CROMATINA. Priscila M. M. de Leon. Universidade Federal de Pelotas CDTec - Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biologia Molecular

Transcrição

1 Universidade Federal de Pelotas CDTec - Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biologia Molecular CROMATINA Priscila M. M. de Leon Dra., Médica Veterinária Profa, PNDP Biotecnologia/UFPel

2 Tamanho Vírus: 0,0008µm x 0,3µm RNA viral: 2µm Tamanho Bactéria: 2µm x 1µm DNA circular: 1,6mm Tamanho Célula: 2-10µm Tamanho Núcleo: 6µm diâmetro DNA : 1,8m

3 E. Coli: 2µm de comprimento e 1µm de diâmetro DNA circular de 1.600µm (1,6mm) MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO SÃO MAIS EXTENSAS DO QUE O ESPAÇO A SER PREENCHIDO POR ELAS

4 COMPACTAR!!!!!

5 COMPACTAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO FORMA ORGANIZADA VIABILIZA DE PROCESSOS FUNCIONAIS COMPACTAÇÃO FUNCIONAL DNA + PROTEÍNAS

6 CROMATINA Arranjo nucleoproteico organizado e dinâmico Formado pela interação entre proteínas e DNA

7 CROMATINA PROCARIÓTICA X CROMATINA EUCARIÓTICA

8 CROMATINA PROCARIÓTICA Procariotos: bactérias e arqueas Genomas oraganizados em um nucleoide Cromatina ocupa ¼ do volume celular Sem envoltório, não tem forma fixa nucleoides cilíndricos Volume do nucleoide: 0,5µm³ (1,7 x 0,65µm) Volume DNA genômico livre: 200µm³ COMPACTADO CENTENAS DE VEZES Bactérias e Arqueas estrutura da cromatina

9 NUCLEOIDE E CROMATINA BACTERIANA DNA em solução DNA na célula Forças determinam o dobramento do DNA a cada 150 pb (1º nível de compactação) Interações com proteína definem a formação de alças - Domínios Topológicos (10kb) A estabilidade da alça é mantida pela interação do DNA com proteínas cromatínicas O superenrolamento negativo proporciona um nível adicional de compactação Macrodomínios: dezenas a centenas de domínios topológicos funcionalidade (recombinação e expressão gênica)

10 NUCLEOIDE E CROMATINA BACTERIANA Estrutura do nucleoide bacteriano é dinâmica e varia conforme o estado fisiológico da célula; Fase exponencial de multiplicação: nucleoide com grande número de domínios topológicos e DNA superenrolado negativamente; Fase estacionária: nucleoide com numero menor de domínios e estrutura mais relaxada (nemor superenrolamento) Proteínas associadas ao nucleoide (NAPs): responsável pela estruturação do nucleoide. Ponte DNA + Proteína + DNA Grau de compactação resulta do somatório de várias NAPs 6 principais: Dps/MrgA; Fis; IHF; H-NS; HU e SMC/MukB

11 Fase exponencial de multiplicação Fase estacionária de multiplicação Genes altamente transcritos estão próximos

12 NAP: Proteínas associadas ao nucleoide Se ligam ao DNA e são responsáveis pela estruturação do nucleoide

13 A Dobramento e formação de nodo B Dobras induzidas por HU ou IHF C Filamentos super-helicoidais formados por HU D Interligação de DNA mediada por H-NS E Entrelaçamentos de DNA através de SMC/MukB F Enrolamento e interligação mediadas pela Lrp G Dodecâmenros (esferas) associados em estrutura de 3 camadas Todas as NAPs compactam o DNA Grau de compactação é resultado da atividade de várias NAPs Sobreposição de função das NAPs: estrutura da cromatina é mantida mesmo na ausência de alguma NAP.

14 NAPs Função: compatação global do nucleoide, formação de determinadas estruturas da cromatina bacteriana, e definição do grau de superenrolamento do DNA. Compactação da cromatina: Dps, MrgA, Fis, IHF, H-NS, HU e SMC/Mukb Estabilidade das alças: H-NS, Lrp e SMC/Mukb Definição do ápice da alça: Fis, IHF e HU Grau de superenrolamento: SMC/MukB e H/NS

15 Padrões de expressão diferencial de algumas NAPs, em função do andamento do processo de multiplicação de E. coli: diferentes proteínas dobram e interligam o DNA modulando o nucleoide em cada fase Expressão gênica regulada por NAPs, tipos: Indireta: alteração no grau de supertorção de uma alça afeta positiva ou negativamente a transcrição Direta: algumas NAPs podem se ligar a regiões reguladores e ativar ou reprimir a transcrição

16 NUCLEOIDE E CROMATINA DE ARQUEAS Material genético organizado em nucleoide Cromatina condensada de acordo com o estado fisiológico da célula Inclui NAPs exclusivas de Arqueas, proteínas ortólogas de NAPs bacterianas e proteínas eucarióticas Principais: Alba e Histonas

17 PROTEÍNAS ALBA Dímeros de Alba associam-se ao DNA cobrindo-o em tandem (A) formando fibras nucleoproteicas helicoidais estendidas (B) Quando em concentrações mais elevadas, há a associação de dímeros adjacentes formando uma estrutura altamente ramificada

18 HISTONAS Proteínas básicas com alta afinidade pelo DNA: HMfA e HMfB Similares às histonas do domínio Eukarya Formadas por 3 α-hélices separadas por alças curtas (A) Codificadas por 1 a 6 genes e são estabilizadas formando homo ou heterodímeros (B) Os dímeros associam-se formando tretâmeros, em torno dos quais o DNA (60 a 90pb) se enrola formando Nucleossomos (C) Na cromatina, os nucleossomos são encontrados em tandem fibras compactas colar de contas

19 Arqueas Nucleossomos mais simples Grau de compactação da cromatina é menor que em eucariotos Diferenças fisiológicas importantes entre arqueas e eucariotos Arqueas (menos compactas) tem mais acesso ao genoma durante a transcrição, o que não ocorre em eucariotos. Com isso responde rápido a mudanças ambientais

20 CROMATINA EUCARIÓTICA

21 O núcleo de uma célula humana tem 6 mm de diâmetro e a extensão total do DNA dos seus 46 cromossomos soma 1,8 m. Como é resolvida a discrepância entre estas duas grandezas?

22 Cada Cromossomo consiste em uma dupla hélice de DNA contínua e única Cromossomo Núcleo celular DNA é associado a proteínas: Histonas e Não-histonas Nucleossomo unidade estrutural básica Cromatina Célula Nucleossomo eucariótico é mais complexo que de arquea Histonas Nucleotídeos DN A Ligações Fosfodiéster 22 *Cromossomo milhões pb

23 Nucleossomo: unidade estrutural básica da cromatina 150 a 250 pb associados a um octâmero de histonas (11 a 20 kda, caráter básico acentuado 20-30% aa carregados +) Favorecendo ligação c o DNA Histonas Centrais: 2 X (H2A, H2B, H3 e H4) * Alta conservação * 100 aa * Genes Histona de Ligação: H1/H5 * aa * mais variáveis * Cromatina pode ter 2x mais proteína que DNA em eucariotos

24 Nucleossomo:

25 Níveis de organização mais complexo A partir do Nucleossomo a cromatina eucariótica é estruturada em conformação progressivamente mais complexa; Organização da Cromatina é dinâmica (estágio do ciclo celular e atividade); Tipos de Cromatina: Eucromatina: menor compactação Ativa para a Expressão Gênica Heterocromatina: maior compactação Inativa

26 Cromatina: Heterocromatinas: regiões condensadas DNA inativo - Heterocromatina Facultativa: parte da cromatina que se apresenta condensada ou descondensada. Sequencias passiveis de transcrição que podem ser inativadas. Ex: cromossomo X na fêmea (apenas 1); - Heterocromatina Constitutiva: sequencias genicas altamente repetitivas, nunca são transcritas. Ex: centrômeros; Eucromatinas: regiões distendidas DNA ativo (expressão de proteínas e enzimas). 10% cromatina ativa menos condensada; 90% cromatina inativa mais condensada

27 Níveis de organização mais complexo

28 Níveis de organização mais complexo Nucleossomo: unidade estrutural básica da cromatina (DNA em dupla hélice e Histonas). Forma: cilíndrica achatada, 10 nm x 6 nm * Constituído por 200 pares de bases (pb) de DNA associado com octâmero de histonas (H2A, H2B, H3 e H4) e uma molécula de H1 * Centro do nucleossomo (octâmero de histonas pb de DNA) * DNA de ligação (15 a 80 pb) Nucleofilamento ou fibra de 10 nm: 1º nível de compactação da cromatina. Associação de nucleossomos adjacentes através da interação de H1 (extremidade amino-terminal a extremidade carboxi-terminal) 10% durante a intérfase, permitindo acesso as enzimas de transcrição Periodicidade: distribuição regular dos nucleossomos Posicionamento em fase dos nucleossomos Solenóide ou fibra de 30 nm: 2º nível de compactação da cromatina. Formada pelo enovelamento da fibra de 10 nm em estrutura helicoidal. Cada volta contém 6 nucleossomos radiais Maioria durante a interfase

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31 Níveis de organização mais complexo Particpação de proteínas Não-Histonicas: HMG e SMC Processo pouco conhecido Alças de Cromatina: Interfase alças ancoradas na Matriz Nuclear (estrutura filamentosa que preenche o núcleo) Divisão Celular alças ancoradas no Esqueleto Metafásico Fibra de 300nm: DNA de 15 a 20 vezes mais compactado que na fibra de 30nm Cromossomo Metafásico estágio mais condensado

32 DNA dupla hélice Histona H1 Nucleossomo: DNA + octâmero de histonas Solenóide 32

33 Cromossomos Cromossomos condensados são mais facilmente analisados em uma célula em divisão, durante a fase de metáfase ou prometáfase; Centrômero constrição primária entre as cromátides irmãs Braço p (petit) mais curto Braço q mais longo 33

34 CROMATINA DE ORGANELAS Plastídeos e mitocôndrias possuem genomas próprios com DNA circulares pequenos em múltiplas cópias em cada organela; As múltiplas cópias do genoma estão associados a proteínas que a cromatina organizada em nucleoides;

35 NUCLEOIDES MITOCONDRIAIS O DNA mitocondrial (mtdna) forma nucleoides (dezenas a centenas) na organela a partir de sua associação com proteínas específicas. Cada nucleoide contém cerca de 2 a 10 cópias do mtdna. Grupo HMG: importante componente proteíco na cromatina mitocondrial (TFAM) formação e estabilidade da cromatina formam homodímeros que se ligam a cada 35 ou 40pb do DNA compactação. Proteína mtssb: estabilização da estrutura da alça em D (D-loop) do mtdna (elemento de fita simples, importante na replicação do DNA)

36 NUCLEOIDES DE PLASTÍDEOS Também associa-se a proteínas para formar nucleoides (diversos) (3 a mais de 10 cópias do genoma). 2 sistemas na organização de nucleoides plastidiais: 1 - ocorre em espécies de protozoários e algas 2 - eucariotos fotossintetizantes. 1 Apicoplastos: proteína HU que liga-se ao DNA do plastídeo ocasionando seu dobramento e compactação, sendo essencial na formação de nucleoides plastidiais. 2 Sem proteína HU. Três proteínas em destaque: enzima sulfito-redutase: entre outras funções, induz a compactação do DNA de forma reversível protease CND41: liga-se ao DNA e o compacta, reprimindo a trancrição proteína PEND: se liga à membrana interna do plastídeo e ao DNA, ancorando os nucleoides em desenvolvimento.