Análise de compostos fenólicos em produtos naturais - identificação química e avaliação da bioatividade. Severino Matias de Alencar ESALQ/USP

Transcrição

1 Análise de compostos fenólicos em produtos naturais - identificação química e avaliação da bioatividade Severino Matias de Alencar ESALQ/USP

2 ESALQ/USP ESALQ/USP/Piracicaba Estado de São Paulo

3 Compostos fenólicos Ácido ferrúlico Ácido hidroxicinâmico Ácido gálico Ácido hidroxibenzóico Flavonoide Quercetina

4 Biogênese de Compostos fenólicos Pietta (2000)

5 Fontes de Compostos fenólicos Frutas atividade antioxidante (peroxilas) tucumã cagaita araçá camu-camu abiu pitanga antioxidante (hipocloroso) gabiroba murici antiproliferativa/ antioxidante Infante (2013)

6 Alimentos processados

7 Resíduos agroindustriais Bagaço (Moscato) Bagaço (Pinot Noir) Bagaço (C. Sauvignon) Bagaço (Isabel) Engaço tinto (C. Sauvignon) Engaço branco (Moscato) Borra branca Melo et al. (2015)

8 Uso de técnicas hifenadas ou técnicas acopladas Cromatografia Líquida de alta Eficiência (HPLC) Ex: HPLC/DAD, HPLC/MS, HPLC MS/MS e HPLC/RMN Pietta, 2000

9 Fracionamento e isolamento bioguiado Extração Atividade antioxidante Extrato Bruto Atividade antimicrobiana Fracionamento (solventes com diferentes graus de polaridade) Monitoramento bioguiado EEP HEX CLO

10 Fracionamento da subfração de maior atividade biológica Coluna de sílica em fase normal Monitorament o bioguiado (avaliação de atividades biológicas) Cromatograma da fração mais ativa Coluna Sephadex Monitoramento químico

11 Isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa (HPLC) Coletor automático

12 Novo Monitoramento bioguiado

13 Estrutura química proposta para o Composto 1 por RMN Epicatequina-(2β O 7, 4β 6)-[epicatequina-(4β 8)]-catequina, isolado da subfração 10 da película de amendoim Aceito para publicação na Food Chemistry

14 Estrutura química proposta para o Composto 2 por RMN Epicatequina-(2β O 7,4β 8)-[epicatequina-(4β 8)]-catequina-(4α 8)-epicatequina, isolado da subfração 10 da película de amendoim. Aceito para publicação na Food Chemistry

15 Estrutura química proposta para por Espectrometria de Massas de Alta Resolução

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17 Ressonância Magnética Nuclear Oldoni et al (2011)

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21 Estresse oxidante x Atividade antioxidante As Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) e Nitrogênio (ERN) são continuamente formadas (metabolismo); Geradas dentro das células pela exposição a agentes endógenos e exógenos; Células aeróbias possuem mecanismos eficientes para evitar os efeitos negativos ocasionados por essas moléculas. (DRÖGE, 2002; FENSTER et al., 2002; GARTHWAITE, 2004)

22 Oxidação Fonte: Vasconcelos et al., 2007 Aterosclerose, diabetes mellitus, inflamações crônicas, doenças neurodegenerativas, tipos de câncer.

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24 Avaliação da Atividade antioxidante de compostos fenólicos Sistema de Extração em Fase Sólida

25 Redução do Folin-Ciocalteau

26 Sequestro do radical livre DPPH DPPH = substância orgânica em cuja estrutura um dos átomos de nitrogênio possui um elétron desemparelhado AGENTES REDUTORES e - H (2,2- difenil 1 pricrilidrazil) Absorção máxima a 517nm Atividade = Mudança de cor do DPPH +

27 Sequestro do radical livre ABTS + K 2 S 2 O 8 (persulfato de potássio) AGENTES REDUTORES Atividade = descoramento do ABTS +

28 Atividade antioxidante on-line Avaliar o sequestro de dos radicais livres DPPH e ABTS por cada composto separado por HPLC

29 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE SEQUESTRO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ERO)

30 ORAC aquecimento oxigênio AAPH radicais peroxilas ANTIOXIDANTES oxidam fluoresceína R N=N R O 2 N 2 + 2ROO excitação = 485nm emissão = 528nm

31 ORAC Consumo de antioxidantes AA = comparação das áreas sob a curva (amostra e controle)

32 Sequestro do radical ânion superóxido NADH MP + MP ANTIOXIDANTES NAD + MPH MP + O 2 - NBT +2 NADH PMS NBT +2 O 2 NBT reduzido Fonte: adaptado de Rao (1989) 560nm Atividade = inibição da redução do NBT 2+

33 Desativação do ácido hipocloroso ácido hipocloroso produz ANTIOXIDANTES oxida NaClO + H 2 SO 4 ph = 6,2 emissão = 528nm excitação = 485nm DHR rodamina 123 Atividade = inibição da formação de rodamina 123

34 Sequestro do peróxido de hidrogênio induz oxidação e excitação H 2 O 2 ANTIOXIDANTES Lucigenina menor estado de energia emissão de luz (quimiluminescência) Atividade = % inibição da oxidação da lucigenina

35 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE SEQUESTO DE ESPÉCIES REATIVAS DE NITROGÊNIO (ERN)

36 decomposição Sequestro do radical óxido nítrico oxida NO DAF-2 ANTIOXIDANTES (4,5-diaminofluoresceina) NOC-5 emissão = 528nm excitação = 485nm DAF-2T 3-(aminopropyl)-1-hydroxy-3-isopropyl-2-oxo-1-triazene

37 Sequestro do peroxinitrito peroxinitrito produz H 2 O 2 + HCl + NaNO 2 ANTIOXIDANTES emissão = 528nm excitação = 485nm DHR oxida rodamina 123 Atividade = % inibição da oxidação do DHR

38 pg/ml Nitrite ( M) ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA Quantificação de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β, CXCL1/KC e LTB4) Determinação da produção de óxido nítrico A TNF-α (A) Macrofágo + LPS # * B NO # Macrofágo + LPS * 0 control - SH PH SF PF 0 control - SH PH SF PF LPS 1 g/ml LPS 1 g/ml

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40 Expressão global do genoma humano

41 Simulação in-silico (Gastroplus) Simulação computacional do metabolismo de compostos fenólicos

42 Muito obrigado Contato: