UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS CURSO DE FARMÁCIA SARA ELIENAI RODRIGUES DA ROCHA

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1 0 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS CURSO DE FARMÁCIA SARA ELIENAI RODRIGUES DA ROCHA ANÁLISE DO PERFIL ENZIMÁTICO DO TRICHODERMA HARZIANUM DURANTE O CRESCIMENTO COM PAREDE CELULAR DOS FITOPATÓGENOS FUSARIUM OXYSPORUM E SCLEROTINIA SCLEROTIORUM ANÁPOLIS-GO, 2014

2 1 SARA ELIENAI RODRIGUES DA ROCHA ANÁLISE DO PERFIL ENZIMÁTICO DO TRICHODERMA HARZIANUM DURANTE O CRESCIMENTO COM PAREDE CELULAR DOS FITOPATÓGENOS FUSARIUM OXYSPORUM E SCLEROTINIA SCLEROTIORUM Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Goiás como exigência parcial à obtenção do título de Bacharel em Farmácia. Orientador (a): Profa. Dra. Valdirene Neves Monteiro Anápolis-GO, 2014

3 2 Rocha, Sara Elienai Rodrigues da. Análise do perfil enzimático do Trichoderma harzianum durante o crescimento com parede celular dos fitopatógenos Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum/ Sara Elienai Rodrigues da Rocha; Monteiro, Valdirene Neves f. Orientadora: Profa. Dra. Valdirene Neves Monteiro TCC (Graduação), Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Bioquímica de Microrganismo. 2. Trichoderma harzianum. 3. Enzimas hidrolíticas Goiás (Estado). I. Monteiro, Valdirene Neves. II. Título.

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5 4 Dedico ao meu pai Elias, minha mãe Sebastiana e minha irmã Samara por todo o apoio e carinho, sempre lutando para que eu pudesse obter mais essa conquista. Aos seus incentivos nos momentos críticos e por serem meus maiores exemplos. Dedico ao meu amor Regis por ser meu sorriso, esperança e força. Dedico aos meus amigos por sempre estarem comigo, nas horas que mais precisei de vocês ao meu lado.

6 5 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente e acima de tudo ao meu Deus e Pai Eterno por ser minha base forte, meu protetor e meu amigo. Toda honra e glória seja dada ao seu nome hoje e eternamente. Agradeço a toda minha família pelo apoio incondicional durante a minha formação acadêmica, em especial a minha mãe, meu pai e minha irmã pelos valiosos conselhos, motivação, companheirismo, por me ensinarem o valor do conhecimento, da humildade e da honestidade e por serem meus exemplos e orgulho. Agradeço a Professora Dra. Valdirene Neves Monteiro pela oportunidade de crescimento acadêmico, experiências, paciência e orientação no trabalho. Agradeço aos professores que me ajudaram a executar e concluir esse trabalho, a Professora Dra. Claudia Didonet, pelas dicas em laboratório e permissão aos experimentos, ao Professor Dr. Cirano José Ulhoa pelo laboratório de enzimologia da UFG para execução parcial de alguns experimentos, e a muitos outros que me conduziram com conselhos, confiança e amizade. Agradeço aos meus amigos-irmãos de sala, porque sem vocês esses anos seriam difíceis e eu pude sempre me descontrair com momentos de alegria e amizade. Vocês foram simplesmente essenciais em cada disciplina e dificuldade. Em destaque a minha grande amiga Chálita por estar ao meu lado com conselhos, repreensões, apoio e muito companheirismo, para me ajudar e me animar sempre. Agradeço a todos os meus amigos que tiveram paciência, bondade e por efetivarem uma jornada mais leve e agradável, sempre com muita alegria. Enfim, por todos aqueles citados ou não aqui, por terem contribuído para minha formação pessoal e profissional, aos quais sem a preciosa presença nenhuma conquista jamais seria alcançada ou teria todo esse valor, o meu sincero e emocionado MUITO OBRIGADA!!!

7 6 Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos pérolas únicas no teatro da vida e entender que não existem pessoas de sucesso e pessoas fracassadas. O que existem são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles. Augusto Cury

8 7 RESUMO Trichoderma é um fungo conhecido por sua capacidade de controle biológico sobre diversos fitopatógenos, constituindo um gênero de amplo interesse agrário. Seu mecanismo de ação é bastante diversificado, com destaque para a secreção de enzimas hidrolíticas. Fitopatógenos são fungos causadores de doenças em plantas. O presente trabalho procurou avaliar o perfil enzimático, através da atividade específica das enzimas: fosfatase ácida, fosfatase alcalina, proteases, β-glicosidade, quitinase, β-1,3- glicanases, α- manosidade, N- acetil- β- D- glicosaminidase (Nagase), secretadas por Trichoderma harzianum na presença de um preparado de parede celular dos fitopatógenos Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum. Para isso foi induzido um crescimento de T. harzianum em meio líquido contendo a parede celular de cada um dos fitopatógenos e depois os ensaios enzimáticos para diferenciação entre as fontes indutoras. Em proteínas totais a secreção de proteínas pelo Trichoderma harzianum frente a Fusarium oxysporum, foi maior quando comparada a liberação de proteínas pelo Trichoderma harzianum induzido pela presença de parede celular de Sclerotinia sclerotiorum. Mais de um modo geral, com relação às enzimas avaliadas, os meio contendo a parede celular de Sclerotinia sclerotiorum, observou uma secreção maior das enzimas pelo T. harzianum, do que no meio contendo parede de Fusarium oxysporum. Proteases, quitinases e β-1,3- glicanases foram muito bem secretadas, e dentre essas três enzimas consagradas no mecanismo de biocontrole, a secreção de β-1,3-glicanases foi maior do que quitinases e proteases. No entanto, a maior liberação foi de NAGase. Fosfatase alcalina foi a enzima menos encontrada nos dois confrontos avaliados. As paredes de Fusarium oxysporum induziram maior produção de algumas proteases, β- glicosidase e fosfatase alcalina. Enzimas que acredita-se não estar diretamente relacionada com o micoparasitismo, como α-manosidase e α-l-arabinofuranosidase, foram encontradas nos meios analisados e reforçam a ideia de que contribuem com o processo e que outras proteínas podem ser expressadas e secretadas no meio de acordo com a composição da parede celular com o intuito de exercer ação controladora no meio de convívio do Trichoderma harzianum. Palavras-chave: Trichoderma harzianum, Fusarium oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum, enzimas hidrolítica.

9 8 ABSTRACT Trichoderma is a fungus known for its ability to control over many biological pathogens and are a genus of large agricultural interests. Its mechanism of action is quite diverse, highlighting the secretion of hydrolytic enzymes. Are phytopathogenic fungi that cause plant diseases. This study sought to evaluate the enzymatic profile through the specific activity of the enzymes acid phosphatase, alkaline phosphatase, protease, β-glucosidase, chitinase, β-1, 3 - glucanases, α-manosidade, N-acetyl-β-Dglucosaminidase (Nagase), secreted by Trichoderma harzianum prepared in the presence of a cell wall of the phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum. To this was induced growth of T. harzianum in a liquid medium containing the cell wall of each of the following plant pathogens and enzyme assays for differentiation-inducing sources. In total protein secretion of proteins by Trichoderma harzianum against Fusarium oxysporum, was greater when compared to the release of Trichoderma harzianum proteins induced by the presence of cell wall Sclerotinia sclerotiorum. More generally, enzymes evaluated with respect to the medium containing the cell wall of Sclerotinia sclerotiorum observed an increased secretion of enzymes by T. harzianum than in medium containing Fusarium oxysporum wall. Proteases, chitinases and β-1,3-glucanases were well secreted, and among these three enzymes enshrined in biocontrol mechanism, secretion of β-1,3- glucanases was greater than chitinases and proteases. However, higher release was NAGase. Alkaline phosphatase is an enzyme found in the two least clashes reviews. The walls of Fusarium oxysporum induced higher production of some proteases, β- glucosidase and alkaline phosphatase. Enzymes that are believed to not be directly related to mycoparasitism as α-mannosidase and α-l-arabinofuranosidase, were found in the media analyzed and reinforce the idea that contribute to the process and that other proteins may be expressed and secreted in the middle according to the composition of the cell wall in order to exert action on the controlling means of interaction of Trichoderma harzianum. Keywords: Trichoderma harzianum, Fusarium oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum, hydrolytic enzymes.

10 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura da parede celular de fungo (MONTEIRO, 2008) Figura 2 - Microscopia eletrônica de varredura da ação micoparasitária de T. harzianum sobre R. solani. ( LIMA, 2002) Figura 3 - Isolado de Fusarium oxysporum crescido em meio MYG. (LOPES, 2012) Figura 4 - Ciclo biológico de Fusarium sp. (Qualhato, 2012) Figura 5: Isolado de Sclerotinia sclerotiorum crescido em meio MYG. (LOPES, 2012) Figura 6: Ciclo biológico de Sclerotinia sclerotiorum. (Adaptado de Agrios, 1997).. 23 Figura 7: Diferenças entre atividades específicas enzimáticas em mg/ml no crescimento entre T. harzianum/ Fusarium oxysporum e T. harzianum /Sclerotinia sclerotiorum Figura 8: Diferenças entre atividades de Proteases em mg/ml no crescimento entre T. harzianum/ Fusarium oxysporum e T. harzianum /Sclerotinia sclerotiorum Figura 9: Diferenças na produção de proteínas totais em µg/ml no crescimento entre T. harzianum/ Fusarium oxysporum e T. harzianum /Sclerotinia sclerotiorum... 42

11 10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO FUNGOS E PAREDE CELULAR AGENTE DE BIOCONTROLE Gênero Trichoderma Trichoderma harzianum FITOPATÓGENOS Fusarium oxysporum Sclerotinia sclerotiorum ENZIMAS HIDROLÍTICAS Proteases Quitinases Fosfatase Ácida e Alcalina N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAGase) α-manosidase α-arabinofuranosidase (ABF) β-glicosidase β-1,3-glicanase OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVO ESPECÍFICO... 31

12 11 4. METODOLOGIA MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS CONDIÇÃO DE CRESCIMENTO PURIFICAÇÃO DAS PAREDES CELULARES DOS FITOPATÓGENOS ENSAIOS ENZIMÁTICOS β-1,3-glicanase Protease Quitinase Fosfatase ácida e alcalina N-acetil-B-D-glicosaminidase (NAGase) α-manosidase α-arabinofuranosidase (ABF) β-glicosidase Proteínas Totais RESULTADOS E DISCUSSÕES CONCLUSÃO REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA... 44

13 12 1. INTRODUÇÃO No âmbito agrícola existem diversos desafios a serem vencidos e um deles é o crescimento de microrganismo e o eventual aparecimento de doenças geradas por eles, sendo que os mais prejudiciais são os fungos. Essas manifestações provocam prejuízos econômicos e naturais como diminuição do tempo de armazenamento devido a deterioração dos produtos, bem como o seu rendimento e estética (BENÍTEZ et al., 2004). O uso abusivo de produtos químicos antifúngicos tem causado a seleção de organismos resistentes. Do mesmo modo, o uso desses compostos pode revelar consequências graves a organismos não alvos e impactos severos ao meio ambiente e ao homem como, por exemplo, intoxicação do trabalhador no momento da aplicação do produto, contaminação dos alimentos cultivados por resíduos tóxicos, contaminação dos solos e água e consequentemente contaminação dos reservatórios naturais de água, dentre outros (VARMA et al., 2007; BENÍTEZ et al., 2004). Para fins de regulamentação visando menor impacto ambiental e humano, encontram-se legislações que limitam o uso de produtos químicos e, portanto tem-se a necessidade de um novo mecanismo para assegurar a saúde ambiental e humana. Para solucionar esse problema, existe o uso de organismos antagônicos aos fitopatógenos que estão livres de resistência, e a combinação de seus metabólitos produz o mesmo efeito que um fungicida comercial comum (HOWELL, 2002; ZIMAND et al., 1996; BENÍTEZ et al., 2004; VARMA et al., 2007). A ação antibiótica se caracteriza pela destruição ou ainda a inibição de um organismo concorrente por liberação de agentes tóxicos por outro microrganismo (BAKER E GRIFFIN, 1995). Esses produtos eliminados por agentes de controle biológico (ACBs) danificam estruturas de sustentação dos fitopatógenos e assim impedem a correta forma de desenvolvimento (GOLDMAN et al., 1994). Quanto maior o número de enzimas eliminadas, maior é o caráter antagônico do fungo. Isto por que cada componente eliminado produz um efeito ou intensifica algum já produzido (PEZET et al., 1999). Os estudos revelam que os mecanismos de ataque ao fitopatógeno diferem até mesmo dentro de um mesmo gênero. Para tornar o uso de agentes de controle biológico mais eficiente, um dos fatores mais importantes no estudo é a

14 13 compreensão desses mecanismos causadores de injúrias nas plantas e os limites de ação do organismo patogênico. Junto ao micoparasitismo e a antibiose, trabalha também a competência do organismo controlador em se desenvolver na rizosfera sendo um complemento a ação controladora. Isso porque a competição por ambiente e espaço é ineficaz se o microrganismo não é capaz de se desenvolver na rizosfera (HOWELL, 2003). Em razão de algumas características como estabilidade, diversidade, espaço pequeno de cultivo e facilidade na manipulação genética, pelo rápido crescimento e desenvolvimento, as enzimas de origem microbianas são mais interessantes biotecnologicamente que as demais. São utilizadas em uma série de áreas em aplicações industriais, e é bastante propenso em biorremediação (PEREIRA et al., 2007). Os fungos do gênero Trichoderma são amplamente conhecidos por exercer um controle biológico sobre organismos prejudiciais aos solos e as plantas, agindo de diversas maneiras no combate a eles. São culturas universalmente distribuídas em solos, apresentando-se em estrutura filamentosas (conídios) sendo exemplos de resistência a pesticidas, fungicidas e produtos liberados por outros fungos (PÁDUA et al., 2007; KULLNING et al., 2000). Como o mecanismo de antagonismo fúngica esta diretamente relacionado com a liberação de enzimas para o meio contendo o fitopatógeno (KUBICEK et al., 2001), estudar as enzimas secretas é o principal caminho para compreensão da forma de agir desse organismo. Trichoderma harzianum já tem sido caracterizado como agente antagônico de diversos fungos, dentre eles Rhizoctonia solani, como descrito por Lima (2002). A ação dessa espécie também pode ser avaliada quanto a colonização das hifas, como na liberação de enzimas líticas sobre outros microrganismos patógenos a plantas.

15 14 2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 FUNGOS E SUA PAREDE CELULAR Existem diversas formas de fungos distribuídos universalmente, que se alimentam e se caracterizam de várias formas possíveis, sendo unicelulares ou constituintes de hifas, uns em forma de esporos e outros em variadas formas reprodutivas e de resistência. Em qualquer que seja o caso, a resistência e proteção fúngica compreende a integridade da parede celular, responsável por diversas funções e quimicamente diferente da parede protetora dos tecidos celulares dos animais e plantas (GOODAY, 1995; JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2005). Há uma variação na composição da parede celular de fungos de espécies distintas, mais de um modo geral ela se apresenta em uma estrutura complexa de quitina, glicana, manana, proteínas, lipídeos, fosfatos e íons inorgânicos, como visualizado na Figura 1 (BARTNICK-GARCIA, 1968; ADAMS, 2004). Um dos homopolissacarídeos formadores da parede celular é a quitina formada por N-acetilglicosaminas, ligadas por pontes de hidrogênio e originando microfibras de quitina. Possui a capacidade de suportar intensas pressões e por isso é a principal responsável pela integridade da parede fúngica. Se a síntese desse homopolissacarídeos for influenciada, a parede celular fica desestabilizada e compromete a osmose celular (BOWMANN E FREE, 2006). Fitopatógenos se aderem aos hospedeiros através de uma identificação e fixação protéica ou glicoprotéica, que são identificados como os principais produtos no mecanismo de origem de doenças. (LEITE et al., 2001). O conhecimento das estruturas morfológicas de fitopatógenos é importante para a compreensão dos mecanismos de combate utilizados pelos agentes de biocontrole, já que a quebra da integridade da proteção é a principal ação para a invasão desses organismos.

16 15 Figura 1: Estrutura da parede celular de fungo. Fonte: Monteiro, AGENTE DE BIOCONTROLE Gênero Trichoderma Trichoderma é o gênero de um fungo cosmopolita, teleomorfismo em Hypocrea, saprófitas e micoparasitas, haplóide com parede de quitina e glicanos, de crescimento rápido, que se caracteriza por serem inicialmente brancos e posteriormente apresentarem esporos verdes, e pela produção de enzimas e secreções capazes de eliminar concorrentes em seu habitat. Assim, atualmente estudos se dirigem para interesses em processos industriais (fungicidas, antibióticos) por meio da capacidade de biocontrole de fitopatógenos de solo, folhas e frutos sendo exemplos, Botrytis cinerea, Fusarium spp, Rhizoctonia solani entre outros (ALMEIDA et al.,2007; SCHUHMACHER E ZEILLINGER, 2007; SCHUSTER E SCHMOLL, 2010). São característicos por sobreviverem e se desenvolverem a condições muito desfavoráveis sendo resistentes a herbicidas, fungicidas e pesticidas, se

17 16 reproduzem rapidamente, utilizam eficientemente nutrientes, modificam agressividade, fortifica rizosfera contra fitopatógenos, acessão no crescimento de plantas e na sua defesa pela produção de compostos estimulantes (BENÍTEZ et al., 2004). Dentre os mecanismos propostos para o biocontrole de espécies de Trichoderma estão o micoparasitismo através da produção de enzimas degradadoras da parede celular de fitopatógenos, produção de antibióticos voláteis e não voláteis, competição por nutrientes, rizosfera competente e indução de respostas defesa em plantas (HOWELL, 2003). Sua arma de defesa é a liberação de enzimas micoparasita, antagonista e agente biocontrole. Seus metabólitos são usados como fungicidas biológicos contra fungos patogênicos que causam doenças nas plantas. Controlam ascomicetos, basidiomicetos, oomicetos e nematóides, através da liberação de enzimas líticas, proteolíticas, sideróforos que controlam absorção de ferro e nitrogênio, metabólitos difusíveis ou voláteis, ou ainda prejudicam as condições de crescimento dos patógenos liberando micotoxinas, terpenos, pironas, derivados de aminoácidos e polipeptídeos (SCHUSTER E SCHMOLL, 2010). Para um controle biológico eficaz, necessita-se de uma combinação de ações diretas e indiretas - que impedem a resistência das cepas alvo - como liberação de enzimas de degradação de parede celular, liberação de proteases, liberação de antibióticos, indução de resistência sistêmica da planta, isto é, quando o fungo coloniza por muito tempo a planta, podendo penetrar a epiderme, ele libera produtos que a estimula a sintetizar e armazenar fitoalexinas, flavonóides, terpenóides, derivados fenólicos, agliconas, peroxidases e outros antimicrobianos. O Thichoderma é mais resistente a esses produtos naturais do que os fitopatógenos (ELAD, 2000). Há, portanto, uma necessidade de síntese de enzima junto ao controle biológico pela liberação de antibióticos pelos ACBs para tornar a ação de biocontrole mais eficaz do que a produção de apenas uma delas (HOWELL, 2003). Respondendo a um estímulo químico, o Trichoderma direciona suas hifas em crescimento na direção ao patógeno. Para o mecanismo de antagonismo, inicialmente o Trichoderma deve reconhecer o hospedeiro e isso acontece através da interação lectina-carboidrato. Logo após há formação de estruturas que se assemelham a ganchos, e o antagonista se enrolam ao patógeno por eles (Figura 2). Todos esses processos são mediados por enzimas. Em seguida, há a liberação de

18 17 enzimas extracelulares, sendo que as principais são proteases, quitinases e glucanases, que degradam a parede do patógeno e permite a entrada das hifas do Trichoderma. Ao adentrar, encontra nutrientes que são absorvidos pelo fungo. Com mecanismo semelhante, há a eficiência de parasitar estruturas fúngicas, caracterizando o micoparasitismo (INFANTE et al., 2009). Figura 2: Microscopia eletrônica de varredura da ação micoparasitária de T. harzianum sobre R. solani. A, B, C e D correspondem a interação entre os isolados de T. harzianum ALL-23, ALL-40, ALL- 41 e ALL-44 e o isolado de R. solani CNPAF-03, respectivamente, Bar = 10 µm. Fonte: Lima, A parede celular de fungos é composta basicamente por quitina. Logo, a produção de enzimas quitinolíticas é essenciais para o biocontrole de fungos fitopatógenos (FLEURI E SATO, 2008). O envolvimento do sistema enzimático quitinolítico e β-1,3 glicanolítico no micoparasitismo de Trichoderma foi investigado em detalhes, no qual o papel do sistema proteolítico extracelular não foi muito bem conhecido (VAZQUEZ- GARCIDUENAS et al., 1998; KUBICEK et al., 2001). Porém em recentes anos mais

19 18 abordagens vem sendo realizadas em proteases de Trichoderma quanto ao seu potencial papel no biocontrole e outros processos (KREDICS et al., 2005). Glicanases, manosidases, proteases e quitinases estão relacionadas a lise de leveduras. Em geral, necessita-se apenas de uma enzima para degradar a membrana interna e outra para a degradação da membrana externa. Existem preparações comerciais dessas enzimas que são extraídas e purificadas para diversos fins, como por exemplo: preparação de ração animal, pré-tratamento para a ruptura de células, determinação e estudos da síntese da parede celular de fungos patógenos, entre outros (FLEURI E SATO, 2008). Proteases podem ser usadas em indústrias farmacêuticas, de alimento, detergentes, além das aplicações biotecnológicas. Mas a apresentação em um processo fermentativo para obtenção de outra enzima extracelular pode prejudicar o resultado esperado (KREDICS et al., 2005). O possível papel de proteases envolvidas no antagonismo de espécies de Trichoderma vem sendo descrito desde 1969 por Rodriguez-Kabana e colaboradores, demonstrando a atuação de atividade proteolítica de T. viride na atividade enzimática de Sclerotium rolfsii. Outros trabalhos abordaram outros aspectos como a importância do ph para a atividade máxima de proteases, o envolvimento de proteases na competição por substratos protéicos ou em conjunto com quitinases e glicanases na degradação da parede celular da célula hospedeira (ELAD E KAPAT, 1999; SIVAN E CHET, 1989) Trichoderma harzianum Trichoderma harzianum pertence ao gênero de fungos saprófitas e é o mais estudado e usado contra fitopatógenos. Seu sistema enzimático para biocontrole consiste de cinco a sete enzimas líticas, sendo basicamente duas β- N- acetilglicosaminosidases e quatro endoquitinases. Provavelmente cada enzima desse sistema exerce ação complementares dando uma eficácia maior ao processo de invasão, infecção e combate ao fitopatógeno (CARSOLIO et al., 1999). Trabalhos como o de Carsolio et al., tentam comprovar a hipótese de que a endoquitinase Ech42, é a enzima chave para degradação da parede celular pois essa enzima por si só é capaz de hidrolisar in vitro a parede de Botrytis cinerea,

20 19 inibe germinação e impedi o desenvolvimento de estruturas fundamentais para crescimento de vários fungos. 2.3 FITOPATÓGENOS Fusarium oxysporum Os fungos do gênero Fusarium com teleomorfismo em Nectria e Gibberella estão distribuídos em todo o planeta e em diferentes tipos de solos, potencialmente patogênicos e que colonizam de forma eficiente a rizosfera (Figura 3) (QUALHATO, 2012). Esses fitopatógenos ocorrem com mais frequência em regiões temperadas, tropicais ou subtropicais, ocorrendo também bastante associações com hospedeiros (BURGESS et al., 1994). Existe uma variabilidade muito grande com as culturas dessa espécie devido sua fácil adaptação em diferentes meios ambientes (FORTES, 2006). Figura 3: Isolado de Fusarium oxysporum crescido em meio MYG. Fonte: Lopes, Quando encontra uma oportunidade de infecção, esse fungo penetra no tecido da planta através de um ferimento e inicia um processo de colonização caracterizado por uma série de características destrutivas resultando a morte. Para tal ação, existe a produção e liberação de uma gama de metabólitos secundários em

21 20 que se destacam são as fumonisinas por auxiliarem na ocorrência de micotoxicose, (Figura 4) (QUALHATO, 2012). Estudos apontam que as fumonisinas também são potenciais agentes cancerígenos para humanos, estando relacionadas especificamente ao câncer esofágico (IARC, 2002) e as suspeitas também são apontadas no aumento de casos de alterações no tubo neural (NTD) em pessoas que vivem na fronteira do Texas com o México (STACK, 1998). A dispersão do Fusarium é realizada pela chuva, vento e insetos. Esses também são responsáveis pelas infecções desse fitopatógenos entre uma cultura e outra, de diferentes anos e períodos. O fungo chega ao grão através das estruturas que ligam a parte interna e externa das plantas, como as estigmas de milho, cresce no pericarpo e adentram-se para o interior. As hifas podem alcançar o embrião e endosperma. Se o pericarpo for rompido, há a contaminação dos grãos (NELSON, 1991). Há relatos de que este gênero costuma infectar lavouras de banana, pimenta, feijão, milho, tomate, berinjela, trigo e girassol, ou ainda em humanos causando um tipo de micose (FORTES, 2006). A espécie Fusarium oxysporum pertence a ordem Hypocreales e é naturalmente sobrevivente no solo e em restos de culturas agrícolas de matéria orgânica atuando como saprófitas ou sobre a forma resistente de clamidósporos ou ainda em hospedeiros, mais ele pode viver muitos anos sem alguma forma de associação. Ele se caracteriza por ter uma forma de canoa pontiaguda e levemente encurvada. A forma de disseminação é pelos esporos aderidos as sementes, através do vento ou da água que realiza a irrigação do solo. Estão principalmente relacionados com doenças causadas em plantações de feijão (ITO, 2004).

22 21 Figura 4: Ciclo biológico de Fusarium sp. Fonte: Qualhato, Sclerotinia sclerotiorum Os fungos filamentosos da espécie Sclerotinia sclerotiorum são característicos e conhecidos por se desenvolverem no solo e causarem doenças em

23 22 plantas como a podridão mole e o mofo branco. Acometem mais expressivamente feijão e soja e há relatos de perdas de 5 a 100 % das culturas (BATISTA et al., 2011). Para manter-se vivo no solo, ele desenvolve uma estrutura conhecida como escleródio (Figura 5) (ABDULLAH et al., 2008). Figura 5: Isolado de Sclerotinia sclerotiorum crescido em meio MYG. A estrutura destacada pela seta é o escleródio. Fonte: Lopes, Essa espécie fúngica pertence ao conjunto de fitopatógenos que causam bastante prejuízo para a agricultura, pois possuem a capacidade de colonizar e infectar um grande número de famílias e espécies de culturas agrícolas como algodão, soja e feijão. O mecanismo de ataque a planta engloba desde a fase de crescimento até um pós-coleta (QUALHATO, 2012). Sclerotinia sclerotiorum pode ser encontrado em todo o mundo, mais preferencialmente em regiões com temperatura mais ambiente com alta umidade no solo e no ar (LEITE, 2005). O tamanho dos escleródios depende do hospedeiro, mais sempre estarão presentes na superfície dos tecidos infectados, e são fundamentais para a sobrevivência porque retornaram ao solo. Nas condições ideais e com um hospedeiro disponível e susceptível, ocorre a germinação e há formação do micélio. Este por sua vez, penetra na planta através dos tecidos ou forma apotécios que surgem do solo e libera estruturas que infectam flores, denominada ascósporos (Figura 6) (LEITE, 2005).

24 23 Figura 6: Ciclo biológico de Sclerotinia sclerotiorum. Fonte: Adaptado de Agrios, Os escleródios são viáveis ate 10 anos e junto ao fato da S. sclerotiorum possuir vários hospedeiros o seu combate é muito difícil. São formados por um grupo de hifas envolvido por uma casca escura que contem melanina, a parte interna é formada principalmente por carboidratos e proteínas (LOPES, 2012). 2.4 ENZIMAS HIDROLÍTICAS Para exercer o biocontrole, o agente responsável deve ser capaz de degradar a parede celular dos fungos patógenos de plantas. Dentre as enzimas hidrolíticas responsáveis por esse processo, destacam-se proteases, glicanases, quitinas, N- acetil-β-d-glicosaminidase (NAGase), β-1,3-glicanases, e são essenciais para o mecanismo de micoparasitismo (KUBICEK et al., 2001; BATISTA et. al., 2011).

25 Proteases Proteases são enzimas que catalisam a clivagem de ligações peptídicas de proteínas, digerindo essas proteínas em peptídeos ou aminoácidos livres. São classificadas de acordo com o seu modo de ação e seus sítios ativos em aspartil, cisteíno, metalo, serino, treonino proteases e proteases com mecanismo catalítico não conhecido. As proteases podem ser divididas de acordo com o mecanismo de clivagem das ligações peptídicas em endoproteases (ou endopeptidases), que clivam as ligações peptídicas dentro do polipeptídeo, e exoproteases (ou exopeptidases) que clivam ligações peptídicas somente em N- ou C-terminal das cadeias polipeptídicas (MONOD et al.,2002). Assim, proteases são enzimas hidrolíticas bem produzida pelo gênero Trichoderma e agem inativando enzimas do patógeno. São todas as enzimas que possuem a capacidade de auxiliar ou quebrar ligações peptídicas de proteínas, tornando-as menores. São classificados de início, pela forma como agem e seus sítios ativos. O próximo passo é direcionar essas proteases a um grupo de enzimas homólogas, onde serão identificadas pelo tipo catalítico ou divididas em endoproteases ou exoproteases. Tanto uma como a outra são excelentes enzimas digestivas e propensas a utilização em larga escala. Sendo assim, se um fungo encontra dificuldades em encontrar nutrientes exógenos para a germinação e penetração, ele é sensível aos seus concorrentes. (ELAD, 2000; MONOD et al., 2002). Sabe-se da função das proteases no controle biológico de fungos patógenos de plantas e nematódeos, e suspeita se ainda de seu papel na competição saprofítica e ainda possuir fatores de potenciais de virulência em fungos patógenos de humanos (KREDICS et al., 2005). Íons amônio e aminoácidos podem reprimir os genes que codificam proteases. Supõe-se que a produção de proteases também aumente a virulência de fungos (MONOD et al., 2002). Para aumentar a eficiência na produção de proteases, fizeram-se estudos para comprovar se a superexpressão dos genes que os codificam aumentariam a eficácia. A conclusão que chegaram foi que um aumento moderado da concentração de enzimas extracelulares seria a maior ferramenta para qualificar a capacidade de biocontrole do Trichoderma (KREDICS et al., 2005).

26 25 O uso de organismos antagônicos resulta numa otimização das técnicas antifúngicas usadas, como os produtos químicos, preservando assim a planta de um modo geral e evitando de forma natural os mecanismos de resistência (MICHEL- ACEVES et al., 2005). Hoje, as pesquisas no gênero Trichoderma focam aumentar a eficiência das enzimas para diminuir o custo da produção de bioetanal apartir de resíduos de material celulósico, além das aplicações nas indústrias de papel, celulose e têxtil, produção de proteínas heterólogas, aditivos alimentícios e em pastas dentais (SCHUSTER E SCHMOLL, 2010). As perspectivas utilidades desse fungo vêm desde produção de biocombustíveis através de resíduos industriais, ate produção de enzimas e antibióticos para o biocontrole, além da simbiose com plantas como biofúngicida comercial (SCHUSTER E SCHMOLL, 2010). Devido ao interesse industrial pelo potencial tecnológico desse microrganismo, tem-se a oportunidade de inserir a sua ação sobre resíduos celulósicos, a fim da degradação desse e consequentemente produção de novo recurso combustível, como fonte renovável de escolha, principalmente no Brasil que toma tanto uso de meios que geram bastante resíduos Quitinases Quitinases são enzimas líticas amplamente estudadas em Trichoderma (GRUBER E SEIDL-SEIBOTH, 2012). Um grande número de fungos produz e secreta a quitinase em resposta ao estímulo de presença de quitina em seu habitat. É uma enzima com grande importância celular porque possui ação no crescimento, reciclagem celular e a destruição da parede celular como forma de defesa (GRUBER E SEIDL-SEIBOTH, 2012; BATISTA et al., 2011). Para melhor entendimento, Sahai e Manocha (1993) fizeram uma divisão em 3 grupos, quanto a forma de atuação no polímero, para as enzimas que quebram a quitina: I) 1,4-β-N-acetilglicosaminidases que agem de forma inespecíficas sobre a quitina e o resultado são monômeros de N-acetil-D-glicosamina; II) Endoquitinases que utilizam regiões internas no polímero de quitina para exercerem uma quebra aleatória que libera, ao final, oligossacarídeos;

27 26 III) Exoquitinases que atuam em ligações externas do polímero catalisando a liberação de diacetilquitobiose, sem a liberação dos citados nos outros grupos Fosfatase Ácida e Alcalina As fosfatases são enzimas que podem ser encontradas em eucariotos e procariotos (HOLANDER, 1971) e que são capazes de hidrolisar anidridos de ácidos fosfóricos e ésteres em fosfato na forma inorgânica, associando-se a processos naturais como os mecanismos de sinalização celular, e a obtenção de fósforo para o metabolismo normal de plantas de obtenção de energia ou organismos que dependem desse elemento para fins semelhantes (GUIMARÃES et al., 2004; TATE, 1984). Podem ainda, efetuar transfosforilação de fosfoésteres de glicerol, fenol e p- nitrofenol, para grupos aceptores como os de piridoxina, álcoois alifáticos e glicose, por exemplo (BITTENCOURT, 1976; CHAO et al., 2010). Existem 2 grupos de fosfatases que se agrupam de acordo com ph ótimo de atuação de cada uma delas. Sendo assim, as fosfatases alcalinas são aquelas que atuam em ph igual ou acima de 8,0 e as fosfatases acidas são as que agem em ph igual ou abaixo de 6,0 (DICKMAN E YARDEN, 1999). A fosfatase alcalina possui a ação de transfosforilação e atividade hidrolítica, supondo-se que pode haver a atuação como proteína quinase ou ainda como uma proteína fosfatase (SHINOZAKI et al., 1995). As fosfatases ácidas hidrolisam fosfoésteres através de um mecanismo onde há a produção de um intermediário covalente fosforil-enzima e álcool e em seguida ocorre uma hidrólise desse intermediário originando na formação do fosfato inorgânico (Pi) (VINCENT et al., 1992). No entanto, existem relatos de que as atividades das fosfatases ácidas podem ser inibidas por compostos, como por exemplo, tartarato e radicais livres (ASPEE, 2000) N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAGase) N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAGase) é uma enzima relacionada com a formação e remodelação de hifas, ações no ciclo celular de levedura, mais

28 27 especificamente na formação do tubo de germinação, no brotamento de basidiomicetos, dentre outros (PERA et al., 1997; UEDA et al., 1992). NAGases são caracterizadas para relatos de características específicas. Os relatos revelam que NAGases apresentam massa molecular de 27 a 190 kda com pi entre 3 e 8. O ph e temperatura ótimo estão entre 4 e 7, de 20 a 40 ºC, respectivamente. NAGases de T. harzianum, Strachybotrys elegans e Beauveria bassiana possuem estruturas dímeras mais complexas, diferente das demais endoquitinases, que são capazes de clivar quitinases internamente originando produtos com baixa massa molecular como as quiitotetraoses, quitotrioses e diacetilquitobiose, e quitobiosidades que são tipos de exoquitinases clivam os produtos das endoquitinases gerando monômeros de N-acetilglicosamina ( TAYLOR et al., 2002; ULHOA E PEBERDY, 1991; BIDOCHKA et al., 1993; DUO-CHUAN, 2006; HARMAN et al., 1993; ULHOA E PEBERDY, 1992; DE LA CRUZ et al., 1992; LI et al., 2004; DAHIYA et al., 2006). De forma associativa e coordenada, a N-acetil-β-D-glicosaminidase possui uma ação junto a quitinases para hidrolisar quitina (DAHIYA et al., 2006) α-manosidase As α-manosidases (α-monoside monohydrolase, E.C ) estão incluídas na família de exoglicosidases que se caracterizam por hidrolisarem resíduos de α-d-manosil (manose) em α-d-manosídeos, agindo nos terminais não redutores de di- ou oligossacarídeos e clivando ligações glicosídicas do tipo α. Essas enzimas são participantes do catabolismo de carboidratos (MOREMEN et al., 1994). Essa enzima exerce uma função nos N-glicanos formados recentemente e na hidrólise de glicoproteínas maduras. São várias as formas de α-manosidases, que variam conforme a localização na célula ou ph (GAIKWAD, KESKAR E KHAN, 1995). A quebra das hemiceluloses resultando em componentes monoméricos tem a necessidades da participação e atividade de várias enzimas. Sendo assim, tanto a β- glicosidase como a α-manosidase são responsáveis pela degradação de glicomananas e mananas, que são as estruturas formadoras das hemiceluloses. (BEG, 2001; PERES et al., 2000).

29 α-arabinofuranosidase (ABF) α-l-arabinofuranosidases (arabinofuranohidrolases, α-l-arabinofuranósido; CE ) são enzimas com ação exo que hidrolisam resíduos não redutores de arabinofuranose em arabinoxilano, pectinas, e oligossacarídeos mais curtos. Estas enzimas estão sendo encontradas e isoladas a partir de bactérias, fungos e plantas (SAHA, 2000). Arabinose, ribose e fucose são considerados traços de parede celular fúngica ( BARTNICKI-GARCIA, 1968). O açúcar simples L-arabinose é a pentose com configuração L mais comum na natureza. Encontra-se principalmente em estruturas da parede celular das plantas, como a pectina e xilano. Na pectina está presente nas cadeias laterais de arabinogalactano e também nas cadeias laterais e esqueleto arabinano. Já o xilano é encontrado como cadeias laterais de arabinoxilano (BELDMAN et al., 1997). A biodegradação da parede celular é um processo importante para a obtenção de monossacarídeos, sendo também um processo bastante útil biotecnologicamente, com muitas aplicações industriais, tais como as fermentações (SAHA, 2000). Entre as enzimas que participam desses processos são aquelas que a ação da hidrólise libera resíduos de arabinose. Estão inclusas as arabinanases com ação endo e arabinofuranosidases com ação exo, que hidrolisam as cadeias laterais de arabinofuranose (BELDMAN et al., 1997). Os polissacarídeos derivados de arabinofuranose são complexos e possuem uma variedade enorme de substratos e ligações, podendo ser observado ABFs com diferentes especificidades (RAVANAL et al., 2010) β-glicosidase Naturalmente, existe uma variedade muito grande de ligações glicosídicas e, portanto, um número grande de glicosidases: enzimas capazes de clivar essas ligações. Isso acontece pelo fato de também existirem uma diversidade muito grande de substratos e sítios ativos capazes de destruir essas ligações (WITHERS, 2001). As β-glicosidase formam um grupo diverso de enzimas hidrolíticas, mais são encontradas em diversos organismos, sendo bactérias, fungos, plantas e animais (BHATIA et al., 2002).

30 29 A ação realizada pela β-glicosidase é principalmente a clivagem de ligações β-glicosídicas em glicosídeos de baixa massa molecular, como dissacarídeos, oligossacarídeos, glicosídeos conjugados e celobiose em fungos e bactérias (SANZ- APARICIO et al.; 1998, BHATIA et al.; 2002, COULON et al., 1998), sendo que a afinidade dessas enzimas pelos seus substratos dependem da localização da enzima, assim como de sua origem e função fisiológica (WOODWARD E WISEMAN, 1982). β-glicosidase também estão envolvidas na interação patógeno-planta (HAERTER E VOEGELE, 2004; STAPLES E MAYER, 1995; ASHBY, 2000; DORI et al., 1995). Acontece em alguns microrganismos de diferentes β-glicosidases serem codificadas por genes distintos. Um exemplo disso são fungos que são característicos em secretarem formas de diferentes de uma enzima dependendo da linhagem ou/ e condições ambientais, evidenciando uma evolução (RIOU et al., 1998) β-1,3-glicanase O segundo polímero fibrilar da parede celular de fungos é o β-1,3-glicano (GRUBER E SEIDL-SEIBOTH, 2012). As β-1,3-glicanase, classificam-se, de acordo com a forma de ataque ao substrato, em exo e endo-β-1,3-glicanases, sendo identificados pelos produtos gerados após a hidrólise (PITSON et al., 1993). As endo-β-1,3-glicanases atuam no substrato de forma inespecífica e aleatória resultando em cadeias pequenas. As exo-β-1,3-glicanase hidrolisam os resíduos de glicose pelos resíduos não redutores, gerando glicose, dissacarídeos, dentre outros oligossacarídeos. Mas as exo e endo-β-1,3-glicanases podem agir sinergicamente hidrolisando β-glicanas (QUALHATO, 2012). Gruber e Seidl-Seiboth (2012), revela que β-1,3-glicanase é muito importante no processo de biocontrole, utilizando o mecanismo de micoparasita, pois os genes para essa enzima se torna altamente expresso quando há a sinalização de contato por presença de parede celular de fitopatógenos. Devido ao interesse industrial pelo potencial tecnológico do gênero Trichoderma, são necessários estudos para verificar o potencial de especificidade a partir da série de enzimas produzidas por esse gênero, em reagir de forma diferente e eficiente nos contatos com fitopatógenos distintos. Portanto, teve-se a

31 30 oportunidade de testar a produção enzimática do Trichoderma harzianum contra a parede celular dos fitopatógenos Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum, através da atividade específica. Sendo assim, este trabalho avaliou a secreção de enzimas de acordo com fitopatógenos em contato, o que permitiu aumentar o conhecimento e explanar de maneira mais eficaz o uso do Trichoderma como agente de biocontrole.

32 31 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar o perfil enzimático do isolado de Trichoderma harzianum na presença da parede celular dos fitopatógenos Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum. 3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO Avaliar a atividade específica das enzimas: fosfatase ácida, fosfatase alcalina, proteases, β-glicosidade, quitinase, β-1,3- glicanases, α- manosidade, N- acetilβ- D- glicosaminidase (Nagase) produzidas por Trichoderma harzianum na presença de Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum.

33 32 4. METODOLOGIA 4.1 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS Foi utilizada a cepa ALL 42 do isolado Trichoderma harzianum da coleção do gênero Trichoderma do Laboratório de Enzimologia (UFG/ICB) e dois fitopatógenos Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum (EMBRAPA ARROZ/FEIJÃO), que foram mantidos em repiques constantes em meio MYG (0,5 % de extrato de malte, 0,25 % de extrato de levedura, 1 % de glicose e 2 % de ágar) e mantidos sob refrigeração a 4 ºC. 4.2 CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO Uma suspensão na concentração de 1x10 7 esporos de Trichoderma harzianum foram inoculados em frascos de 1L contendo 250 ml de meio TLE (CaCl 2 0,1 g. L -1, KH 2 PO 4 7,0 g. L -1, K 2 HPO 4 2,0 g. L -1, (NH 4 ) 2 SO 4 0,1 g. L -1, MgSO 4.7H 2 O 0,1 g. L -1, bactopeptona g. L -1 e 0,1 ml de solução elementos traços). Cada meio continha 1 % de uma das paredes celulares de Fusarium oxysporum e parede celular de Sclerotinia sclerotiorum. Os frascos foram incubados em agitador rotatório à 28 ºC e velocidade de 160 rpm. Após 48 horas de incubação, os meios foram centrifugados a g, dialisados contra água e congelados a -80º C e utilizados para dosagens enzimáticas e dosagens de proteínas totais. 4.3 PURIFICAÇÃO DAS PAREDES CELULARES DOS FITOPATÓGENOS Quantidades de 10 a 20 discos de ágar (BDA) contendo micélio dos fitopatógenos foram inoculados separadamente em frascos de 1 L contendo 500 ml de meio MYG líquido (0,5% de extrato de malte; 0,25% de extrato de levedura e 1% de glicose). Estes frascos foram incubados à temperatura de 28ºC sob agitação constante de 160 rpm em agitador rotatório por 7 dias. Após este tempo o micélio de cada isolado foi coletado por filtração e utilizado na purificação de parede celular. A purificação consistiu em colocar os micélios em um cadinho e adicionar uma quantidade de nitrogênio líquido e macera-los com utilização de pistilo. Após maceração, os micélios foram tratados com uréia (8 M p/v). Em seguida os extratos

34 33 de parede celular foram centrifugados por 15 minutos sob rotação de rpm, o sobrenadante das preparações foi descartado, e os precipitados lavados com água destilada. Os precipitados obtidos após as lavagens anteriores foram homogeneizados com uma solução de hidróxido de amônio (1M v/v), centrifugados por 30 min a rpm, e os precipitados lavados com água destilada como descrito anteriormente. Os precipitados da última lavagem foram ressuspensos em ácido fórmico 0,5 (moles. L -1 ) e novamente centrifugados e lavados com água destilada como citado anteriormente. Na última lavagem o ph foi ajustado para ph 6,0 e os precipitados obtidos de Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium oxysporum liofilizados e utilizados como fonte indutora (MITCHELL E TAYLOR, 1969). 4.4 ENSAIOS ENZIMÁTICOS β-1,3-glicanase A atividade de - 1,3 glicanase foi determinada pela mistura de 50 L da amostra com 100 L de tampão acetato de sódio (50 mmol. L -1 ph 5.0) contendo 0,25 % de laminarina (Sigma). A mistura foi incubada a 40 ºC por 30 minutos. A concentração de açúcar redutor foi determinada por espectrofotometria a 550 nm pelo método de DNS (MILLER, 1959), utilizando glicose como padrão. Uma unidade de atividade enzimática (U) de β-1,3-glicanase foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1 mol de açúcar redutor por minuto de reação (1 μmol/min) usando glicose 2 mg. ml -1 como padrão Protease Para determinação de atividade proteolítica, foi utilizado o ensaio descrito por Cabral et al. (2004), no qual 20 μl de amostra foram incubados com 40 μl de tampão Tris-HCl 50 mm ph 5.0 e ph 7.0 e 40 μl de azocaseína 0,25% (p/v) à 37 C por 30 minutos em um termociclador. Foi adicionado 100 μl de ácido tricloroacético 10% (p/v) a reação e a mesma foi incubada a 4 C por 10 minutos. A reação foi centrifugada a g por 15 minutos e 100 μl foram transferidos para uma placa de ELISA seguida pela adição de 100 μl de NaOH 1 M. A absorbância foi

35 34 determinada à 450 nm em um leitor de microplacas. A absorbância obtida foi considerada a atividade enzimática Quitinase A atividade de quitinase foi determinada pela reação com quitina coloidal em tampão acetato de sódio (50 mmol. L -1 ph 5.5). Amostras de 500 L foram incubados com 500 L de quitina coloidal sob agitação por 12 horas a 37 ºC. A concentração de açúcar redutor foi determinada por espectrofotometria a 550 nm pelo método de DNS (MILLER, 1959), utilizando glicose como padrão. Uma unidade de atividade enzimática (U) de quitinase foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1 mol de açúcar redutor em um minuto de reação (1 μmol/min) usando glicose 2 mg. ml -1 como padrão Fosfatase ácida e alcalina Para determinação da atividade das fosfatases ácidas e alcalinas seguiram a metodologia de Evazi e Tabatabai (1977). Para fosfatase ácida, foram utilizados 100 μl de tampão acetato de sódio 50 mm ph 4.8 foram incubados com 40 μl de ρ- nitrofenil-fosfato 5 mm (ρnp-fosfato) e 10 μl de amostra à 37 C por 15 minutos em um termociclador. A reação foi parada com a adição de 100 μl de NaOH 0,1 M, 100 μl foram transferidos para uma placa de ELISA e a absorbância obtida à 405 nm em um leitor de microplacas. No caso da fosfatase alcalina o procedimento ocorreu de igual forma ao descrito acima, com exceção da adição de 100µL de tris-hcl 0,25 M para parar a reação. Uma unidade (U) de fosfatase ácida ou alcalina foi definida como a quantidade de enzima necessária para a produção de 1 μmol de ρ-nitrofenol por minuto N-acetil-B-D-glicosaminidase (NAGase) Para determinação da atividade de N-acetil-glicosaminidase, 100 μl de tampão acetato de sódio 50 mm ph 5.5 foram incubados com 40 μl de ρnp-nacetil-β-d-glicosamina 5 mm e 10 μl de amostra à 37 C por 15 minutos em um

36 35 termociclador. A reação foi parada com a adição de 100 μl de NaOH 0,1 M, 100 μl foram transferidos para uma placa de ELISA e a absorbância obtida à 405 nm em um leitor de microplacas. Uma unidade (U) de N-acetil-β-D-glicosaminidase foi definida como a quantidade de enzima necessária para a produção de 1 μmol de ρ- nitrofenol por minuto α-manosidase Para determinação da atividade de α-manosidase, 100 μl de tampão acetato de sódio 50 mm ph 5.5 foram incubados com 40 μl ρnp-α-d-manopiranosídeo 5 mm e 10 μl de amostra à 50 C por 15 minutos em um termociclador. A reação foi parada com a adição de 100 μl de NaOH 0,1 M, 100 μl foram transferidos para uma placa de ELISA e a absorbância medida à 405 nm em um leitor de microplacas. Uma unidade (U) de α-manosidase foi definida como a quantidade de enzima necessária para a produção de 1 μmol de ρ-nitrofenol por minuto α-arabinofuranosidase (ABF) Para determinação da atividade de α-arabinofuranosidase, 100 μl de tampão acetato de sódio 50 mm ph 4.8 foram incubados com 40 μl ρnp-α-larabinopiranosídeo 5 mm e 10 μl de amostra à 37 C por 15 minutos em um termociclador. A reação foi parada com a adição de 100 μl de NaOH 0,1 M, 100 Μl foram transferidos para uma placa de ELISA e a absorbância medida à 405 nm em um leitor de microplacas. Uma unidade (U) de α- arabinofuranosidase foi definida como a quantidade de enzima necessária para a produção de 1 μmol de ρ-nitrofenol por minuto β-glicosidase Para determinação da atividade de β-glicosidase, 100 μl de tampão acetato de sódio 50 mm ph 5.5 foram incubados com 40 μl ρnp- β-d-glicopiramosídeo 5 mm e 10 μl de amostra à 37 C por 15 minutos em um termociclador. A reação foi parada com a adição de 100 μl de NaOH 0,1 M, 100 μl foram transferidos para uma placa de ELISA e a absorbância medida à 405 nm em um leitor de microplacas. Uma

37 36 unidade (U) de β-glicosidase foi definida como a quantidade de enzima necessária para a produção de 1 μmol de ρ-nitrofenol por minuto Proteínas Totais A concentração de proteínas foi determinada pelo método descrito por Bradford (1976), utilizando albumina sérica bovina (BSA-Sigma) como padrão. A reação foi conduzida pela adição de 100 µl de amostra e 1000 µl do reagente de Bradford e incubado a temperatura ambiente por 15 minutos. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 595nm.