 4 ºC), filtered through gauze (Cremer, Blumenau, Brazil) and centrifuged (3,000 g, 15 min). Next, the supernatant (leaf extract) was treated with ammonium sulphate (60-80% saturation) and the precipitated protein fraction was chromatographed on chitin column. MuLL was eluted with 1.0 M acetic acid and dialyzed (10-kDa cut-off membrane; Sigma-Aldrich, USA) against four changes of distilled water every 2 h using a volume of 2 L for dialysis fluid Protein content Protein concentration was determined according to Lowry et al. (1951) using bovine serum albumin ( µg/ml) as standard.

97 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Hemagglutinating activity Hemagglutinating assay was carried out in microtiter plates (TPP-Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland) according to Paiva and Coelho (1992) by incubating 50- µl samples with 2.5% (v/v) suspension of human O-type erythrocytes treated with glutaraldehyde for 30 min (Bing et al., 1967). One hemagglutinating unit (titer -1 ) was defined as the reciprocal of the highest dilution of the sample promoting full agglutination of erythrocytes. Specific hemagglutinating activity (unit mg -1 ) was defined as the ratio titer to protein concentration (mg/ml). HA inhibitory assay was performed by incubation (45 min) of lectin sample with 0.5 mg/ml asialofetuin solution before erythrocyte suspension addition (Napoleão et al., 2011) Flour disk bioassay An adaptation of the method described by Xie et al. (1996) was used to evaluate insecticidal activity. For each assay, it was prepared a suspension of 2.0 g of autoclaved wheat flour (Dona Benta, Bunge Alimentos S.A., Benevides, PA, Brazil) stirred in 5 ml of a solution containing the sample diluted in sterile distilled water. Aliquots of 200 µl of the suspension were measured using a micropipette fitted with a disposable tip that was cut at the narrow end to produce an internal diameter of 2 mm. Five aliquots of 200 µl were placed on a Petri dish (90 mm x 100 mm; PETRIQ, Boeco, Germany) with known weight to form flour disks and left in incubator overnight at 56 C to dry. Next, the dish was weighed again and the mass of the flour disks was determined. Twelve S. zeamais adults with known weight were then transferred to the dish. Each assay was performed in quadruplicate and the tested concentrations of sample in flour disks ranged from 10 to 150 (leaf extract) and 3 to 150 (MuLL) mg/g (mg of protein/g of wheat flour). In controls, only sterile distilled water was

98 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva used. The assays were maintained at 28 ± 2 ºC in darkness during 7 days. After this period, the mortality rate as well as the weights of broken flour disks and insects were recorded Feeding-deterrence and nutritional indices The feeding-deterrence index (FDI) was calculated as: FDI (%) = 100 x (A B)/(A), where A is the mass of food ingested by insects in control assay and B is the mass of food ingested by insects in sample assay (Isman et al., 1990). According to the FDI, the sample was classified as having promoted: no feeding deterrence (FDI < 20%), weak feeding deterrence (50% > FDI 20%), moderate feeding deterrence (70% > FDI 50%) or strong feeding deterrence (FDI 70%) (Liu et al., 2007). The data recorded at the end of the insecticidal assay were also used to calculate the following nutritional indices (Xie et al., 1996): (a) Relative consumption rate = C/(D days), where C is mass of ingested food in mg and D corresponds to the initial insect biomass in mg; (b) Relative growth rate = E/(D days), where E corresponds to the biomass gained in mg; (c) Efficiency of conversion of ingested food = E/(C 100) Gut preparations from S. zeamais Groups of fifty S. zeamais adults reared for 7 days on artificial diet containing leaf extract (25 mg/g), MuLL (15 mg/g) or distilled water (control) were collected and immobilized by placing them at -20 ºC for 10 min. The gut of each insect was hand-dissected and immediately homogenized with 1 ml of Tris buffer (0.1 M Tris-HCl ph 8.0 containing 0.02 M CaCl 2 and 0.15 M NaCl), acetate buffer (0.1 M sodium acetate ph 5.5 containing 0.02 M CaCl 2 and 0.15 M NaCl) or sodium phosphate buffer (0.02 M sodium phosphate ph 7.0 containing 0.15 M NaCl) using a 3 ml tissue grinder (Pyrex, Corning Inc., NY, USA). The

99 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva homogenates were centrifuged at 9,000 g at 4 C during 15 min. The supernatants (gut extracts) were collected and evaluated for protein concentration and enzyme activities Enzyme assays Total protease activity Total protease activity of gut extract in Tris buffer was determined using azocasein as substrate according to Azeez et al. (2007). Gut extract (50 µl; 350 µg of protein) was mixed with 300 µl of 0.1 M sodium phosphate ph 7.5 containing 50 µl of 0.6% (w/v) azocasein. The mixture was supplemented with 100 µl of 0.1% (v/v) Triton X-100 and incubated at 37 ºC for 3 h. The reaction was stopped by adding 200 µl of 10% (v/v) trichloroacetic acid and the assay was incubated at 4 ºC for 30 min. Next, it was centrifuged at 9,000 g for 10 min and the absorbance of the supernatant at 366 nm was determined using a spectrophotometer (GeneQuant TM 1300, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA). One unit of protease activity was defined as the amount of enzyme that gave an increase of 0.01 in absorbance Trypsin-like activity The presence of trypsin activity in gut extract in Tris buffer was determined in 96-well microtiter plates (TPP-Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland) using the synthetic substrate BApNA as described by Kakade et al. (1969). Gut extract (30 µl, 220 µg of protein) was incubated (30 min, 37 ºC) with 8 mm BApNA (15 µl) in Tris buffer (55 µl). Enzyme activity was evaluated by measurement of absorbance at 405 nm using a microplate reader (µquant MX200, BioTek Instruments, Inc., VT, USA). One unit of trypsin-like activity was

100 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 µmol of BApNA per minute under the established conditions. Assays were performed in quadruplicate Acid and alkaline phosphatase activities The activity of phosphatases was determined according to an adaptation of the method developed by Asakura (1978) described by Koodalingam et al. (2011). Gut extract in sodium phosphate buffer (50 µl; 300 µg of protein) was mixed with 450 µl of 0.05 M sodium acetate buffer ph 4.0 (for determination of acid phosphatase activity) or 0.05 M Tris-HCl ph 8.0 (for alkaline phosphatase activity). Next, 500 µl of 12.5 mm ρ-nitrophenyl phosphate prepared in acetate or Tris buffer was added to the mixtures. After incubation for 15 min at 37 C in water bath apparatus (500/1D model, Nova Ética, SP, Brazil), the enzyme reaction was stopped by adding 100 µl of 0.5 M sodium hydroxide and centrifugation (4000 g; 5 min) ensued. The absorbance at 410 nm of the supernatants was then recorded using spectrophotometer. The amount of ρ-nitrophenol (ρnp) released by hydrolysis of substrate was determined using the standard curve Y=0.0013X , where Y is the absorbance at 410 nm and X is the ρnp concentration in mg/ml. One unit of acid or alkaline phosphatase activity was defined as the amount of enzyme required to generate 1 µmol of ρ-nitrophenol per minute. Assays were performed in triplicate Cellulase activities Endoglucanase and exoglucanase activities Assays for endoglucanase and exoglucanase were carried out according to adaptations of the methods described by Li et al. (2009) and Wood and Bhat (1988), respectively. The reactions started by incubating (50 C, 10 min) gut extract in acetate buffer (100 µl; 600 µg

101 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva of protein) with 400 µl of a 1% (w/v) carboxymethylcellulose (for endoglucanase activity) or 1% (w/v) Avicel (for exoglucanase activity) solutions in sodium acetate ph 5.5 containing 0.15 M NaCl. After incubation, 500 µl of DNS were added to stop the reaction and the mixtures were heated (100 ºC) for 6 min and immediately cooled on ice (15 min). Then, the absorbance at 540 nm was measured using spectrophotometer. The amount of reducing sugars was determined using glucose as standard (Y=0.1261X ; Y is the absorbance at 540 nm; X is the glucose concentration in mg/ml). One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme required to generate 1 µmol of glucose per minute. Blanks were performed submitting gut extract to the same reaction steps in absence of substrate β-glucosidase activity An adaptation of the method described by Tan et al. (1987) was used to assess β- glucosidase activity. Gut extract in acetate buffer (50 µl; 400 µg of protein) was incubated (50 C; 10 min) with 400 µl of 0.1 % (w/v) ρ-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside solution in sodium acetate ph 5.5 containing 0.15 M NaCl. After incubation, 500 µl of 10% (w/v) sodium bicarbonate were added to stop the reaction and the absorbance at 410 nm from 200 µl-aliquots of each reaction was measured using a microplate reader. The amount of ρnp released by hydrolysis of the substrate was determined using the standard curve described in section One unit of activity was defined as the amount of enzyme required to generate 1 µmol of ρnp per minute. Reaction blanks were performed without substrate α-amylase activity The assay was carried out based on the method described by Bernfeld (1955). Gut extract in acetate buffer (100 µl; 600 µg of protein) was incubated at 50 C for 10 min with 400 µl of a 1% (w/v) soluble starch solution in 0.1 M sodium acetate ph 5.5 containing 0.02

102 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva M CaCl 2 and 0.15 M NaCl. The reaction was stopped by adding 500 µl of DNS. Next, the assays were heated at 100 ºC in boiling water for 6 min and immediately cooled on ice for 15 min. The absorbance was measured at 540 nm using spectrophotometer and the amount of reducing sugars was determined calculated using the standard curve of the reaction between glucose and DNS presented in section One unit of α-amylase activity was defined as the amount of enzyme required to generate 1 µmol of glucose per minute. Reaction blanks were performed without starch. Assays were performed in triplicate Statistical analysis Standard deviations (SD) were calculated using GraphPad Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA) and data were expressed as a mean of replicates ± SD. Significant differences between treatment groups were analyzed by Student s t-test (significance at p<0.05) using the Origin 6.0 program. The lethal concentration required to kill 50% (LC 50 ) of insects in 7 days was calculated by probit analysis with a reliability interval of 95% using the computer software StatPlus 2006 (AnalystSoft, Canada). 3. Results and discussion M. urundeuva leaf extract induced the mortality of S. zeamais adults in a dosedependent manner (Table 1) and the LC 50 was 72.4 mg/g for 7 days. Leaf extract at 10 mg/g promoted 14.3% mortality rate, being more active than a cinnamaldehyde from Cinnamomum aromaticum bark, which promoted 12% mortality of S. zeamais adults at 13.6 mg/g (Huang and Ho, 1998). Triterpenes and derivatives from Junellia aspera promoted slight mortality ( %) of S. oryzae adults after 5 days when incorporated into wheat flour disks at 400

103 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva µg/disk (which corresponded to approximately 5.2 mg/g) but after 10 days the mortality rates ranged from 47.1% to 100% (Pungitore et al., 2005). Leaf extract also exerted feeding-deterrent activity (Figure 1A), with the effects varying from weak (10 mg/g) to moderate (25, 50, 100, and 150 mg/g). However, although the feeding-deterrent activities of the extract from 25 to 150 mg/g were similar, the mortality rates in 100 and 150 mg/g treatments were significantly (p<0.05) higher (Table 1). These results indicate that death of insects was not only a consequence of a moderate starvation condition but was also linked to ingestion of toxic component(s) present in extract. Aiming to determine if MuLL would be the component of leaf extract which promotes deleterious effects on S. zeamais, the lectin (specific hemagglutinating activity of 16,384) was incorporated into artificial diet offered to the insects during 7 days. Unlike the leaf extract, MuLL did not induce significantly (p>0.05) the mortality of S. zeamais in this period (Table 1). On the other hand, antifeedant effect of MuLL was greater than that of leaf extract. The data in Figure 1B show that MuLL had moderate feeding-deterrent activity at the lowest concentrations evaluated (3 and 15 mg/g) and strong at all others ( mg/g). Insects which had contact with highest content of MuLL (150 mg/g) ingested a small amount of food, with a FDI of 91%. Since no mortality was detected after 7 days, the high FDI values are linked to rejection of diet containing the isolated lectin and cannot be also due to decreasing in the number of live insects. In this way, an acute toxicity of MuLL cannot be observed because the insects avoided ingesting it. The feeding-deterrent activity of leaf extract may be related to MuLL presence at a level sufficient to exert a moderate effect. To our knowledge, this is the first report of lectin effect on S. zeamais but feedingdeterrent activity of lectins has been documented. The Galanthus nivalis and wheat germ agglutinins exerted strong feeding-deterrent effects on adults of Nilaparvata lugens and larvae of Lucilia cuprina, respectively (Powell et al., 1995; Felton and Gatehouse, 1996). The lectin

104 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva from Canavalia ensiformis (Con A) also caused a rejection effect on Acyrthosiphon pisum (Sauvion et al., 2004). Alteration in feeding behavior of insects by lectins may be a consequence of a process mediated by gustatory sensilla (preingestional effect) or may be due to intoxication (postingestional effect), which is probably associated to binding of lectin to insect digestive tract and involves different aspects of digestion and absorption (Sauvion et al., 2004; Michiels et al., 2010; Sprawka and Goławska, 2010). Death of all insects in MuLL treatments was observed after days. A 100% mortality rate of insects mantained in absence of diet was detected after 10 days, which was close to the period that insects reared on MuLL diet were able to withstand. In controls, mortality rate after 11 days was only 23 ± 5.7%. Indeed, it is described that S. zeamais adults are able to survive for a long starvation period of 11 days (Maceljski and Korunić, 1973). The insects reared on diet containing MuLL did not die after 7 days even if they had eaten little. According to Park et al. (2009), ingestion of a minimal food amount or no feeding activity lead insects to a starvation stress impairing their behavior, physiology, development, reproduction and survival. The physiological costs of starvation are usually associated with alterations in the rates of lipid, protein and carbohydrate metabolism, leading to decrease in the efficiency with which food is converted to biomass. It has been reported that the ingestion of plant extracts and lectins can disturb digestion and absorption of nutrients by insects (Paiva et al., 2012). In this sense, nutritional and biochemical parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets were determined aiming to evaluate whether the ingestion of leaf extract and MuLL resulted in a physiological imbalance. The deleterious effects of leaf extract on S. zeamais were also reflected on nutritional parameters. Increase of extract concentration in diet was accompanied by significantly (p<0.05) decreasing in the relative consumption rate (Figure 2A). In the control treatment, the

105 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva insects consumed an average of 0.63 mg of diet per mg of body weight every day. In treatment with leaf extract at 150 mg/g, this value was only 0.05 mg/mg/day. The values of relative comsuption rates of insects reared on diet containing MuLL were on average 4.75 times lower than that determined in control (Figure 3A), which was probably a result of the strong feeding-deterrent activity of lectin. The decrease in consumption by insects in the leaf extract and MuLL treatments was probably due to the feeding-deterrent activity of lectin. Also, the death of insects promoted by leaf extract during the assay certainly led to decrease of relative consumption rates. The relative growth rate in treatments with the extract at 25 mg/g was significantly (p<0.05) lower than in control treatment (Figure 2B). However, negative values were detected in treatments at highest concentrations (Figure 2B), revealing that the insects presented not only decrease in weight gain but that they lost biomass. In treatments with MuLL, the mean relative growth rates were also negative, probably as a consequence of the absence of adequate feeding activity of insects (Figure 3B). A possible explanation for these results is that leaf extract and MuLL impaired digestion and absorption process at a high level so that the insects started to metabolize their body reserves to survive at all cost. The efficiency in conversion of ingested food in control was 2.15%, similar to that detected in treatment with leaf extract at 10 mg/g (Figure 2C). This parameter decreased to 0.38% in treatment with 25 mg/g, evidencing an initial difficult of insects to incorporate the diet nutrients. At treatments with extract from 50 to 150 mg/g, the values were negative ranging from -2% to -44%, revealing that the insects have failed to incorporate the diet and that the amount of food ingested was not sufficient to compensate deleterious effects of extract, resulting in loss of biomass. The efficiency in conversion of ingested food in treatments with MuLL was also negative, reaching values of -23% and -32% in treatements at 75 and 150 mg/g, respectively (Figure 3C), demonstrating that incorporation of MuLL into

106 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva insect diet led to imbalance of insect physiology and growth. Lectins have been reported to disturb the incorporation of food when added to the diet of other storage insect pests. Decreases by 16.8% and 31.2% in the efficiency in conversion of ingested food were detected when A. kuehniella larvae were reared on diets containing lectins from seeds of Annona coriacea and Moringa oleifera, respectively (Coelho et al., 2007; Oliveira et al., 2011). Aiming to evaluate the effects of leaf extract and MuLL in S. zeamais metabolism, enzyme activities were determined in gut extracts from insects fed or not on diets that promoted moderate antifeedant effect. Table 2 shows that extracts from control group presented protease, trypsin-like, α-amylase activities higher than those in gut extracts from insect reared on diet containing leaf extract. The study also demonstrated that cellulase (endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase) activities were not affected by leaf extract while acid and alkaline phosphatases were not detected (Table 2). MuLL reduced significantly (p<0.05) protease, trypsin-like, alkaline phosphatase, endoglucanase and α-amylase activities (Table 2). Exoglucanase and β-glucosidase activities were not significantly (p>0.05) different from those determined in gut extracts from control group while acid phosphatase activity was not detected in insects that fed on MuLL diet (Table 2). The results reveal that enzymes involved in protein metabolism were more sensitive than those related to carbohydrate digestion. Previous study showed that MuLL was able to inhibit the trypsin-like activity from gut of A. aegypti larvae (Napoleão et al., 2012). The inhibitory effects of leaf extract and MuLL on digestive enzymes probably resulted in shortening or suppressing of digestion processes contributing to the nutritional disturbances detected. Also, the inhibition of digestive enzyme activities may be a mechanism by which MuLL causes an intoxication resulting in feeding deterrence. Ishaaya et al. (1974) reported that the antifeedant effect of the compound 4 -(3,3-dimethyl-1-triazeno) acetanilide on Spodoptera littoralis larvae was correlated with inhibitory effect on amylase and protease

107 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva activities. Zhou et al. (2011) suggested that inhibition of digestive enzyme activities is involved in feeding-deterrent effect of the Xanthium sibiricum sterols against Pieris rapae (Lepidoptera) larvae. In seeds, it has been reported the presence of protease and amylase inhibitors active against enzymes from insect midgut naturally act as feeding deterrents (Sánchez-Hernández et al., 2004). In summary, M. urundeuva leaf extract is a source of insecticide compounds that act by killing S. zeamais adults through ingestion and promotion of nutritional disturbance. MuLL has potential for use in maize weevil control by preventing that these insects enjoy a food source and by leading the insects to starve until death. This work opens windows to new studies focusing on identification of toxic components of leaf extract, toxicity of extract and lectin on non-target species, and insecticide formulas. Acknowledgments The authors express their gratitude to the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and fellowship (LCBBC and PMGP). We are also grateful to the Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) for financial support (PMGP). T.H. Napoleão and E.V. Pontual would like to thank CAPES and FACEPE for graduate scholarships, respectively. L.P. Albuquerque would like to CAPES and the Brazilian Ministry of Education (Programa de Reestruturação e Expansão das Universidades Federais REUNI) for graduate scholarship. B.R. Belmonte would like to thank FACEPE and CNPq for Scientific Initiation scholarship. The authors are also deeply grateful to Maria Barbosa Reis da Silva for the technical assistance.

108 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva References Adane, K., Moore, D., Archer, S.A., Preliminary studies on the use of Beauveria bassiana to control Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) in the laboratory. J. Stored Prod. Res. 32, Araújo, R.A., Guedes, R.N.C., Oliveira, M.G.A., Ferreira, G.H., Enhanced proteolytic and cellulolytic activity in insecticide-resistant strains of the maize weevil, Sitophilus zeamais. J. Stored Prod. Res. 44, Asakura, K., Phosphatase activity in the larva of the euryhaline mosquito, Aedes togoi Theobold, with special reference to sea water adaptation. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 31, Azeez, A., Sane, A.P., Bhatnagar, D., Nath, P., 2007 Enhanced expression of serine proteases during floral senescence in Gladiolus. Phytochemistry 68, Bernfeld, P., Amylases, α and β. Meth. Enzymol. 1, Betancur, R.J., Silva, A.G., Rodríguez, M.J.C., Fischer, G.S., Zapata, S.M.N., Insecticidal activity of Peumus boldus Molina essential oil against Sitophilus zeamais Motschulsky. Chilean J. Agric. Res. 70, Bing, D.H., Weyand, J.G.M., Stavistsky, A.B., Hemegglutination with aldehyde-fixed erythrocytes for assay of antigens and antibodies. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 124, Braga, L.S., Corrêa, A.S., Pereira, E.J.G., Guedes, R.N.C., Face or flee? Fenitrothion resistance and behavioral response in populations of the maize weevil, Sitophilus zeamais. J. Stored Prod. Res. 47, Carlini, C.R., Grossi-de-Sá, M.F., Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potential as bioinsecticides. Toxicon 40,

109 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Coelho, J.S., Santos, N.D.L., Napoleão, T.H., Gomes, F.S., Ferreira, R.S., Zingali, R.B., Coelho, L.C.B.B., Leite, S.P., Navarro, D.M.A.F., Paiva, P.M.G., Effect of Moringa oleifera lectin on development and mortality of Aedes aegypti larvae. Chemosphere 77, Coelho, M.B., Marangoni, S., Macedo, M.L.R., Insecticidal action of Annona coriacea lectin against the flour moth Anagasta kuehniella and the rice moth Corcyra cephalonica (Lepidoptera: Pyralidae). Comp. Biochem. Physiol C 146, Coitinho, R.L.B.C., Oliveira, J.V., Gondim Junior, M.G.C., Câmara, C.A.G., Toxicidade por fumigação, contato e ingestão de óleos essenciais para Sitophilus zeamais Motschulsky, 1885 (Coleoptera: Curculionidae). Ciênc. Agrotec. 35, FAO, Post-harvest losses aggravate hunger. FAO Media Centre. Available in: Fazolin, M., da Costa, C.R., Damaceno, J.E.O., de Albuquerque, E.S., Cavalcante, A.S.S., Estrela, J.L.V., Fumigação de milho para o controle do gorgulho utilizando caule de Tanaecium nocturnum (Bignoniaceae). Pesq. Agropec. Bras. 45, 1-6. Felton, G.W., Gatehouse, J.A., Antinutritive plant defence mechanisms. In: Lehane, M.J., Billingsley, P.F. (Eds.) Biology of the Insect Midgut. Chapman and Hall, London, pp Giles, P.H., Ashman, F., A study of pre-harvest infestation of maize by Sitophilus zeamais Motsch. (Coleoptera, Curculionidae) in the Kenya highlands. J. Stored Prod. Res. 7, Huang, Y., Ho, S.H., Toxicity and antifeedant activities of Cinnamaldehyde against the grains storage insects, Tribolium castaneum (Herbst) and Sitophilus zeamais Motsch. J. Stored Prod. Res. 34,

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116 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Table 1. Survival rates of S. zeamais adults reared for 7 days on diets containing M. urundeuva leaf extract or MuLL. Sample concentration (mg/g of wheat flour) Mortality rate (%) after 7 days Leaf extract ± 4.0 a ± 10.0 b ± 7.0 b ± 8.2 c ± 8.1 d Control 10.3 ± 6.0 e MuLL ± 2.1 A ± 2.0 A ± 2.4 A ± 2.7 A ± 2.8 A ± 2.1 A Control 5.0 ± 2.0 A Control treatments contained only wheat flour. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.

117 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Table 2. Digestive enzyme activities in gut extracts from S. zeamais adults reared on diets consisting on wheat flour disks containing M. urundeuva leaf extract or MuLL. Enzyme Treatment groups Control Leaf extract MuLL Protease (U/mg) 19.5 ± 1.4 a 0.1 ± 0.0 b 5.9 ± 0.8 c Trypsin-like (mu/mg) 0.4 ± 0.01 a 0.12 ± 0.01 b 0.18 ± 0.0 c Acid phosphatase (mu/mg) 89 ± 7.2 a 0.0 b 0.0 b Alkaline phosphatase (mu/mg) 105 ± 5.4 a 0.0 b 15.7 ± 0.9 c Endoglucanase (U/mg) 3.4 ± 0.1 a 3.4 ± 0.08 a 2.7 ± 0.16 b Exoglucanase (U/mg) 4.6 ± 0.2 a 5.1 ± 0.6 a 5.0 ± 0.2 a β-glucosidase (U/mg) 0.8 ± 0.04 a 0.9 ± 0.2 a 0.74 ± 0.1 a α-amylase (U/mg) 3.1 ± 0.05 a 2.4 ± 0.02 b 1.95 ± 0.0 c Control treatments contained only wheat flour. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments. Each value correponds to the mean ± SD of four replicates.

118 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S. zeamais adults by determination of feeding-deterrence indices. The insects were reared on artificial diet consisting on wheat flour disks containing leaf extract at 10 to 150 mg of protein per g of wheat flour (A) and MuLL at 3 to 150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.

119 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Fig. 2. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in wheat flour disks (control) or M. urundeuva leaf extract (10 to 150 mg of protein per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.

120 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Fig. 3. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in wheat flour disks (control) or MuLL (3 to 150 mg per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.

121 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva CONCLUSÕES Uma nova lectina ligadora de quitina, denominada MuLL, foi isolada da folha de M. urundeuva. MuLL é um polipeptídeo glicosilado catiônico de massa molecular 14,2 kda. MuLL é uma lectina resistente a amplas variações de temperatura e ph, cuja atividade hemaglutinante é inibida por glicoproteínas. MuLL foi capaz de reconhecer o monossacarídeo N-acetilglicosamina imobilizado em agarose. MuBL e MuLL apresentaram atividade inseticida sobre operários e soldados de N. corniger. MuLL promoveu mortalidade de larvas L4 de A. aegypti, constituindo uma nova alternativa biodegradável a ser considerada no controle deste mosquito vetor. O extrato de folhas de M. urundeuva foi tóxico quando ingerido por adultos de S. zeamais, constituindo uma potencial fonte de agentes inseticidas para controle deste inseto. A toxicidade do extrato de folhas pode estar ligados a efeitos inibitórios sobre a atividade de enzimas digestivas de S. zeamais. MuLL não promoveu mortalidade de S. zeamais, mas apresentou forte efeito deterrente de alimentação, apresentando potencial uso para controle deste inseto ao impedir que os adultos aproveitem uma determinada fonte de alimento. Este é o primeiro relato do efeito de lectinas sobre o gorgulho do milho. A presente Tese contribui para o estado da arte no estudo da atividade inseticida de lectinas, ao indicar como mecanismos da ação inseticida: 1. Resistência de MuBL, MuHL e MuLL à proteólise por enzimas digestivas de N. corniger e efeito antibacteriano sobre bactérias simbiontes do trato intestinal desses insetos.

122 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva Resistência de MuLL à proteólise por enzimas de larvas de A. aegypti e modulação das atividades de proteases, tripsina e α-amilase no intestino das larvas. 3. Supressão dos processos digestivos e distúrbios nutricionais em S. zeamais devido a inibição de enzimas digestivas do inseto.

123 Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva ANEXO Insecticide Activity of Lectins and Secondary Metabolites CAPÍTULO PUBLICADO NO LIVRO: Editora: InTech, Rijeka Croácia ISBN: doi: /2447

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