BIOIMAGIOLOGIA: TRABALHOS PRÁTICOS NO LABº MICROSCOPIA (2.1.15) WF:

Transcrição

1 WF: Mic campo largo (Olympus BX60). Objectivos: Iluminação Kohler; DIC/Contr. fase; Fluorescência; captação de imagem digital Contraste de fase: Começar por ver uma cultura de células em caixa de petri usando um mic invertido de contraste-de-fase. Neste microscópio não há ajustes suficientes no condensador para ajustar a iluminação de Kohler (tal como nos das aulas!). Retirar anéis de contraste de fase do condensador. Ver prep de cultura de cels. É possível ver as células? Re-introduzir tabuleiros dos anéis de CF e remover remover uma das oculares. Olhar para o fundo do tubo e procurar anel claro e escuro. Verificar se têm o mesmo tamanho e se estão centrados. Comparar a imagem com a anterior (sem CF). Olympus BX60: Montar amostra na platina do Olympus BX60. Encontrar celulas em campo claro com lente 20x. Dificil? Experimentar com DIC (Nomarski). Passos: 1 Descobrir algo para focar (se necessário fechar íris de condensador) e mudar condensador para posição vazio, ie sem prismas. 2 Ajustar para iluminação de Kohler: Fechar íris de campo, focar condensador, retirar ocular, abrir íris condensador 80% 3 Meter os polarizador e analisador e ajustar para extinção: remover ocular o procurar linha obliqua negra. Maximizar contraste da linha rodando polarizador 4 Mudar no condensador o Wallaston apropriado para a lente seleccionada 5. Ajustar o compensador (botao tipo parafuso no analisador) para alterar contraste Captar imagem. Retirar polarizador + analisador e prismas e tirar foto. Usar depois nas aulas de análise de imagem para corrigir iluminação, adicionar barra de calibração e optimizar contraste. Mudar para amostra de diatomácias e ver com lente 100x oleo. Captar imagem. Fechar iris da lente e tirar nova imagem. O que acontence qd a NA da lente é reduzida? Mudar para amostra de cels marcadas com flluorescência (desligar luz transmitida e abrir obturador da lampada de mercúrio); Captar imagens das três cores usando os 3 filtros de fluorescência disponíveis. Luz UV incidente produz fluorescencia de q cor? E azul? E verde? Experimentar reduzir a NA da lente e ver efeito na quantidade de luz. Captar imagem e comparar tempo de exposição assim como ruído ( dark noise ). Verificar a diferença entre tempos de exposição longos e curtos; como controlar a saturação? Binning e efeito na sensibilidade e resolução. Captar imagens de: - fluorescência com íris aberta - com íris fechada e mesmo tempo exposição - binning 2x2 e mesmo tempo de exposição - e 1/4 tempo exposição - binning 4x4 Recolher todas as imagens para usar na prática de processamento e análise de imagem e para o trabalho individual de preparação de imagens para publicação.

2 CF: Mic confocal, Leica SPE Objectivos: Ajustes gerais; obtenção de Z stack ; corte XZ; varrimento espectral; Usar amostra de embriões de ouriço-do-mar. Iniciar o sistema; ligar lasers e encontrar amostra. Ajustar detector para comp.onda adequado. Ajustar PMT (Gain e offset) e usar LUTs. Ajustar zoom e box para resolução adequada. Fazer um corte XZ em tempo real. Comparar resolução axial vs lateral. Configurar para pilha Z (Z stack) e adquirir pilha de um embrião completo. Configurar para um varrimento espectral e obter desde nm excitando com o laser 488. Gravar todas as imagens para processar/analisar na prática de análise de imagem. OPT: Opto-tomografo (Optical Projection Tomography) Objectivos: Funcionamento geral do aparelho e principios da técnica. Comparação com outras modalidades de microscopia óptica. Aquisição de projecções de uma amostra. Reconstrução tomográfica,e reconstrução 3D.

3 Lupa estereoscópica de fluorescência automatizada (Zeiss Lumar) Objectivos: Verificar profundidade de campo, campo claro vs campo escuro; aquisição de imagem com múltiplos planos de focagem e time-lapse. Começar montando uma amostra de embriões e abrir software Axiovision, e clicar live para ver imagem em tempo real. Experimentar comandos (camera, stereoscope control etc ) Ajuste da iluminação: Usar ajustes do espelho da base (estativo) para obter campo escuro vs campo claro e diferentes angulos de iluminação em campo claro; captar imagens de: - campo claro iluminação axial (90º) e off axis - campo escuro - epi-iluminação. Teste da profundidade de campo: Ajustar iris da lupa e observar efeito na profundidade de campo. Tirar imagens de: - Embrião com íris aberta - com íris fechada e comparar profundidade de campo. Qual a diferença na profundidade de campo? Qual a diferença na resolução? - Aquisição de imagens de fluorescência - Introduzir o módulo de aquisição multidimensional: adquirir múltiplas imagens de diferentes profundidades com íris totalmente aberta e reconstruir com o extended focus (para reconstruir depois no imagej com extended focus ). Nota que é necessário fazer alinhamento das imagens pois as lupas estereoscópicas não são telecêntricas! Time-lapse: Mudar para amostra de embrião vivo com GFP ou células em petri e configurar o sistema para aquisição de time-lapse ( multidimensional acquisition ). Deixar filmar durante alguns ciclos (30min). Estudar o filme e gravar para a prática de análise de imagem.

4 HS/IV; Câmaras de vídeo high-speed e infravermelhos (térmicos) Objectivos: Obter imagens para analisar nas práticas de análise de imagem. Nesta tarefa os alunos estarão sozinhos. Aqui ficam algumas ideias do tipo de imagens que pretendemos. Câmara vídeo high-speed: Filmar a 600fps e 1200fps (HS) para determinar mais tarde a velocidade e duração de: - soco - piscar-de-olhos - abocanhar. - filmar um tomborilar de dedos para determinar frequência e fazer cimogramas. - outras ideias MTO IMPORTANTE: Não esquecer de filmar uma régua em iguais condições para poder calibrar o software para fazer medições!!! ADVERTÊNCIA: A 600 ou 1200fps em 10 segundos captam-se imagens! Planear bem a captação para não fazer clips longos demais. Câmara térmica (IV): Atenção: Esta câmara foi emprestada para as aulas e custa ~ 8000.MUITO CUIDADO PF! A lente deve ser protegida sempre q não está a ser usada e NUNCA tocar com os dedos! Captar imagem de caras para mais tarde determinar temp média da cara ou diferentes partes da cara (nas aulas de análise de imagem), ou de diferentes pessoas (lado-a-lado). Experimentar tb com diferentes partes do corpo. - Fotografar a mão dentro de 1 saco de plástico transparente. - Fotografar alguém dentro de 1 saco de lixo ( opaco )! - Através de uma placa de acrílico (plexiglass) - Através de vidro - Se o calor é uma forma de radiação pode ser reflectida? Experimentar contra vidro! - Fotografar fantasmas térmicos Conclusões? Outras ideias? Não se esqueçam de copiar as imagens do cartão para um dos vossos PCs ou para o da bancada para usar nas aulas de análise de imagem.

5 Malha para usar na calibração das imagens: cada barra tem 2x20 cm