Formação de Imagens, Fotomultiplicadores, Detectores Espectrais e. CCDs

Transcrição

1 Formação de Imagens, Fotomultiplicadores, Detectores Espectrais e CCDs

2 A microscopia confocal emprega luz entre UV e IR e baseia-se na varredura da amostra ponto a ponto.

3 Princípio da microscopia confocal

4 A microscopia por varredura de feixe é um processo essencialmente seqüencial e digital. Iluminando-se um ponto por vez, o microscópio confocal ganha um aumento de intensidade enorme quando comparado ao de campoaberto.

5 O microscópio confocal varre o ponto (ou a amostra) sobre uma área (tela) quadrada. No exemplo a tela ou matriz é de 16x16 onde cada quadrado individual é denominado pixel (picture element). Figura: Um microscópio de varredura gera uma imagem pelo movimento de um ponto de laser sobre (PIXEL) numa matriz. Esta matriz de 16x16 pixels é muito grosseira e produz uma imagem 'boxed' e "pixelada". Imagens são mais comumente obtidas em matrizes de 256 x 256 e 512 x 512.

6 Formação de Imagens Num sistema de 8 bits: 1 byte pode armazenar 2 8 valores inteiros (em um sistema binário poderá ser 0 ou 1) de 0 a 255 (2 8 = 256).

7 Isso implica que a intensidade de luz que será representada por um pixel poderá variar entre 0 e 255 (sem unidades). Esta propriedade intrínseca nos permitirá verificar se uma imagem está ou não saturada. No monitor do computador, 1 pixel (picture element) corresponde a 1 Byte. Portanto, uma imagem de 512 x 512 pixels vai ocupar bytes.

8 PMTs O problema: Fótons no visível têm comprimento de onda l entre 375 e 750 nm (Isso equivale a uma energia entre 1,75 a 3 ev.) Para serem detectados, os fótons tem que interagir com elétrons da área sensível do detector para produzir alterações mensuráveis (que não térmicas) que possam ser convertidas num número proporcional no computador.

9 Fotomultiplicador

10 Parâmetros a serem considerados: 1 EFICIÊNCIA QUÂNTICA (QE, quantum eficiency): fração de fótons que ao atingir a área sensível do detector vão efetivamente contribuir no sinal detectado. QE varia com l. QE de uma câmera cooled CCD pode ser de 50 a 80 %

11 2- Nível de RUÍDO: podem ser componentes aditivos (Dark Current), multiplicativos (fotón a fóton, variações em ganho) e digitalizantes (o processo de digitalização degrada o conteúdo de informação da imagem). Sensibilidade: o equivalente a S/N (signal to noise ratio) : deve ser a maior possível! (maior S/N) 3- Resposta de intensidade linear: O número armazenado na memória deve ser proporcional à Intensidade de LUZ em cada ponto.

12 Gain and offset/bl

13 Hybrid Detectors

14 Trad x Hybrid detectors

15 4- DYNAMIC RANGE: A faixa (range) de intensidades na qual o sinal emitido pelo PMT é linear. Deve ser a maior possível: Nível de Ruído < SINAL < Saturação 5- RESOLUÇÃO ESPACIAL: Habilidade de precisamente registrar todas as freqüências espaciais (padrões estruturais repetitivos ~ resolução ~ 0.2 µm, para objetiva de N.A. 1.4), presentes na imagem.

16 Critério de Amostragem de Nyquist: Quando um sinal analógico é digitalizado, o conteúdo de informação no sinal vai ser mantido só se o diâmetro da área representada da amostra por cada Pixel -> Pixel size, for pelo menos 2.3x menor em dimensões lineares (x, y, z) que o limite de resolução do sistema óptico: R= 0.61 x l/na

17 Para uma boa objetiva de N.A (assumindo-se l = 488 nm) a resolução (Rayleigh) será: R= nm / 2.3 = 90 nm. Portanto o tamanho do pixel de 90 nm será necessário para se obter uma amostragem ideal (de um pixel) do material a ser observado (x/y). Assim, em termos estatísticos, se ajustarmos o 'zoom' eletrônico para um pixel size menor, estaremos 'superamostrando' e para um pixel size menor, "subamostrando".

18 Nestas mesmas condições, a distância entre diferentes planos de amostras (z step) deve ser de no máximo 3x o valor do Pixel size ou seja ~ nm. Em comprimentos de onda maiores, 567 nm ou 649 nm, esse valor aumenta! Vale lembrar aqui, que a resolução axial de um sistema confocal pode ser estimada (aproximadamente) pela equação: Rayleigh: R= 1.77 (1.4) x l /NA 2 = 440 nm R= 1.22 x l / 2NA = 212 nm Portanto, vemos que a resolução axial é aproximadamente 2 e até 3x menor (ou pior) que a resolução lateral num sistema como o nosso.

19 Axial Lateral PSF no Confocal exemplo n = 1 NA = 0.6 PSF WF PSF conf

20 At most, the human eye can distinguish about 50 discrete shades of gray within the intensity range of a video monitor, suggesting that the minimum bit depth of an image should be between 6 and 7 bits. icles/microscopyimaging.html Contraste e profundidade dos bits

21 Efeito da Amostragem Digital: resolução espacial u.edu/primer/java/digi talimaging/processing /samplefrequency/ind ex.html

22 va/digitalimaging/processing/spatialres olution/index.html

23 mer/java/digitalimaging/processi ng/bitdepth/index.html

24 Tabela. Valores de Pixel Size e Z step para satisfazer o critério de amostragem de Nyquist para as objetivas do Microscópio Confocal Leica SP5 TS l Objetiva Pixel Size nm Z step nm Pixel Size nm Z step nm Pixel Size nm Z step nm 10x x 0.70 Oil, água ou glicerol x 1.30 Oil x 1.4 Oil x 1.2 W x 1.44 Oil

25 6- RESOLUÇÃO TEMPORAL: Capacidade de responder a um sinal que muda com o tempo. Infelizmente, quanto mais rapidamente se adquire um sinal, normalmente se aumenta o RUÍDO. 7- LINEARIDADE GEOMÉTRICA: Estabilidade com relação às posicionamento no campo simplifica alinhamento das imagens e normaliza para não-linearidade em intensidade.

26 Sistemas de detecção Espectrais (META) Traditional fluorescence detector Spectral detector Multiple gratings Polarization beam splitter Laser unit Courtesy of Nikon

27 Olympus spectral confocal system

28 Spectral Detection Spectral detection Laser Excitation selection Specimen

29 Leica TCS SP5 - SP Detector 5 true confocal channels simultaneously All dyes: Freely tuneable emission bands Low sample photodamage: high efficiency Intuitive operation Highly selective: no gaps Frexibility: Create any bandpass-filter Up to 5 PMT s individual adjustment

30 Emission Fingerprinting 1: obtém-se uma série - Z

31 2: Determina-se o espectro de cada ROI

32 3: Faz-se a separação (unmixing)

33 Spectral Unmixing - General Concept 32 Channel Detector Collect Lambda Stack Raw Image FITC Sytox-green Courtesy: Duncan McMillan, Carl Zeiss Microimaging Derive Emission Fingerprints Unmixed Image

34 Acousto-Optic Tunable Filters (AOTFs)

35 Acousto-Optic Tunable Filters (AOTFs)

36

37 Irradiação de núcleos de m0s (marcados com Hoechst) com laser 405nm induz apoptose Dr. Fernando Real

38 Digitalização de Imagens: CCDs

39 Efeito da Amostragem Digital: resolução espacial

40 At most, the human eye can distinguish about 50 discrete shades of gray within the intensity range of a video monitor, suggesting that the minimum bit depth of an image should be between 6 and 7 bits. icles/microscopyimaging.html Contraste e profundidade dos bits

41 Digitalização de Imagens: Voxels

42 Digitalização de Imagens: PSF e live-cell

43 CCDs Charged Coupled Devices

44 Construção de um CCD CCD Charged Coupled Devices

45 CCDs- Arquiteturas Full-Frame Interline

46 Binning Serve para combinar a carga de poços (pixels) adjascentes de modo a melhorar S/N Ratio e velocidade de aquisição Binning

47 CCD: Blooming (transbordamento) Blooming

48 EM-CCDs (Electron multiplying CCDs)

49 EM-CCDs (Electron multiplying CCDs)